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Methodenartikel

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

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DOI:

10.3791/51834

⸱

4. September 2014

 , 
1Department of Crop Sciences, University of Illinois Urbana-Champaign

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Nach Exposition gegenüber spezifischen Umweltstressoren erfährt der Fadenwurm Caenorhabditis elegans eine umfangreiche phänotypische Plastizität, um in ein stressresistentes 'Dauer'-Jugendstadium überzugehen. Wir stellen Methoden zur kontrollierten Induktion und Bildgebung der Neuroplastizität während der Dauer vor.

Zusammenfassung

Die Mechanismen, die die Stress-induzierte phänotypische Plastizität bei Tieren sind häufig komplex und schwierig in vivo zu studieren. Ein klassisches Beispiel für stressinduzierten Plastizität ist die dauer Stufe C. elegans. Dauers sind eine Alternative Entwicklungslarvenstadium unter den Bedingungen der niedrigen Konzentrationen von bakteriellen Lebensmittel und hohe Konzentrationen einer dauer Pheromon gebildet. Dauers anzuzeigen umfangreichen Entwicklungs-und Verhaltensplastizität. Zum Beispiel kann ein Satz von vier inneren Lippen Quadranten (IL2Q) Neuronen in umfangreichen Umbau reversible während dauer Bildung. Unter Verwendung der bekannten Umwelt Wege Regel dauer Eintrag, einen vorher festgelegten Verfahren für die Herstellung von Roh-dauer Pheromon von großen Flüssigkeits Nematoden Kulturen demonstriert. Mit diesem Verfahren wird eine Konzentration von 50.000 - 75.000 Nematoden / ml des flüssigen Kultur ausreicht, um ein hochwirksames rohe Dauer Pheromon erzeugen. Das rohe Pheromon Potenz Detedurch eine Dosis-Wirkungs-Bioassay rmined. Schließlich sind die für die in vivo Zeitraffer-Bildgebung der IL2Qs während dauer Bildung verwendeten Methoden beschrieben.

Einleitung

Phänotypische Plastizität, einschließlich Entwicklungs-und Verhaltensplastizität, ist wichtig für die Anpassung an widrige Umweltbedingungen und wird in der Evolution 1 als treibende Kraft. C elegans ist ein Modellorganismus für Studien häufig in der Entwicklung und Neurobiologie eingesetzt. Unter idealen Bedingungen, C. elegans entwickelt sich durch vier Larvenstadien vor Eintritt in die Erwachsenenfortpflanzungsstadium. Doch unter den Bedingungen der niedrigen Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln und eine hohe Bevölkerungsdichte, C. elegans kann eine Entwicklungs Schalter zu unterziehen und in einen langlebigen und strapazierfähigen dauer Stufe 2. Dauers Anzeige mehrere morphologische und Verhaltensunterschiede von nicht-dauers die wahrscheinlich vermitteln diese Stressresistenz. Die Umweltreize und genetischen Signalwege regulieren dauer Eintrag haben ausführlich beschrieben 3, 4, 5, 6, 7 gewesen. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die die einzelnen phänotypischen Veränderungen, die auftreten, dährend dauer Bildung sind weniger gut verstanden.

Die Untersuchung der Dauer-spezifischen Phänotypen erfordert die Herstellung von Dauer-Tiere. Dies kann auf drei Arten durchgeführt werden: 1) Sammeln von einem ausgehungerten Kultur von C. elegans, 2) Verwendung von Dauer Bildung konstitutive (DAF-c) Mutanten, 3) Induktion der Dauer Bildung durch gereinigte Pheromon. Es ist relativ einfach, aus einem Standard-dauers NGM Platte mit einem C holen elegans Bevölkerung, die ihre bakterielle Lebensmittelversorgung erschöpft hat. In unseren Händen, ein Standard NGM Platte ursprünglich mit 50 ul OP50 Escherichia coli, darf für 3 Tage wachsen und anschließend mit 3 geimpft ausgesät - 4 Erwachsene Hermaphroditen bei 25 ° C gehalten wird die Nahrungsmittelversorgung innerhalb einer Woche verbrauchen und produzieren mehrere tausend dauers innerhalb von weiteren 3 Tagen (neben zahlreichen verhungert nicht dauers). Jedoch ist dieses Verfahren nicht zufriedenstellend für die Prüfung Vorgänge während der Häutung in d auftretendenAuer. Es ist schwierig zu bestimmen, welche der mehreren tausend Tieren auf einer typischen Platte in ausgehungert Dauer der Eingabe sind. Darüber hinaus wird die Verwendung eines verhungerten Platte bietet keine Möglichkeit für die Synchronisation. Die Verwendung von daf-c-Mutanten ermöglicht die Synchronisation und die zuverlässige Erzeugung von dauers. Es gibt jedoch keine Garantie, dass eine bestimmte daf-C-Mutation nicht alleine oder in Kombination mit weiteren Mutationen betreffen andere Dauer-spezifischen Phänotypen.

Das Vorhandensein einer Dauer Pheromon wurde zuerst von Cassada und Russell impliziert und später von Golden und Riddle gezeigt. Die Dauer Pheromon seitdem chemisch charakterisiert 2, 8, 9, 10. Das gereinigte Pheromon besteht aus einer komplexen Mischung von ascarosides, die in verschiedenen Formen regulieren sowohl Verhaltens-und Entwicklungsprozesse 9, 11. Verwendung einer rohen Dauer Pheromonextrakt ermöglicht zuverlässig gesteuert Induktion synchronisiert dauers in einem Wildtyp-Hintergrund.

Das Nervensystem und die damit verbundenen Gliazellen Umbau unterzogen während dauer Larve Formation 12, 13, 14. Einige dieser Änderungen sind irreversibel, wie der Umbau der Gliazellen während dauer 13, 14. Jedoch andere Umbau Ereignisse sind reversibel bei einer Rückkehr zu günstigen Umgebungsbedingungen. Zum Beispiel ein Satz von vier IL2Q Neuronen unterziehen schnelle und reversible neuronale Umbau während dauer Bildung, einschließlich: Dendriten Verzweigung, einem Wechsel von Einzel dendritischen zu multidendritic Neuronen und Axonen Umbau 12. Die Verfahren, die hier ermöglichen die In-vivo-Bildgebung von Stress-induzierten Neuroplastizität in einem Modellorganismus. Die für die Herstellung und Prüfung von Roh-dauer Pheromon stellten Verfahren sind zuvor beschrieben, und aus verschiedenen Quellen 4, 8, 15, 16, 17, 18 aufgelistet.

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Protokoll

1. Crude Dauer Pheromone Produktion

  1. Wachsen OP50 E. coli aus einer einzigen Kolonie O / N bei 37 ° C unter Schütteln in 100 ml LB-Brühe mit 200 Upm. ANMERKUNG: Diese O / N-Kultur kann im Voraus erfolgen und bei 4 ° C gelagert werden.
  2. Wachsen N2 C. elegans auf Juni 15-20 cm Petrischalen mit Agar NGM (siehe Rezept in Tabelle 1) ausgesät mit 50 ul OP50 E. coli, bis die Bakterien fast aufgebraucht ist 19.
  3. Machen 5x 250 ml S-Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) in 1 L Erlenmeyerkolben 19. HINWEIS: Diese Lösung kann im Voraus gebucht werden.
  4. Wachsen, eine Kultur der OP50 E. coli in 4 l LB-Brühe O / N durch Inokulation mit 1 ml OP50 in E. coli und Schütteln bei 37 ° C für 16 Stunden.
  5. Von Platten (Schritt 1.2) mit 1 ml S-Grundlösung (siehe Rezept in Tabelle 1) und die Übertragung von Nematoden 4-5 Platten in jedem der 4 1 L Erlenmeyerkolben mit der S-Medien in Schritt 1.3 vorbereitet Waschen Sie die Nematoden (4- 5 Plattenpro Kolben) 19.
  6. Zentrifugieren Sie die OP50 von Schritt 1.4 bei 650 g für 10 min und entfernen Überstand. Resuspendieren jeder Bakterienpellet in 10 ml S-Grundlösung. Übertragen gleiche Mengen von Bakterien resuspendiert jedem Kolben von Nematoden.
  7. Die Kolben in einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur (20 - 25 ° C) und 100 bis 150 Upm für 4 - 5 Tage, bis die Lösung beginnt zu löschen, die eine Abreicherung von Lebensmitteln.
  8. Sobald die Nahrung aufgebraucht ist, wachsen andere O / N-Kultur von E. OP50 coli in 4x 1 l LB-Brühe. Zentrifugieren der Bakterien bei 650 × g für 10 Minuten und füge eine Tablette von einem Kolben auf jeder der S Medienflaschen mit Nematoden. Bringen Sie die S Medienflaschen auf den Schüttler, wie in Schritt 1,7, für weitere 3-4 Tage, bis das Essen wieder aufgebraucht ist.
  9. Nehmen Sie ein ~ 1 ml Aliquot Lösung aus jedem Kolben und schätzen Sie die Nematoden-Konzentration durch Unterabtastung 1 ul von jeweils 1 ml Aliquot und Zählen der Anzahl von Nematoden. HINWEIS: Die75.000 Nematoden / ml - Nematodenpopulation sollte 50.000 sein. Bei dieser Konzentration die Mehrheit der Nematoden dauers.
  10. Entsorgen Sie alle kontaminierten Flaschen. HINWEIS: Die Kontamination manifestiert häufig als Pilzhyphen in Schritt 1.9 zu sehen.
  11. Zentrifuge Nematoden bei 4.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Entsorgen Sie die Nematoden-Pellets und behalten den Überstand. Alternativ finden Sie in der Diskussion für die Verwendung dieser Tiere, um eine niedrige Potenz-Pheromon zu machen.
  12. Den Überstand durch # 1 Whatman-Filterpapier. ANMERKUNG: Eine Thermoskanne wird diesen Prozess beschleunigen.
  13. Weitere Den Überstand durch 0,45 um sterile Vakuumfiltrationseinheiten. HINWEIS: Das Filtrat gehalten werden kann O / N bei 4 ° C oder gehen auf 1,14.
  14. Füge das Filtrat in ein 2 l Becherglas mit einem Rührstab. Platz in einer Abzugshaube auf einer Wärmeplatte für Aufsehen. Zum Kochen bringen und unter Rühren verdampfen, um etwa 200 ml. Die Lösung wird in einen 500 ml Becher. Weiter kochen, bis ca. 50 ml sind left. HINWEIS: Es sollte bei diesem Schritt genommen, wie es möglich ist, für die Lösung überkochen werden. Die Farbe der endgültigen 50 ml ist dunkelbraun. Zu jeder Zeit während des Kochprozesses kann die Wärme abgeschaltet und das Filtrat aufbewahrt O / N bei RT oder 4 ° C beträgt.
  15. Abkühlen lassen und Zentrifugieren für 5 min bei 1.000 x g. Gießen Sie den Überstand in ein 100 ml-Becherglas und entsorgen Sie die Pellets.
  16. Kochen Sie den Überstand bis auf eine braune Kruste. Vom Herd nehmen und brechen die Kruste mit einem Spachtel. Fügen Sie so 200 Proof-Ethanol, um die Kruste zu decken. Das Becherglas mit Parafilm und lassen Sie es sich O / N bei RT. Gießen Sie das Ethanol in einen sauberen Becher und zur Seite stellen. Fügen Sie frisches Ethanol, um die Kruste zu decken. Wiederholen O / N Extraktionen 3 mal. Bündeln die Extrakte.
  17. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, die Ethanol-Extrakte trocknen. Wenn eine Vakuumpumpe ist nicht verfügbar, fügen Ethanolextrakt in ein sauberes Becherglas warm bis 50 ° C unter Rühren in einem Abzug. Hinweis: Nachdem das Ethanol hat eine klebrige Rückstände von l verdampftight braune Farbe bleiben sollte. Wenn Heizen verwendet wird, sollte darauf geachtet werden, um die Lösung durch Erwärmen zu lange nicht brennen werden.
  18. Auflösen Rückstand in 10 ml destilliertem sterilem Wasser. Filter sterilisieren diese Lösung mit einem 0,22 um Spritzenfilter und bei -20 ° C in 1 ml Aliquots. ANMERKUNG: 1 ml Wasser zum Auflösen des Rückstandes auf 100 ml der ursprünglichen Flüssigkeit Nematodenkultur verwendet. Zum Beispiel, wenn eine der flüssigen Kulturkolben ist durch Verschmutzung verworfen, dann die Menge an Wasser verwendet, um den Rückstand zu lösen.

2. Bestimmung der Pheromone Dose Response

  1. Bereiten dauer Pheromon, indem 6x 5 ml NGM Medien mit Edel-Agar, ohne Pepton, und mit 50 g / ml Streptomycinsulfat und eine Reihe von Dauer-Pheromon ergänzt (siehe Rezept in Tabelle 1) 4, 19. Mischen Komponenten in ein 13x100 mm Glas-Kulturröhrchen, kochen über einem Bunsenbrenner und dann in 3 cm Petrischalen gießen.
  2. Wiegen Uhricrocentrifuge Röhre. 1 ml des O / N-Kultur von E. coli OP50 an das Rohr und Zentrifuge bei ~ 17.000 xg in einem Reaktionsgefäß. Entfernen Sie alle Überstand. Wiegen Sie das Rohr wieder und bestimmen des Gewichts des Bakterienpellets. Das Pellet mit M9-Puffer (Rezept in Tabelle 1) für eine Endkonzentration von 4% (w / v). 10 ul Aliquot der bakteriellen Suspension in die Mitte jeder Platte 4 Pheromon. Shop Platten O / N bei RT.
  3. Pick 10-15 trächtige N2-Wildtyp-Hermaphroditen einen Tag nach der Häutung in das Erwachsenenalter auf die Pheromon-Platten 4. Speichern die Platten bei 25 ° C für 3 - 4 Stunden.
  4. Wählen Sie alle von den erwachsenen Hermaphroditen. Notieren Sie die Anzahl der Eier für jede Platte gelegt. Dichten die Platten mit Parafilm und zurück auf 25 ° C für 3 Tage 17.
  5. Zählen der Prozentsatz der dauers (Abbildung 2). Anmerkung: Bei beiden Verfahren ist es wichtig zu beachten, dass dauers (und in geringerem AbZelt nicht dauers) werden die Wände hochklettern und auf dem Deckel der Petrischalen. Es ist daher wichtig, dass alle Oberflächen der Schale für Nematoden untersuchen.
  6. Zu den Daten passen auf eine Dosis-Wirkungs-Kurve und die Schätzung der EC 90 Konzentration von Pheromon (ausreichend Pheromon zu 90% der Tiere zu veranlassen, dauers bilden), wie in Abbildung 3 dargestellt. Hinweis: Wir verwenden in der Regel eines logistischen Regressionsmodells, um die EC 90 zu schätzen , aber verschiedene statistische Software-Pakete können auch alternative Methoden, die ähnliche Schätzungen zu produzieren.

3. Live-Imaging von Dauer IL2 Neuronen

  1. Bereiten dauer Pheromon-Platten wie in Protokoll 2 unter Verwendung der EC 90-Wert in Schritt 2.6 festgelegt.
  2. Induzieren dauers mit den Methoden in Protokoll 2 mit einem Stamm, der eine integrierte IL2 Reporter-Transgen (myIs13 [P KLP-6 :: GFP], myIs14 [P KLP-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] oder qIs56 [P-Lag-2 :: GFP]) 12, 20, 21. HINWEIS: Wenn q Is56 verwendet wird, wird die Expression von GFP in den IL2Qs unsichtbar bis mehrere Stunden in der dauer Mauser und einige der ersten Umbau Veranstaltungen werden nicht sichtbar sein. Zusätzlich, während das Fluoreszenzsignal von der P-Lag-2 :: GFP-Transgen ist letztlich heller in den IL2s während dauer als die P-6 KLP fluoreszierenden Reporter, der P-Lag-2 :: gfp Transgen drückt auch schwach in den Muskeln, die den Kopf können die feinen Äste IL2 maskieren.
  3. Nach der Eiablage, entfernen Sie die Erwachsenen Hermaphroditen, dichten die Platten mit Parafilm und Inkubation für 34 Stunden bei 25 ° C 17. HINWEIS: Die Länge der Zeit, die Dauer variiert leicht molt zwischen den Individuen. Die schnellste Zeit der Dendriten Verzweigung beginnt 4 - 5 Stunden nach dem Beginn der Häutung Dauer (39 bis 44Stunden nach der Eiablage bei 25 ° C) 12.
  4. Am Tag vor der Bildgebung, bilden eine Lösung von 10% (w / v) Agarose in M9-Puffer mit dauer Pheromon an der EC 90-Konzentration. Aliquoten etwa 100 ul Agarose auf einen Objektträger und schnell, aber sanft, legen Sie eine andere Folie auf der Oberseite, um eine flache Oberfläche Agarose erstellen. Nach Erstarren der Agarose, wickeln Sie die Folien in Frischhaltefolie und Speicher in einer feuchten Kammer (Pipettenspitze Box mit feuchten Papiertüchern).
  5. Nach der 34 Stunden Inkubationszeit untersuchen Pheromon Platten für Nematoden, die Rachenpumpaufgehört haben. Separaten Folien, so dass nur eine Oberfläche einer Folie hat Agarose darauf. Wählen Sie eine oder mehrere Nematoden auf ein 10% iges Pad und 1 μ l von 0,1 Mikrometer Polystyrol-Kügelchen 22. HINWEIS: Bei einer gut synchronisierten Population, die Mehrheit der Nematoden auf der Platte wird in die Häutung Eingabe werden von L2d auf Dauer. Allerdings kann es sein, Unterschiede zwischen individuals. Es ist daher wichtig, um zusätzliche Funktionen (Stoma Okklusion, Rachen-Remodeling) beachten, um die Menge der Zeit, die Tiere in der Mauser gewesen dauer (siehe repräsentative Ergebnisse zum Beispiel) zu schätzen.
  6. Bestimmen Sie die Ausrichtung (links / rechts, dorsal / ventral) des Fadenwurms. Erfassen Z-Stapel-Bildern eines IL2Q Dendriten bei 100-facher Vergrößerung mit dem niedrigsten möglichen Fluoreszenzintensität alle 15 min oder als für den spezifischen Experiment benötigt. Weitere Bilder aufzunehmen, bis der Fadenwurm aus der L2d Nagelhaut getrennt und Immobilisierung unmöglich ist oder wenn das Tier erholt sich von dauer (Rachenraum beginnt Pumpen). Wenn nicht aktiv Bildgebung, den Objektträger in einer feuchten Kammer. HINWEIS: Wir verwenden ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne und Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik.

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Ergebnisse

Die Produktion von Roh-dauer Pheromon zu einer gelben Flüssigkeit (Abbildung 1), die sowohl Wärme als auch Kälte stabil ist. Aliquots von Roh-Pheromon werden bei -20 ° C unbegrenzt ohne offensichtliche Aktivitätsverlust gelagert. Nach der Produktion von Pheromon, ist eine einzelne Dosis-Wirkungs-Bioassay ausreichend für eine grobe Schätzung der Potenz. Es ist jedoch für die meisten Experimente notwendig Bioassay 2 wiederholen - 3 Mal und die im Durchschnitt aus jedem Experiment. Repräsentative Ergebniss...

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Diskussion

Eine Untersuchung der Dauer-spezifische Neuroplastizität und andere dauer-assoziierten morphologischen Veränderungen erfordert kontrollierte und zuverlässige Bildung dauers entweder durch genetische Mutation (dh daf-c-Mutanten) oder durch Einwirkung von Wildtyp-Tiere Pheromon. Während die Verwendung eines genetischen Mutation dauers induzieren ist bequem, kann es Ergebnisse zu verwechseln. Daher Daten mit daf-c-Mutationen gesammelt sollte anschließend mit Wildtyp-Tiere veranlasst, die Dauer der Bühne d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Danksagungen

Ich danke Dr. Maureen Barr, unter deren Aufsicht der Dauer IL2 Remodeling-Phänotyp ursprünglich charakterisiert wurde. Dank an Dr. C. Britt Carlson für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Finanzierung des Barr-Labors erfolgte durch das NIH (5R01DK59418) und Postdoktorandenstipendien des USDA (2010-65106-20587) und der New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Die derzeitige Finanzierung für diese Arbeit erfolgt durch ein FIRE-Stipendium des Urbana-Champaign College of ACES der University of Illinois.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
N2 C. elegans Bristol StammCaenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] IIIAuf Anfrage von Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] VAuf Anfrage von Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] VCaenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coliCaenorhabditis Genetics Center
PetrischalenTritech Research60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM AgarVerschiedene3 g NaCl, 17 g Agar, 2,5 g Pepton in 975 ml H2O autoklaviert gekühlt auf 55°; C gefolgt von 1 ml 5 mg/ml Cholesterin in Ethanol, 25 ml 1 M KPO4 Puffer (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4
S MedienVerschiedeneS Medien bestehen aus S Basallösung (1,46 g NaCl, 0,25 g K2HPO4, 1,5 g KH2PO4, 0,25 ml 5 mg/ml Cholesterin in Ethanol und H2O bis 250 ml. Autoklaviert.) Zur Basallösung S 2,5 ml Kaliumcitrat pH 6,0 (2 g Zitronensäuremonohydrat, 29,4 g Trikaliumcitratmonohydrat, H2O auf 100 ml, autoklaviert), 2,5 ml Spurenmetalllösung (1,86 g Dinatrium-EDTA, 0,69 g FeSO4  &stier; 7 H2O, 0,2 g MnCl2• 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  &stier; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  &stier; 5 H2O, H2O bis 1 L. Autoklavieren und dunkel gelagert), 0,75 ml 1 M CaCl2 und 0,75 ml 1 M MgSO4.
Dauer Pheromonplatten für Dosis-Wirkungs-AssayVariousMix 0,085 g Edelagar, 0,5 ml 0,513 M NaCl und 5 & Mikro; l 5 mg/ml in Ethanol gelöstes Cholesterin in jedem der 6x 15 ml Kulturröhrchen. Geben Sie ausreichend rohes Pheromon in jedes Röhrchen, um eine Reihe von Konzentrationen zu erzeugen. Fügen Sie H2O hinzu, um das Volumen auf 4,725 ml zu erhöhen. Über einem Bunsenbrenner kochen, bis sich der Agar aufgelöst hat, und dann auf 55 μC abkühlen. 125 μm; l 1 M KPO4 Puffer (pH 6,0), 50 µ l 0,1 M CaCl2, 50 & Mikro; l 0,1 M MgSO4 und 50 & micro; l 5 mg/ml Streptomycinsulfat in jedes Röhrchen. Gießen Sie den Inhalt jedes Röhrchens in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm. Lassen Sie den Agar über Nacht bei Raumtemperatur fest werden (wenn länger, lagern Sie ihn in einem geschlossenen Behälter, um ein übermäßiges Austrocknen zu verhindern).
Mikrosphären-Kügelchen 0,1 MikronPolysciences Inc.00876-15
M9 PufferVariousMix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O bis 1 Liter. Sterilisieren durch Autoklavieren

Referenzen

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