Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.
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Methodenartikel
Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die letzten Jahrzehnte haben die Explosion der wissenschaftlichen Interesse rund um die Genexpression Kontrollmechanismen auf RNA-Ebene erlebt. Dieser Zweig der Molekularbiologie wurde stark durch die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs als Hauptakteure im post-Transkriptionsregulation angeheizt. Solch eine revolutionäre Perspektive wurde begleitet und durch die Entwicklung von leistungsfähigen Technologien für die Profilierung von kurzen RNAs Ausdruck ausgelöst, sowohl auf der Hochdurchsatz-Ebene (genomweiten Identifikation) oder als Single-Kandidat Analyse (steady state Anreicherung von spezifischen Arten). Obwohl mehrere state-of-art-Strategien derzeit zur Dosierung oder zu visualisieren, wie Flucht-Moleküle vorhanden sind, bleibt Northern Blot-Test die zuschussfähigen Ansatz in der Molekularbiologie für die sofortige und genaue Auswertung der RNA-Expression. Es ist ein erster Schritt in Richtung der Anwendung von anspruchsvoller, kostenintensive Technologien und in vielen Fällen bleibt eine bevorzugte Methode, um einfach Einblickein RNA Biologie. Hier Übersicht wir ein effizientes Protokoll (erweitert Northern Blot) zum Erfassen schwach exprimierte microRNAs (oder andere kleine regulatorische RNA-Spezies) von Drosophila melanogaster ganze Embryonen, manuell zerlegt Larven / adulten Geweben oder in vitro kultivierten Zellen. Eine sehr begrenzte Menge an RNA erforderlich ist, und die Verwendung von Material aus der Durchflusszytometrie isoliert Zellen können auch in Betracht gezogen.
Einleitung
RNA Biochemie hat spektakuläre Fortschritte in den vergangenen Jahren erlebt 1. Unser Verständnis von RNA-Potenzial in der Steuerung der Genexpression durch die Identifizierung von nicht-kodierenden leistungsstarke Ribo-Regulatoren 2 gesprengt, durch die Entdeckung von neuartigen RNA-basierte Regulationsmechanismen 3,4 und durch eine tiefere Charakterisierung der bereits bekannten posttranskriptionale Veranstaltungen 5. Alle zusammen haben diese Studien erlaubt RNA Biologie drastisch machen die Szene, zu einem wichtigen Forschungsthema in der aktuellen Wissenschaftslandschaft. Insbesondere in den letzten Jahren sind wir imm....
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Protokoll
1. Probenentnahme
- Lösen halbhaft Schneider 2-Zellen (1-5 × 10 6 Zellen im Durchschnitt), und durch Pipettieren geerntet sie durch Zentrifugation (100 × g für 1 min). Im Falle von in vitro kultivierten adhärenten Zellen, trypsinize sie unter Standardbedingungen oder direkt sammeln sie von den Platten in eine geeignete Menge an RNA-Extraktionsreagenz, mit Hilfe eines Zellschabers.
- Für Embryo-Entnahme, wachsen Drosophila-Stämmen in Flugkäfigen und lassen Embryonen sammeln sich auf Legeplatten. Wischen Embryonen durch einen Pinsel in destilliertem Wasser (dH 2 O), entsorgen Trümmer durch Sieb-Filterung, spülen ....
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Ergebnisse
Durch Befolgen der im Text beschrieben und schematisch in Abbildung 1 dargestellt Gesamtverfahren, untersuchten wir die Expression von RNAs kleine RNA-Komplex Proben unterschiedlicher Herkunft. In dem Experiment in Abbildung 1 dargestellt, wurde RNA aus Drosophila Schneider 2-Zellen durch Proteinase K-Extraktion, Integrität überprüft isoliert (optionaler Schritt: Denaturierung Agarose-Gel-Fraktionierung) und im Doppel geladen. Eine Hälfte des Gels wurde auf eine neutrale Membra.......
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Diskussion
Obwohl unsere Wertschätzung der Feingeist, durch die Verflechtung RNA reguliert die Neurogenese steigt kontinuierlich, die mechanistische Auswirkungen der RNA-basierten Schaltungen beeinflussen neuronalen Stammzellbiologie, die neuronale Differenzierung / Funktionsintegration, Entwicklung von neuronalen Erkrankungen und Krebserkrankungen bleiben unerforscht. Die Pflege solcher Netzwerke durch Reiche macht das Potenzial der genetischen Systemen wie Drosophila melanogaster Instrumental in unerforschte zelluläre S.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale unterstützt, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Université de Strasbourg, das Hôpital de Strasbourg, der Verband pour la Recherche sur le Cancer, dem Institut National du Cancer, der Agence Nationale de la Recherche und dem Elsass.
Pietro Laneve wurde von der Fondation la Recherche Médicale unterstützt gießen. Derzeit ist er ein Empfänger einer Istituto Italiano Tecnologia (IIT) Gemeinschaft. Publikationskosten werden von der Neurex Netzwerk unterstützt (TriNeuron - Programm Interreg IV Oberrhein)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ENDGÜLTIGE ZUSAMMENSETZUNG/NAME | FIRMENKATALOG | (Lager) | KOMMENTARE |
| ALLGEMEINE ANFORDERUNG | |||
| Zentrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
| Dekontaminationsmittel, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Auf Glas/Kunststoff auftragen, abwischen und spülen |
| RNase Inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Gefährlich //// 1609-47-8 |
| PROBENVORBEREITUNG | |||
| Stereomikroskop, M60 | Leica | ||
| 1X PBS Puffer | |||
| 137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
| 1,8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
| RNA-EXTRAKTION/-ANALYSE | |||
| UV-Vis-Spektralphotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
| Horizontales Elektrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
| RNA-Extraktionsreagenz, TRIzol Reagenz | Life Technologies | 15596026 | Gefährlich |
| PCA (25:24:1), 1:1 für Extraktion | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
| Chlorophorm, 1:1 für Extraktion | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
| EtOH, 2,5 Vol. für Fällung, 70% für Waschen | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
| Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Stop Mix | |||
| 300 mM NaOAc, pH 5,5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
| 1x RSB Lösung | |||
| 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | SDS niemals abkühlen lassen, um Ausfällung zu vermeiden //// 151-21-3 |
| 2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
| 10X Retikulozyten-Standardpuffer (RSB) | |||
| 100 mM Tris-Cl, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
| 100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
| Denaturierendes Agarose-Gel | |||
| 1,2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Lassen Sie das Gel mindestens 1 Std. erstarren //// 9012-36-2 |
| 10X MOPS-Puffer | |||
| 0,2 M MOPS-Natriumsalz, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | MOPS-Natriumsalz nicht verwechseln mit MOPS //// 71119-22-7 |
| Agarose-Ladefarbstoff | |||
| 1x MOPS-Puffer | |||
| 3% Formaldehyd | Sigma-Aldrich | F8775 | Gefährlich //// 50-00-0 |
| 50% Formamid | Sigma-Aldrich | 47670 | Gefährlich //// 75-12-7 |
| Ethidiumbromid (EtBr) 30 μ g/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Gefährlich //// 1239-45-8 |
| Bromphenolblau | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
| KLEINE RNA-FRAKTIONIERUNG | |||
| Tipps zum Laden von flachem Gel | Life Technologies | LC1002 | |
| Savant SpeedVac Konzentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
| Vertikale Elektrophorese, Mini-PROTEISCHE Tetrazelle | Biorad | 165-8000 | |
| Denaturierendes Acrylamid-Gel | |||
| 10% Acrylamid/Bis-Acrylamid (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Gefährlich. Lassen Sie das Gel vor Gebrauch 45 min polymerisieren 1x |
| FSME-Puffer (oder 1x MOPS-Puffer) | |||
| 7 M Harnstoff | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
| 0,1% Ammoniumpersulfat | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
| 0,1 % TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
| Genruler DNA-Leiter mit ultraniedriger Reichweite (10 bp-Schritte) | Thermo Scientific | SM1211 | Markierung 0,1 μm g, wie in der "Sondenmarkierung"-Reaktion |
| Acrylamidblauer Farbstoff beschrieben | |||
| 50% Formamid | Sigma-Aldrich | 47670 | Gefährlich //// 75-12-7 |
| Bromphenolblau | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
| Laufender Puffer (RB) | |||
| 1x MOPS-Puffer | |||
| Alternative RB: 1x TBE Puffer | |||
| 1x TBE Puffer | |||
| 5x TBE | |||
| 445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 445 mM Borsäure | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
| 20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Gel-Färbelösung | |||
| Ethidiumbromid 0,5 μ g/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Gefährlich //// 1239-45-8 |
| 1x RB | Fleck für 15 min mit EtBr, entfärben für 15 min ohne EtBr | ||
| BLOTTING | |||
| 3MM Whatman Papier | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
| Neutrale Nylonmembran, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
| CROSSLINKING | |||
| Vernetzungslösung (XLS) | |||
| 1% 1-Methylimidazol (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Bereiten Sie immer ein frisches Aliquot von XLS vor //// 616-47-7 |
| 12,5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Gefährlich //// 7647-01-0 |
| 3,1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
| (PRE)-HYBRIDISIERUNG | |||
| Flüssigszintillationszähler | Beckmann | LS 6500 | |
| Geschorenes Lachssperma, 0,1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
| rasi4 Anti-Sense-Sonde | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA | ||
| Anti-Sense-Sonde | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279 | ||
| Anti-Sense-Sonde | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286 | ||
| Anti-Sense-Sonde | 5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Aufreinigungskit | ||
| , Illustra MicroSpin G-25 Säulen | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
| (Pre)-Hybridisierungslösung (HS)0,5 | |||
| % SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
| 5x Denhardt's Lösung | |||
| 20X SSPE | |||
| 3,6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 0,2 M Natriumphosphat | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
| 20 mM EDTA (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| 50x Denhardt-Lösung | |||
| 1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
| 1% Polyvinylpyrrolidon | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
| 1X TEN Puffer | |||
| 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 1 mM EDTA (pH 8,0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Sonden-Beschriftung | |||
| 0,4 μm; M Oligonukleotid | |||
| 1,5 μm; l Ci/μ l [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Gefährlich //// 51963-61-2 |
| 1x T4 Polynukleotidkinase Puffer | Biolabs | B0201 | |
| T4 Polynukleotidkinase 0,5 Einheiten/μ l | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
| WASHING | |||
| Geiger Müller Detektoren | Canberra Industries | MCB2/CPS – | |
| Waschpuffer (WB), 2x SSPE | |||
| Stringent Waschpuffer | |||
| 0,2x SSPE | |||
| 2x SSPE, 0,5% SDS | |||
| 0,2x SSPE, 0,5% SDS | |||
| SIGNAL DETECTION | |||
| PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
| Bild J | Frei verfügbar | ||
| Menge One | Biorad | ||
| Röntgenfilme , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Lichtempfindlicher |
| Entwickler für Röntgenfilme | Sigma-Aldrich | P7042 | |
| Fixierer für Röntgenfilme | Sigma-Aldrich | P7167< | |
| Stripping-Lösung | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8,8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| 0,1 % SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | SDS nach dem Kochen zugeben, um Schaumbildung zu vermeiden //// 151-21-3 |
Referenzen
- The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
- Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
- Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
