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Methodenartikel

Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

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DOI:

10.3791/51829

⸱

21. September 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Neurochemie des Gehirns von Säugetieren ist bei vielen neurologischen und systemischen Erkrankungen verändert. Charakteristische Profile von zerebralen Metaboliten können effizient auf der Grundlage von Rohextrakten aus Hirngewebe erhalten werden. Zu diesem Zweck wird die hochauflösende NMR-Spektroskopie eingesetzt, die eine detaillierte quantitative Analyse der Metabolitenkonzentrationen ermöglicht (Metabolomik).

Zusammenfassung

Studien zur Genexpression auf RNA- und Proteinebene werden seit langem verwendet, um biologische Prozesse zu erforschen, die Krankheiten zugrunde liegen. In jüngerer Zeit wurden Genomik und Proteomik durch eine umfassende quantitative Analyse des in biologischen Systemen vorhandenen Metabolitenpools ergänzt. Diese Strategie, die als Metabolomik bezeichnet wird, zielt darauf ab, eine globale Charakterisierung des am Stoffwechsel beteiligten niedermolekularen Komplements zu ermöglichen. Während das Genom und das Proteom die Aufgaben definieren, die Zellen ausführen können, ist das Metabolom Teil des eigentlichen Phänotyps. Unter den derzeit in der Metabolomik verwendeten Methoden sind spektroskopische Techniken von besonderem Interesse, da sie es ermöglichen, eine große Anzahl von Metaboliten gleichzeitig zu analysieren, ohne zuvor auf spezifische biochemische Signalwege zu selektieren, was einen breiten, unvoreingenommenen Ansatz ermöglicht. Hier wird ein optimiertes experimentelles Protokoll für die metabolomische Analyse mittels hochauflösender NMR-Spektroskopie vorgestellt, welches die Methode der Wahl für die effiziente Quantifizierung von Gewebemetaboliten ist. Wichtige Stärken dieser Methode sind (i) die Verwendung von Rohextrakten, ohne dass die Probe gereinigt und/oder Metaboliten getrennt werden müssen; ii) der intrinsische quantitative Charakter der NMR, der die Quantifizierung aller Metaboliten ermöglicht, die durch ein NMR-Spektrum mit nur einer Referenzverbindung repräsentiert werden; und (iii) die zerstörungsfreie Natur der NMR, die die wiederholte Verwendung derselben Probe für mehrere Messungen ermöglicht. Der dynamische Bereich der Metabolitenkonzentrationen, der abgedeckt werden kann, ist aufgrund der linearen Reaktion von NMR-Signalen beträchtlich, obwohl Metaboliten, die in extrem niedrigen Konzentrationen auftreten, schwer zu erkennen sein können. Für die am wenigsten vorkommenden Verbindungen kann die hochempfindliche Massenspektrometrie-Methode von Vorteil sein, obwohl diese Technik kompliziertere Probenvorbereitungs- und Quantifizierungsverfahren erfordert als die NMR-Spektroskopie. Wir stellen hier ein NMR-Protokoll vor, das an die Analyse des Gehirns von Ratten angepasst ist; Das gleiche Protokoll kann jedoch mit geringfügigen Modifikationen auf andere Gewebe angewendet werden.

Einleitung

Mausmodelle sind weitgehend in der Hirnforschung 1 verwendet worden. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in Maus-und Rattenhirne durch das Studium der Genexpression auf RNA-und / oder Protein-Ebene auf der einen Seite auf die andere 2-6 untersucht und morphologischen, funktionellen, elektrophysiologischen und / oder Verhaltens Phänotypen. Um jedoch die Mechanismen der Verknüpfung von Genotyp-Phänotyp zu vollständig zu verstehen, ist es unerlässlich, die molekularen Ereignisse hinter der Protein-Expression, dh zu untersuchen. der Stoffwechsel der biochemischen Substrate, auf denen Enzyme wirken 7. Diese Anforderung führte in den vergangenen 10 bis 15 Jahren, zu einer Renaissance der Stoffwechselforschung in vielen Bereichen der Biologie 8,9. Während klassische Stoffwechselstudien haben oft auf Details der besonderen Fachrichtungen ausgerichtet ist, wird die neue Metabolomics Ansatz einer umfassenden Untersuchung der globalen Stoffwechselprofil des Gewebes unter Berücksichtigung ausgerichtet.Eine Folge dieses Konzepts besteht ein offensichtlicher Bedarf für analytische Werkzeuge, die Ausrichtung auf bestimmte Stoffwechselwege und / oder Klassen von Verbindungen zu minimieren. Jedoch ist eine klassische biochemische Assays auf eine bestimmte chemische Reaktion eines spezifischen Analyten festgelegt werden, bevor der Test durchgeführt wird, die Bedürfnissen. Im Gegensatz dazu werden spektroskopische Techniken, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) (i) zu bestimmten molekularen (physikalischen) Eigenschaften von biochemischen Verbindungen, bezogen von denen jede zu einem oder mehreren verschiedenen Signale in einem Frequenz im Verlauf eines Experiments erfasst; und (ii) erkennen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verbindungen pro Experiment.

So enthält jedes Spektrum die kombinierten Informationen über eine ganze Reihe von Stoffwechselprodukten. Aus diesem Grund, spektroskopische Verfahren sind geeignete Werkzeuge für metabolomics, da keine vorherige Selektion muss gemacht bezüglich der Art des Analyten zu messenden 8 . Als Folge sind diese Techniken natürlich eignen sich für Vorstudien, weil sie den Nachweis von unerwarteten Stoffwechseländerungen erheblich erleichtern.

Obwohl NMR und MS austauschbar für die Analyse von vielen Metaboliten verwendet werden, besitzt jedes Verfahren spezifische Vor-und Nachteile, die vor kurzem wurden bewertet 10. Kurz gesagt, können NMR-Spektroskopie üblicherweise aus Rohextrakten durchgeführt werden und erfordert keine chromatographische Trennung der Probenverbindungen vor der Analyse erfordert. Im Gegensatz dazu arbeitet MS mit Gas oder Flüssigkeits-Chromatographie (GC oder LC) Trennung, mit Ausnahme insbesondere die jüngsten Entwicklungen wie der Massenspektrometrie Bildgebung. In einigen speziellen Fällen, wie die Analyse von Zucker, kann LC-Trennung eine Notwendigkeit für die NMR-Spektroskopie als auch geworden, weil die Resonanzlinien aus verschiedenen Zuckerarten überschneiden sich in den Proton (1 H)-NMR-Spektren. Dennoch, 1 H-NMR-Spektroskopie ohne chromatographic Trennung bleibt die beliebteste, fast allgemein angewandte metabolomische NMR-Methode. Im Allgemeinen ist die Probenvorbereitung zeitaufwendig und komplex für MS, als es für NMR-Spektroskopie. Schwerwiegende Probleme auf Matrixeffekte sind viel in der NMR-Spektroskopie weniger verbreitet als in MS, wo sie deutlich gedämpften Signale führen. Metabolit Quantifizierung kann mit beiden Methoden erreicht werden. Jedoch werden mehrere Standardverbindungen für MS aufgrund von Variationen in Matrixeffekte und Ionisation Wirkungsgrade zwischen Metaboliten benötigt. Im Gegensatz dazu wird nur eine Standard pro Probe für ein NMR-spektroskopischen Analyse, weil unter geeigneten Messbedingungen erforderlich ist, ist das letztere Verfahren eigen quantitative dank der streng linearen NMR-Antwort von den Kernen beobachtet. Ein Hauptnachteil der NMR ist seine relativ geringe Empfindlichkeit. MS, insbesondere LC-MS, ist empfindlicher als NMR um mehrere Größenordnungen; Aus diesem Grund ist MS über NMR für das vorzuziehenAnalyse der Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Andererseits ist die zerstörungsfreie Art der NMR-Experiment wird ein klarer Vorteil gegenüber MS; auf diese Weise NMR wiederholt an der gleichen Probe, beispielsweise für unterschiedliche NMR-aktiven Kernen, wie 1 H, 31-Phosphor (31 P), Kohlenstoff-13 (13 C), durchgeführt werden kann, Fluor-19 (F 19), etc., da kein Material durch NMR verbraucht im Gegensatz zu MS-Messungen.

Sowohl NMR-und MS kann in verschiedenen Modi verwendet werden, wobei jeder eine optimal für den Nachweis von Verbindungen mit bestimmten chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ist 31 P NMR oft besser als 1 H-NMR für die Analyse der mäßig konzentrierten phosphorylierten Verbindungen, obwohl fast alle phosphorylierten Metaboliten Protonen enthalten. Jedoch kann ihre 1 H-NMR-Signale durch 1 H-NMR-Signale von anderen, nicht-phosphorylierten Verbindungen verdeckt werden, während die letzterenoffensichtlich nicht dazu führen, Hintergrundsignale in 31 P-NMR-Spektren. In einer analogen Situation ist 19 F-NMR-Analyse für fluorierte Verbindungen, beispielsweise fluorierte Medikamente (keine Hintergrundsignale von endogenen Metaboliten) bevorzugt werden, während der Spezialfall von 13 C-NMR von Interesse fast ausschließlich wenn das Schicksal von 13 C markierten exogenen metabolischen Vorstufen muss beachtet werden, aufgrund der extrem niedrigen natürlichen Häufigkeit des Isotops 13 C (ca. 1%). Viele Massenspektrometer arbeiten entweder in Negativ-Ionen-Modus oder positiven Ionenmodus. Daher ist es wichtig, vor der Analyse, ob die Ionen beobachtet werden negativ oder positiv geladen sein kennen. Wir konzentrieren uns hier auf ein Protokoll für die Analyse von Hirngewebe Metabolom durch 1 H-und 31 P-NMR-Spektroskopie, da dieses Verfahren ergibt sich eine große Anzahl von wichtigen Metaboliten-Konzentrationen bei niedrigen Kosten in Form von (i) der Zeit für die Probenvorbereitung eine benötigtend (ii) Aufwand für Metabolit Quantifizierung erforderlich. Alle Experimente können unter Verwendung der Ausrüstung eines Standard-Nasschemielabor und einen hochauflösenden NMR-Spektroskopie-Anlage werden. Weitere Anforderungen sind in dem Protokoll weiter unten beschrieben.

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Protokoll

HINWEIS: Tierethik RECHNUNG
Tierexperimentelle Studien an Ratten folgten die Leitlinien in Frankreich gültig ist, und wurden von der lokalen Ethikkommission (# 40.04, Universität Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankreich) genehmigt.

1. Ernte und Einfrieren Rattenhirn

  1. Vorbereitung erforderlich: flüssiger Stickstoff (N 2liq.) In Dewar, die groß genug, um ein Einfrieren Klemme (mindestens 2-3 l Volumen) zu halten, ist; Narkose (zB Isofluran oder Ketamin / Xylazin); Anästhesie Kammer; sterilen Sektions Werkzeuge: chirurgische Schere, Skalpell, Pinzette; Erfrischungstüchern und Flasche mit Reinigungsalkohol (Ethanol); Nadeln (25 g); 1 ml und 10 ml Spritzen. Label Aluminiumplatten (ca. 10 x 10 cm) mit Klebeband. Verwenden Sie Blätter, einzelne gefriereingespannten Rattenhirnen zu wickeln.
    HINWEIS: Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und Augenschutz Schutzbrille oder Maske beim Umgang mit flüssigem Stickstoff!
  2. Füllen Dewar mit N 2liq. Und legen freizing Klemme in einem Dewar. Sicherstellen, dass die Menge an N in dem Dewar 2liq reicht für wiederholte Einfrier-Klemmverfahren (einige Liter, die Menge an N 2liq Verdampfen während jedes Gefrierspann hängt von der Größe der Klammer).
  3. Betäuben Tier (zB durch Isofluran oder durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin-Mischung). Gehen Sie zur Sterbehilfe durch Herzpunktion, um Blutungen zu verhindern, wenn die Kopfhaut wird entfernt und Schädel geöffnet wird. Schritte 1,4-1,7 unten beschreiben dieses Standardverfahren.
    Hinweis: in speziellen Protokolle erfordern maximale Erhaltung von Glukose und Hochenergie-Metaboliten, Opfer Ratte von trichter Einfrieren des Gehirns des narkotisierten Tier mit N 2liq 11 nach dem Zurückziehen der Kopfhaut. Dann sezieren Gehirn aus dem Schädel unter intermittierender N 2liq auf Post-mortem-Stoffwechsel 12 zu minimieren.
  4. Befeuchten Leiter der Ratte mit Reinigungsalkohol. Verwenden chirurgische Schere, um (i) remove Kopfhaut, und (ii) offenen Schädel entlang Schädelnähte.
  5. Verwenden einer Pinzette, um weitere Schädel zu öffnen und ganze Gehirn von der Unterseite des offenen Schädel zu entfernen, die Positionierung der Kopf auf den Kopf. Schnell zu entfernen, keine sichtbaren Spuren von Blut mit Erfrischungstüchern. Wenn Hemisphären metabolisch und morphologisch symmetrisch, ist es zweckmäßig, eine der Halbkugeln für metabolische Analyse nach der Trennung von der anderen Halbkugel durch Schnitt mit dem Skalpell. Falls erforderlich, verwenden Sie die restlichen Hemisphäre für andere Hirnstudien wie Histologie.
  6. Schnell zu entfernen, das Einfrieren von Klemme N 2liq -gefüllten Dewar, legen ganze oder halbe Rattenhirn auf einer Innenfläche, Klemme und sofort einfügen Einfrieren Klemme in N 2liq -gefüllten Dewar während Halteklammer fest zusammengedrückt. Stellen Sie sicher, dass die Schritte 1.3-1.6 nehmen nicht länger als 60 Sekunden.
  7. Nach 1-2 min entfernen Einfrieren Klemme aus dem Dewar, offene Klemme lösen gefrorenen Hirngewebe von Klemme, und Wrapgefrorene Gewebe in entsprechend gekennzeichneten Aluminiumblech (siehe 1.1 oben). Stellen Sie sicher, dass das Etikett lesbar ist und bleibt fest an seinem Platz, nachdem die Probe gewickelt. Stellen schnell verpackte Probe in N 2liq. Führen die gesamte Verfahren so schnell wie möglich zu dem Auftauen von gefrorenen Gehirngewebe zu vermeiden.
  8. Speichern gefrorene Probe in N 2liq oder in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis Metabolit Extraktion.
    HINWEIS: Wenn eine biologische Probe, die auf mehr als ein Jahr gelagert werden, ist Lagerung bei N 2liq Temperatur auf über 80 ° C bevorzugt werden. Dies gilt auch für den Rest dieses Protokolls.

2. Vorbereitung des Metaboliten Extraktionsverfahren

  1. Vorbereitung Gewebehomogenisator und Anpassungsteströhrchen (beispielsweise 10 mm Innendurchmesser, je nach dem Durchmesser der Welle Homogenisator, üblicherweise aus Kunststoff). Verwenden Sie elektrische Homogenisatoren nicht manuell angetrieben Homogenisatoren (Gewebemühlen). Prepare Vortexer und Laborwaage.
  2. Bereiten Eimer mit zerstoßenem Eis gefüllt. Halten Sie ausreichend quantitites Methanol, Chloroform und Wasser auf Eis (4 ml pro Tier 250-350 mg gefrorenem Hirngewebe).
  3. Bereiten Pipetten und Fläschchen.
    1. Bereiten Glasfläschchen (≥20 ml Volumen) mit Schraubverschluss und auf Eis (eine Flasche pro Gewebeextrakt). Fit Schraubkappen mit einem Teflon-Septen resistent gegen Chloroform.
    2. Bereiten 5 ml Plastikpipetten zur Abgabe von Methanol und Wasser und Glaspipetten oder Hamilton-Spritzen zur Abgabe Chloroform. Bereiten Sie zusätzliche Kunststoffpipetten (5 oder 10 ml Volumen) für die Übertragung von Mischungen von Gewebehomogenat und Methanol.
    3. Stellen Sie sicher, alle Glaswaren gründlich mit destilliertem Wasser gespült und vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet, um Spuren von Verunreinigungen, insbesondere NMR detektierbaren Formiat und Acetat zu entfernen.
  4. Füllen Porzellanmörser mit N 2liq, Ort Porzellan Stößel im Mörser und füllen mit N 2liq. Stickstoff verdampft, bis die Temperatur von Mörser und Stößel ausreichend niedrig ist. Halten Sie kleine Menge von N 2liq in Mörtel.

3. Extraktion von Metaboliten

  1. Entfernen gefrorenen Gehirngewebeprobe aus dem Speicher (N 2liq Tank oder -80 ° C Tiefkühler). Dann sofort Gewebeprobe zu übertragen, um die teilweise mit N 2liq gefüllte Mörtel.
  2. Verwenden Sie die N 2liq -Kalte Stößel, um den gefrorenen Hirngewebe in kleinere Stücke, die leicht in die Teströhrchen für Gewebehomogenisierung verwendet passen zu brechen. Um Stücke von gefrorenem Gewebe aus, die aus der Mörtel in den Prozess projiziert zu verhindern, brechen die Gewebe, während sie noch in Aluminiumfolie umhüllt. Gefrorenen Gewebe mahlen nicht zu Pulver, da dies Übertragung in das Teströhrchen erschweren (erhöhtes Risiko von Kondenswasserbildung) zu machen. WICHTIG: Während der gesamten Prozedur, fügen N 2liq wie notwendig, um die Probe tiefgefroren zu halten, um Mörtel.
  3. Mix sMall Stücke von gefrorenem Hirngewebe gründlich, wiegen 250-350 mg und in ein Reagenzglas mit eiskaltem Methanol (4 ml für 250-350 mg Hirngewebe) gefüllt. Jedes Mal, wenn Stücke von gefrorenem Gewebe hinzu, homogenisieren diese sofort mit dem Gewebe-Homogenisator.
    HINWEIS: Füllen Sie dieses gesamte Verfahren schnell auf die Probe, die zu einer Überschätzung der Probengewicht führen würde, und (ii) Heizung und Auftauen der Probe zu vermeiden (i) erhebliche Kondensation von Wasser. Einzelnen Gewebestücke sollten in gefrorenem Zustand bei Beginn der Homogenisierung werden.
  4. Nachdem das letzte Stück des gefrorenen Rattenhirn Probe in das Teströhrchen und homogenisiert wurde hinzugefügt, übertragen Sie die Homogenat zu einem ≥20 ml Volumen Glasfläschchen, in der Nähe Schraubverschluss und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min. Wenn das Volumen des Teströhrchens ist nicht ausreichend groß für ≥4 ml Methanol, mit einem kleineren Volumen Methanol, um einen Teil des gefrorenen Gehirngewebe homogenisiert, die Masse in derGlasfläschchen und weiter Homogenisieren der Restgewebestücke mit frischem Methanol. Stellen Sie sicher, dass der Gesamt Methanol Volumen 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe.
  5. Das gleiche Volumen eiskaltem Chloroform (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min.
    HINWEIS: Verwenden Sie stets belüftet chemischen Abzugshaube beim Umgang mit flüchtigen Lösungsmitteln, insbesondere Chloroform!
  6. Das gleiche Volumen an Wasser (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und stehen lassen bei -20 ° C über Nacht.

4. Vorbereitung der Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung

  1. Bereiten kalten Zentrifuge (4 ° C, 13.000 g bei maximaler Radius) und Zentrifugenröhrchen. Sicherzustellen, dass die letzteren ≥20 ml Volumen, beständig gegen Chloroform und Fliehkräfte von 13.000 x g zu widerstehen. Verwenden Sie spezielle Glaszentrifugenröhrchen, sondern spülen (wie alle Glaswaren) mit destilliertem WasserVordergrund Verwendung (siehe 2.3).
  2. Bereiten Sie gründlich gespült Glas Pasteur Pipetten und eine entsprechende propipettor (Birne, manuellen Pipette Pumpe, automatischen Pipette Hilfe / Pipette, etc.).
  3. Vorbereitung weiterer zwei gründlich gespült Rohre (≥15 ml Volumen) pro Hirnprobe, die man braucht, beständig gegen Chloroform (aus Glas oder Teflon) sein, die andere zu Methanol (aus Kunststoff resistent gegen Methanol oder Glas).
  4. Bereiten Lösungsmittelverdampfung Gerät (im Handel erhältlich oder Eigenbau). Damit diese Vorrichtung eine fein gesteuert Strom aus trockenem Stickstoffgas, das auf der Oberfläche einer Extraktlösung, die flüchtige Lösungsmittel (Methanol, Chloroform) gerichtet ist.
  5. Bereiten Sie zwei zusätzliche Fächer oder Eimer mit Eis gefüllt: eine für den Probentransport auf Eis, und ein weiteres zur Aufbewahrung von Proben Kälte während des Verdampfungsprozesses.
  6. Vorbereitung Lyophilisator (Gefriertrockner) und Materialien für die Lyophilisation notwendig: (i) eine 50ml-Zentrifugenröhrchen oder Vakuum-Rundkolben pro Extrakt, und (ii) N 2liq um die wässrige Phase der Proben (≤0.3 L pro Probe) einzufrieren. Wenn Zentrifugenröhrchen verwendet wird, auch Weithalsflasche Vakuumfilter geeignet für Gefriertrocknungsanlage vorzubereiten.

5. Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung

  1. Für eine vollständige Phasentrennung, übertragen Sie die Methanol / Chloroform / Wasser / Hirn Gewebehomogenat (siehe 3.6) zu einer Chloroform-resistente Zentrifugenröhrchen (≥20 ml Volumen) und Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 40 min.
    HINWEIS: Zwei Phasen zu bilden, von einer Schicht ausgefällte Protein abgetrennt. Die untere (schwerere) Phase aus Methanol, Chloroform und gelösten Lipide, während die obere (leichtere) Phase aus Wasser, Methanol und gelöste wasserlöslichen Metaboliten.
  2. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die obere Phase mit einem geeigneten ≥15-ml-Tube (Kunststoff resistent gegen Methanol, oder Glas) zu übertragen. Keep on ice.
  3. Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette, um die untere Phase zu einer entsprechenden ≥15-ml-Tube (Glas oder Teflon) zu übertragen. Halten Sie auf dem Eis.
  4. Speichern der Schicht des ausgefällten Proteins bei -80 ° C, wenn es für die Bestimmung des Gesamtproteins zu verwenden ist; oder aber verwerfen.
  5. Halten des Rohres mit der Wasser / Methanol-Phase (siehe 5.2) auf Eis und Methanol zu verdampfen, indem man einen trockenen Stickstoffstrom auf die Oberfläche der Extraktionslösung. Alternativ sanft Blase Stickstoff durch die Extraktlösung. Beenden Sie den Verdampfungsprozess, wenn Einleiten von Stickstoff führt nicht mehr Volumenreduktion in der Extraktionslösung. Zu dieser Zeit, fahren Sie mit der Gefriertrocknung (siehe 5.7), oder einfrieren und halten Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie zur Gefriertrocknung.
  6. Das Röhrchen mit dem Methanol / Chloroform-Phase (siehe 5.3) auf Eis und verdampfen Methanol durch Lenken eines trockenen Stickstoffstrom auf die sun-Schnittstelle der Extraktlösung. Wenn alle Lösungsmittel verdampft, den Prozess zu beenden und halten Sie die Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie für die NMR-Analyse.
  7. Bereiten wässrigen Phase für Gefriertrocknung
    1. Nach dem Ende der Methanolverdampfungsprozess (siehe 5.5), übertragen Sie die Probe auf eine gründlich gespült 50 ml Zentrifugenröhrchen (wenn die Probe eingefroren ist, Tauwetter vor der Übertragung). Alternativ Transfer zu einem Vakuum-Rundkolben.
    2. Gefriertextraktlösung durch Drehen Zentrifugenröhrchen (oder Rundkolben) teilweise in N 2liq eingesetzt, daß die innere Oberfläche des Rohrs oder der Kolben wird nach und nach durch gefrorene Flüssigkeit bedeckt. Sicherzustellen, dass keine N 2liq. Kann die Aufnahme geben.
    3. Wenn die gesamte Flüssigkeit gefroren ist, decken Sie die Röhre mit einem Deckel oder punktiert Schraubverschluss, damit der Dampf entweichen, und legen Sie den Schlauch in einer Weithalsflasche Vakuumfilter.
    4. Starten Sie nach der Gefriertrocknung attaching der Kolben oder einer Flasche auf den Gefriertrockner.
  8. Beenden Sie den Gefriertrocknungsprozess, wenn die Probe vollständig trocken ist. Halten der Probe bei -80 ° C in einem geschlossenen Rohr (mit einem dichten Deckel!), Bis für die NMR-Analyse verwendet.
    HINWEIS: In der Regel nicht mehr als 24 Stunden sind für die Gefriertrocknung benötigt. Mehrere Proben können gleichzeitig lyophilisiert werden, abhängig von der Konstruktion der Lyophilisator und ob Zentrifugenröhrchen in Weithalsflaschen oder Rundkolben verwendet.

6. Herstellung von NMR-Proben

  1. Speicher getrocknet und lyophilisiert Extrakte bei sehr niedriger Temperatur (≤ -80 ° C). Wieder aufzulösen Lyophilisate für die Vorbereitung der NMR-Proben unmittelbar vor NMR-Experiment.
    HINWEIS: Lagerung von Proben in Lösung und / oder nahe der Raumtemperatur kann im Probenabbau führen!
  2. Vorbereitung einer wässrigen 200 mM Lösung des Chelatbildners, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), wie folgt:
    1. Fügen Sie reines Wasser (zB 20 ml) in ein Reagenzglas oder Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie die Menge an Pulver CDTA notwendig, eine 200 mM Lösung zu generieren.
      HINWEIS: Ein wesentlicher Teil der CDTA nicht löslich sein, da der pH-Wert ist sehr gering, da die Säureform CDTA wurde anstelle eines CDTA Salz verwendet.
    2. Vorsichtig, Schritt für Schritt, immer größere Mengen von CsOH Pulver auf die CDTA Lösung und Wirbel nach jeder Zugabe gründlich.
      HINWEIS: Die lösliche Fraktion CDTA mit zunehmender CsOH Gehalt in der wässrigen Lösung zu erhöhen. Vermeiden Sie "Übertitration", dh weniger hinzuzufügen als die stöchiometrische Menge CsOH auf die CDTA Lösung.
    3. Wenn nahezu alle CDTA Pulver aufgelöst ist, beginnen die Messung von pH nach jeder CsOH hinaus und gründliche Verwirbelung. Beenden CsOH hinaus, wenn der endgültige pH-Wert erreicht wird (Tabelle 1).
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden alle CDTA gelöst werden. Die Verwendung von Cs + als Gegenion CDTA ist generüber Na + oder K + Verbündeten bevorzugt. Cs + ist eine weiche Lewis-Säure aufgrund ihrer großen Ionenradius, im Gegensatz zu Na + und K +, die kleineren Ionenradien aufweisen und starke Säuren. Folglich Cs + Komplexe mit Phosphaten (harte Basen) weniger leicht als dies Na + und K +. Dies ist für die 31 P-NMR-Spektroskopie von phosphorylierten Metaboliten von Vorteil, weil Komplex neigt dazu, NMR-Linienbreiten insbesondere unter den Bedingungen der langsame Zwischenionenaustausch zu erhöhen.
  3. 31 P-NMR-Analyse von Phospholipiden (PL), lösen getrockneten Lipide (siehe 5.6) in 700 ul eines Lösungsmittelgemisches aus deuteriertem Chloroform (CDCl 3), Methanol und CDTA-Lösung, hergestellt wie in 6.2 beschrieben (5: 4: 1 Volumenverhältnis). Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Direkt Verschiebung (oder Verdrängungs) Mikropipette mit Chloroform-widerant-Tipps in beiden Schritten.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Änderung einer der folgenden Parameter wird das Aussehen (chemische Verschiebung und Linienbreiten) von PL 31 P-NMR-Spektren 13-17 auswirken:
    (I) Volumenverhältnis CDCI3: MeOH: CDTA Lösung
    (Ii) Gesamtlösungsmittelvolumen verwendet
    (Iii) pH-Wert der wässrigen Komponente des Lösungs
    (Iv) CDTA Konzentration der wässrigen Komponente des Lösungsmittels.
    HINWEIS: In der Regel die Feinabstimmung dieser Sample-Parameter (Tabelle 1) ist nicht notwendig und sollte mit äußerster Vorsicht, wenn in besonderen Fällen gewünscht durchgeführt werden. Ändern des Volumenverhältnis zwischen Lösemittel leicht zu der Bildung eines Systems, bestehend aus zwei Phasen statt einer homogenen Phase! Die Ein-Phasen-System wurde gefunden, daß praktischer als die Zwei-Phasen-System in den meisten Anwendungen 13,14.
  4. Für 1 H-NMR-Analyse von wasserlöslichen Metaboliten, auflösen Lyophilisat (siehe 5.8) in 700 ul Deuteriumoxid (D 2 O), enthaltend 3-(Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSPD 4) im millimolaren Bereich (D 2 O, das 0,05% TSPD 4 ist im Handel erhältlich) . Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Der pH-Wert der resultierenden wässrigen Extraktlösung auf 7,3 durch Zugabe von kleinen Mengen (ca. 2 ul) der Deuteriumchlorid (DCl) und Natrium deuteroxide (NaOD) Lösungen. Starten Sie zunächst mit 0,02 N DCl oder NaOD Lösungen. Wenn 2 oder 3 nachträglichen Erweiterungen nicht genügend pH-Änderung verursachen, mit 0,2 N DCl oder NaOD Lösungen fortzusetzen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu overtitrate.
    HINWEIS: Die Gesamtmenge der DCl oder NaOD-Lösung benötigt wird, hängt von der Menge an Hirngewebe extrahiert wurde; beachten Sie diesen Wert für die präzise Quantifizierung Metabolit. In den meisten Fällen sollten die kombinierten Mengen der zugesetzten DCL und NaOD Lösungen praktisch vernachlässigbar ist (in der Nähe von 1% des NMR-Probenvolumen).
itel "> 7. Performance der 31 P-NMR-Experiment für Hirn Phospholipid-Analyse 13,14

  1. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie ein hochauflösendes Multikern-NMR-Spektrometer (≥9.4 Tesla Feldstärke, entsprechend 162 MHz 31 P, 400 MHz oder 1 H-Resonanzfrequenzen). Neben der Spule 31 P, sicherzustellen, dass die 31 P-NMR-Sonde besitzt eine Spule 1 H-Protonenentkopplung. Set Temperaturregelung der NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C).
    HINWEIS: Sondentemperatur muss 10-20 min zu stabilisieren!
  2. Zentrifuge PL Extraktlösung in Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.3) bei 4 ° C und 11.000 g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
  3. Vorbereitung entsprechenden koaxialen Einsatzschaft mit einer wässrigen 20 mM Methylendiphosphonat (MDP)-Lösung bei pH 7,0 für die chemische Verschiebung Referenzierung gefülltenund Quantifizierung. Dieses Insert in der NMR-Röhrchen mit PL-Extrakt-Lösung gefüllt.
  4. Passen die NMR-Röhrchen mit dem entsprechenden Spinner und Transfer zum NMR-Magneten. Jetzt drehen die Probe bei 15-20 Hz und warten, bis die Probe auf die eingestellte Temperatur (ca. 10 min) eingestellt.
  5. Vorsichtig minimiert magnetische Feldinhomogenität in Probe durch Einstellen auf der Achse und außerhalb der Achse Shim Spulenströme 18.
  6. Set-NMR-Spektrum Erfassungsparameter auf optimale Werte, die als Funktion der Magnetfeldstärke (für einen 9,4 T System, siehe Tabelle 1 für empfohlene Parameterwerte) variieren kann.
  7. Legen Sie die Anzahl der Transienten pro Versuch (= NS).
    1. Set NS auf etwa 80 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 20 min), wenn nur die am weitesten verbreiteten PL sind mit Präzision quantifiziert werden (Phosphatidylcholin (PtdCho), Phosphatidylethanolamin (PtdEtn), Ethanolplasmalogen).
    2. Set NS etwa 100-200 (Gesamtlaufzeit von data Erwerb 1-2 h), wenn weniger konzentriert PLs werden quantifiziert werden (Alkyl-Acyl-Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure).
    3. Gesetzt, über NS 1500-2000 (Gesamtdauer der Datenerfassung 7-10 h; Nacht-Experiment), wenn sehr niedriger Konzentration PLs sind quantifiziert werden, zB Phosphatidylinositol Mono und Diphosphate (PtdIP und PtdIP 2), Cardiolipin, Lyso-PL , Alkyl-Acyl-Phosphatidylethanolamin und gelegentlich andere.
  8. Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter als Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und der PL-Signal zu quantifizieren.
    1. Um die besten Ergebnisse für den gesamten Bereich der PL erhalten, wiederholen Sie die Verarbeitung mit mehreren (mindestens zwei) verschiedene Filterverfahren. Verwenden Sie starke Auflösungssteigerung bei stark überlappenden Signalen, zB., Für PtdCho und PtdEtnRegionen.
    2. Verwenden Sie starke Filterung (schwache oder gar keine Erhöhung der Auflösung) für schwache Signale.
    3. Filter sehr schwach und breite Signale ohne erhebliche Überschneidungen von Apodization (zB LB = 3 Hz), um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, zB PtdIP und PtdIP 2 zu erhöhen. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter.
  9. Quantifizierung der Fläche jeder PL-Signal in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenz-Verbindung (MDP) im gleichen Spektrum.
  10. Kalibrieren des Signals der Referenzverbindung (MDP) in einem separaten Experiment unter Verwendung eines 5 mm NMR-Röhrchens mit (i) einer Phosphorverbindung der bekannten Konzentration und (ii) die gleiche koaxiale Einsatzschaft in PL 31 P-NMR-Experimente eingesetzt gefüllt ( siehe 7.3 und 7.9).
  11. Berechnen einzelnen PL Konzentrationen basierend auf relativen Flächen PL Signale einerseits (siehe 7.9), und auf Kalibrierungswert für MDP erhalten ausKoaxial-Einsatz auf der anderen (siehe 7.10). Berücksichtigt, die die Anzahl der Phosphorkerne Beitrag zu einem bestimmten 31 P-NMR-Signal kann als eine Funktion der molekularen Ursprungs des Signals variieren.
    HINWEIS: Der MDP Phosphonat Signal (üblicherweise 19,39 ppm referenziert) stellt zwei Phosphorkerne, wie die Phosphat-Cardiolipin-Signal. Alle anderen PL 31 P-NMR-Signale in Hirnextrakten nachgewiesen repräsentieren jeweils eine Phosphorkerns.
  12. Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Gehirn PL Ebenen zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.

8. Leistung des 1 H-NMR-Experiment zur Analyse von wasserlöslichen Metaboliten Gehirn

  1. Set Temperaturregelung des 1 H NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C). Bemerkungen siehe auch unter 7.1.
  2. Zentrifugieren Sie die Lösung in wässriger Extrakt Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.5) bei 4 ° C und 11.000g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
  3. Transfer-NMR-Röhrchen zu NMR-Magneten, Shim und setzen NMR-Spektrum Aufnahmeparameter auf die optimalen Werte wie in 7,4-7,6 erläutert. Siehe auch Tabelle 1 empfohlen für Parameterwerte.
  4. Die Anzahl der Transienten pro Experiment etwa NS = 32 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 13 min). Um einen guten Signal-Rausch-Verhältnisse für sehr schwache Signale, insbesondere im aromatischen Bereich zu erhalten, verwenden NS = 64 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 26 min) oder mehr.
  5. Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter variieren leicht, als eine Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und des Metaboliten Signal zu quantifizieren.
    HINWEIS: In den meisten Fällen reicht es aus, jedes Spektrums einmal verarbeitenUnd beschäftigt eine Reihe von Verarbeitungsparametern präsentiert einen guten Kompromiss für alle Stoffwechselsignale. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter.
  6. Quantifizierung der Fläche der einzelnen Metaboliten Signal (oft ein Multiplett, manchmal Überschneidungen mit anderen Slips oder Multipletts aus verschiedenen Molekülen stammen) in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenzverbindung (TSP-D-4) in der gleichen Spektrums.
  7. Berechnen einzelnen Metabolitenkonzentrationen basierend auf TSP-d 4-Konzentration (siehe 6.4). Berücksichtigt, die die Anzahl der Protonen Beitrag zu einer insbesondere 1 H-NMR-Signal kann als eine Funktion des Molekular Ursprung dieses Signals variieren. Die TSP-d 4 Trimethyl Signal (bis 0,0 ppm referenziert) stellt neun Protonen.
  8. Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Hirnstoffwechselniveaus zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.

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Ergebnisse

Um beste Auflösung bei Stoffwechsel NMR-Spektren von Gehirn und anderen Gewebeextrakten zu erhalten, ist es schon lange üblich, zu entfernen oder Maske Metallionen (vor allem: paramagnetischen Ionen) in Extraktlösungen vorhanden. Dies wurde entweder durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA oder CDTA dem Extrakt 19, oder indem der Extrakt durch ein Ionenaustauschharz, wie Chelex-100 20 erreicht. Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Schritt nicht für

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Diskussion

NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Messung der Konzentration von chemischen Verbindungen in Lösung in einem sehr reproduzierbare und genaue Weise. Allerdings ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten es notwendig, bestimmte Vorschriften für die Probenvorbereitung und Analyse halten. Bei der Bestimmung der Metaboliten-Konzentrationen durch NMR-Spektroskopie, weder die Erzeugung noch der Empfang des NMR-Signals dominiert die Quantifizierungsfehler, sofern die Intensität des beobachteten Signals näher...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Unterstützung durch das Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 und 7339) wird dankbar gedankt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IsofluranVirbacVetfluranAnästhetikum für Tiere
Isofluran-VerdampferOhmedaIsotec 3Neueres Modell verfügbar: Isotec 4
Skalpell, Schere, Pinzette, KlemmenHarvard Apparatus
Fisher Scientific		diverse
diverse		Chirurgische Geräte für Tiere
Freeze-Clamp-Werkzeugselbst gebautn/aZange mit Aluminiumplatten, zum Einsetzen
in flüssigen Stickstoff zum Abkühlen
DewarNalgene4150-4000
Flüssiger StickstoffLuft Flüssign/a
StickstoffgasLuft Flüssign/a
StickstoffverdampferOrganomation AssociatesN-EVAP 111Kann durch selbstgebautes Gerät
ersetzt werden MörserSigma-Aldrich
StößelSigma-AldrichZ247510
GewebehomogenisatorKinematicaPolytronMit Reagenzgläsern passend Homogenisator Schacht
Elektronische WaageSartoriusn/a
MethanolSigma-AldrichM3641
ChloroformSigma-Aldrich366910
Zentrifugenröhrchen aus GlasKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, 30 ml Röhrchen
MikrozentrifugenröhrchenKimble45150-2Kimax 2 ml Röhrchen; sollte das "Eppendorf"-Röhrchen ersetzen, wenn es mit dem Zentrifugenrotor kompatibel
PolystyrolpipettenCostar CorningStripettes5 und 10 ml
Volumen DeuterochloroformSigma-Aldrich43191599,96 % deuteriert
DeuteriumoxidSigma-Aldrich42345999,96 % deuteriert
DeuteriumchloridAlpha Aesar4240620 % in Deuteriumoxid
NatriumdeuteroxidSigma-Aldrich16448830 % in Deuteriumoxid
LyophilisiererChristAlpha 1-2
KaltzentrifugeHeraeusMegafuge 16R
pH-MessgerätEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
CäsiumhydroxidSigma-Aldrich516988 NMR-Röhrchen
Wilmad528-PP
NMR-Schaft KoaxialeinsatzSigma-AldrichZ278513By Wilmad
NMR-PipettenSigma-AldrichZ255688
PipettenEppendorfResearchMit Tipps für Volumina von 0,5 bis 1.000 μ l
Pipet-AidDrummondXP
NMR-SpektrometerBrukerAVANCE 400inkl. Sonde und weiterem Zubehör
NMR-SoftwareBrukerTopSpin 1.3neuere Version verfügbar: Topspin 3.2
Wasserlösliche StandardverbindungenSigma-Aldrichdiverse
Phospholipid-StandardverbindungenAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		diverse
diverse
verschiedene		Quelle für Plasmalogene, kann aber < Methylendiphosphonat mit einer Reinheit von 70 - 80 %
Sigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913
Z247472 ist

Referenzen

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  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
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