Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Zusammenfassung

Alternatives Spleißen spielt eine entscheidende Rolle bei der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), einem essentiellen zellulären Programm, das in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen abläuft. Hier beschreiben wir eine Strategie zum Nachweis alternatives Spleißen während der EMT unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modells durch Expression des Transkriptionsrepressors Twist. Die EMT wird durch Veränderungen in der Zellmorphologie, den Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen und die geschaltete Expression von EMT-Markern, wie z. B. den Verlust der epithelialen Marker E-Cadherin und γ-Catenin und den Gewinn der mesenchymalen Marker N-Cadherin und Vimentin, überwacht. Unter Verwendung von isoformspezifischen Primer-Sets wird das alternative Spleißen interessierter mRNAs mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Die Herstellung entsprechender Proteinisoformen wird durch Immunblotting-Assays validiert. Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von Spleißisoformen eignet sich auch für die Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen.

Einleitung

Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein Entwicklungsprogramm, das Organ Morphogenese und Gewebeumbau während der Embryogenese steuert. Wenn abnorm aktiviert, fördert die EMT Tumormetastasierung und Organfibrose ^1,2. Zwingende Studien haben die Bedeutung der transkriptionellen Regulierung während des Prozesses der EMT beschrieben, durch mehrere Transkriptionsfaktoren, wie Verdrehen, Schnecke, und ZEB, die die Expression des Zonula-junction-Protein E-Cadherin-Repression, was zum Verlust eines Pflaster definiert Stein wie epitheliale Morphologie und Verstärkung eines spindelförmigen mesenchymalen Phänotyp ^3-8. Jüngste Studien durch genomweiten Analyse von RNAs aufgedeckt, daß es eine Gruppe von Genen, deren Klebemuster entweder mit epithelialen oder mesenchymalen Phänotypen ^9,10 zugeordnet. Arbeiten aus unserem Labor alternatives Spleißen und EMT funktionell verbunden. Durch das Studium der Zelloberfläche Adhäsionsmolekül CD44 wir gezeigt, dass CD44 alterntiven Spleißen dicht bei EMT geregelt, und noch wichtiger, dass CD44 Spleiß-Isoform Schalt kausal trägt EMT ^11.

Alternatives Spleißen ist ein weit verbreitet und konservierten Modell der Genregulation, wie bis zu 95% der menschlichen Multi-Exon-Gene sind alternativ gespleißte ^12-14. Durch die Erzeugung von mehreren Protein-Produkte von einem einzigen Gen, stellt alternative Spleißen einen wesentlichen Mechanismus für die Proteinvielfalt, indem eine weitere Schicht von Komplexität des menschlichen Genoms. Als solche könnte eine Fehlregulation von alternativem Spleißen möglicherweise tiefgreifende biologische Wirkungen verursachen Erkrankungen des Menschen führen. Tatsächlich hat abweichende alternative Spleißen in Krankheiten, für mehr als ein Jahrzehnt ^15-25 dokumentiert, einschließlich der jüngsten Erkenntnisse, die Mutationen in Genen die Spleißosom Maschinen codieren, werden häufig in myelodysplastischen Syndromen ^26-28 gefunden. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger Verfahren zum Nachweis von alternativ gespleißten isoforms ist von großer Bedeutung in der Erforschung der vielfältigen biologischen Prozesse, einschließlich EMT.

Hier bieten wir ein Protokoll, um Veränderungen in alternative Spleißen unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modell zu erkennen. Die Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und das Nachweisen Spleiß-Isoformen sind nicht nur für die Untersuchung von alternativem Spleißen während EMT, sondern auch zur Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen. Untersuchung alternatives Spleißen während EMT ist zwingend notwendig, um ein besseres Verständnis der Mechanismen der EMT und Metastasierung von Tumoren, so die Entwicklung von Strategien, um die Krebsmetastasen zu behandeln.

Protokoll

1. Zellkultur von EMT Induktions

Hinweis: EMT kann durch die Behandlung von TGFß oder ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren Twist, Schnecke, oder ZEB1 / 2 in Epithelzellen induziert werden. In diesem Protokoll beschrieben ist eine induzierbare EMT-System über die Expression des Twist-ER-Fusionsprotein in verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HMLE / Twist-ER, ein Geschenk von Dr. J Yang, UCSD) ^9,11,29. Auf 4-Hydroxytamoxifen (TAM) Behandlung transloziert das Fusionsprotein Twist-ER in den Kern, um die Transkription und führt zu einer vollständigen EMT Übergang in 12-14 Tagen ^9,11,29 fahren. Zusätzliche EMT induzierbare Systeme, wie HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß und MCF10A / TGFß, finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen ^11,30 gefunden werden.

1. Aufrechterhaltung HMLE / Twist-ER Zellen in serumfreiem Brustepithelzellen Zellwachstumsmedium (MEGM) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO _2. Durchgang die Zellen alle 2-3 Tage, wenn sie 80% Konfluenz erreichen. Zellen mit 0,15% Trypsin bei 37 ° C für 5-10 min, und anschließend mit Trypsin zu inaktivieren, 5% Kälberserum / DMEM. Spin-down-Zellen und resuspendieren sie in MEGM. Plattenzellen in einer neuen Gewebekulturschale in einem Verhältnis von 1 bis 4 ist.
2. TAM in Ethanol auflösen, um eine 200 uM Lösung. TAM schützen vor Licht und bei -20 ° C. Vor Gebrauch frisch TAM in MEGM Medien Hinzufügen bei einer 1: 10.000 Verdünnung auf eine Endkonzentration von 20 nM TAM machen.
3. Für die Induktion der EMT, Platte 1,6 x 10 ⁶ HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in zweifacher Ausfertigung. Kulturzellen mit 20 nM TAM haltigen MEGM Medien.
4. Platte 1,6 x 10 ⁶ HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung und Behandlung Zellen mit 0,01% Ethanol als nicht-TAM-behandelten Kontroll.
5. Zwei Tage nach der Inkubation, machen Sie Fotos unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung zu morphologischen Veränderungen der Zellen zu erfassen.
6. Saugen Sie das Medium aus einem Gericht der Kontrolle oder TAM-behandeltZellen. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und Ernte von Zellen Verschrottung Hälfte der Platte in der RNA-Lyse-Puffer für RNA-Isolierung und die andere Hälfte in RIPA-Puffer für die Proteinanalyse.
7. Passage-Zellen aus der Steuerung oder TAM-behandelten Gerichten, die von Re-Plattierung 1,6 x 10 ⁶ Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung. Kontinuierlich behandeln die Zellen mit 20 nM TAM oder Fahrzeug.
8. Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 einmal jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu welcher Zeit, TAM-behandelten Twist-ER-Zellen zeigen eine spindelförmige Morphologie mesenchymalen, während Vehikel-behandelten Kontrollzellen pflegen die Kopfsteinpflaster-wie epitheliale Morphologie.

2. Charakterisierung EMT

Hinweis: Ein Abschluss der EMT wird angezeigt durch: (1) Handy morphologische Veränderungen von einem pflastersteinartigen epithelialen Morphologie zu einer spindelförmigen Fibroblasten-ähnliche Aussehen; (2) Der Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen; und (3) Der Schalt Expression von EMT-Marker, die durch den Verlust definiertepithelialen Marker und Verstärkung von mesenchymalen Marker.

Zelle morphologische Veränderungen durch Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung im Zeitverlauf der Induktion EMT erfasst, in Abschnitt 1. Immuno-Fluoreszenz-Detektion von E-Cadherin bei Zellen-Übergängen beschrieben, ist in diesem Abschnitt beschrieben. Die Expression von EMT-Marker wird durch Immunoblotting nachgewiesen. Gemeinsamen epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und mesenchymalen Marker umfassen Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin. Allgemeine Vorgänge der Immunoblot werden in Abschnitt 4 beschrieben.

1. Am Tag 12 der Behandlung TAM, Samen 1 x 10 ⁵ Zellen auf einer 12 mm Glaskreisdeckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte gelegt.
2. 48 Stunden nach dem Aussäen absaugen mittel-und Wasch Zellen mit vorgewärmter PBS.
3. Fix Zellen mit vorgewärmten 4% Paraformaldehyd für 15 min.
4. Mit PBS waschen Zellen dreimal.
5. Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS Inkubieren für 15min bei RT.
6. Mit PBS waschen Zellen dreimal.
7. Zellen in 5% BSA / PBS-Inkubation für 1 h bei RT zu blockieren nichtspezifische Bindung.
8. Zellen, die mit dem primären Antikörper E-Cadherin Inkubieren bei 1:50 Verdünnung in 1% BSA / PBS in einer befeuchteten Kammer O / N bei 4 ° C ist. HINWEIS: Der Bereich für primäre Antikörper Verdünnung ist normalerweise zwischen 1:50 und 1: 200, und die optimale Verdünnung für jeden Antikörper sollte experimentell bestimmt werden.
9. Dekantiert man die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
10. Zellen mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper inkubieren in einer 1: 500-Verdünnung für 1 h bei RT. Von diesem Schritt auf, schützen die Zellen vor Licht.
11. Dekantiert man die sekundären Antikörper und dreimal mit PBS.
12. Fleck Zellen mit 0,1-1 g / ml DAPI oder Hoechst für 10 min.
13. Spülen Zellen dreimal mit PBS.
14. Berg Deckgläschen mit einem Tropfen Eindeckmedium und Deckgläschen Dichtung mit Nagellack.
15. Beachten Zellen und nehmenBilder unter einem Fluoreszenzmikroskop 63X.

Färbung mit zusätzlichen Antikörpern kann durchgeführt werden, um die EMT-Phänotyp zu bestätigen. Zum Beispiel können N-Cadherin und α-Aktin des glatten Muskels bei einer mesenchymalen Phänotyp ^29,31,32 gefärbt werden. Reorganisation des Zytoskeletts Struktur kann durch Anfärben der Zellen mit Phalloidin für ^F-Actin-11 überwacht werden. Darüber hinaus können Assays auf Zellbeweglichkeit und Zelltod Widerstand durchgeführt werden, um die Eigenschaften des EMT ¹¹ zu prüfen.

3. Nachweis der Splice-Isoformen Mit qRT-PCR-Assays

1. Primer-Design
   HINWEIS: Primerpaare sollten sorgfältig geplant werden, um unterschiedliche Spleiß-Isoformen zu verstärken. Exon-Skipping, das am häufigsten beobachteten alternatives Spleißen Fall wird hier als Beispiel für die Strategie der Primer-Design veranschaulichen. 1A zeigt einen Vier-Exon-pre-mRNA, wobei das dritte Exon als variable Exon. Einbeziehung von Exon 3 Ergebnisse indie Herstellung eines mehr Spleiß-Isoform, wobei das Exon 3 erzeugt einen kürzeren Spleiß-Isoform. Primer müssen entwickelt, um die Exon-3-Isoform enthalten und Exon-3-Isoform unterscheiden sprungen, und die Gesamt Transkript dieser mRNA zu detektieren.
   1. Für den Nachweis von Exons Aufnahme sorgfältig Design eine Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exon 3 und einem Reverse-Primer in der Nähe konstitutive Exon 4, so dass für die spezifische Amplifikation der variablen Exon-Isoform enthalten. Achten Sie darauf, sowohl vorwärts als auch entwerfen und Reverse-Primer innerhalb der gleichen variable Exon, um PCR-Produkte aus genomischer DNA oder pre-mRNA verstärkt zu vermeiden.
   2. Zur spezifischen Amplifizierung Exon-Skipping-Ereignisse, Design einer der Primer überspannt den Übergang des konstitutiven Exon 2 und Exon 4, die auf andere Weise zerstört würde, wenn variable Exon 3 enthalten sein. Entwerfen der andere Primer in dem konstitutiven Exon 4. Daher werden PCR-Produkte erzeugt, nur wenn der variable Exon 3 excludEd und die konstitutive Exon 2 und Exon 4 werden anschließend miteinander verbunden.
   3. Um die Gesamt Transkripte des Gens zu erkennen, entwerfen die Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons 1 und 2. So werden PCR-Produkte aus allen Isoformen verstärkt.
   4. Sicherzustellen, dass die Schmelztemperatur (Tm) für alle Primer in etwa 55 ° C, wobei die Länge jedes Primers etwa 18-22 Nukleotide, und die Größe der PCR-Produkte liegt zwischen 80 und 150 Basenpaaren.
2. RNA-Extraktion: Auszug RNA mit einer Gesamt-RNA Isolation Kit (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Sammeln Zellen in 350 ul RNA Lyse-Puffer.
   2. Fügen Sie 350 ul 70% Ethanol zum Lysat und gründlich mischen.
   3. Übertragung der Probe auf die Säule zur Reinigung von RNA.
   4. Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min und Durchfluss verwerfen.
   5. Einmal mit 500 ul Waschpuffer I RNA und RNA zweimal mit Waschpuffer II Die Säule.
   6. Reste von RNA-WaschpufferII von der Säule durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten.
   7. Übertragen die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen werden 50 ul Nuklease-freies Wasser in der Mitte des Säulenmatrix und Eluieren RNA durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit.
3. Synthese von Erststrang-cDNA
   1. Bestimmung der Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorptionsmessung. HINWEIS: Gute Qualität RNA sollte eine 260 nm / 280 nm Absorptionsverhältnis von etwa 2,0.
   2. Der reverse Transkriptase (RT)-Reaktionen, die 250 ng Gesamt-RNA, 0,05 ug Zufalls-Hexamer-Primer, 50 pmol _MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 ul 5 · GoScript Puffer und 1 ul RT-Enzym in einem Endvolumen von 20 ul enthalten eingestellt.
   3. Führen RT-Reaktionen bei 42 ° C für 1 h, gefolgt von einer Inkubation bei 70 ° C für 5 min, um die RT-Enzym zu inaktivieren.
4. Echtzeit-PCR
   1. Bis 20 ul Reaktionen, die von 10 ul SYBR Green Master Mix bestehen eingestellt,0,1-1,0 ul cDNA-Vorlage, und 5 pmol Vorwärts und Rückwärts-Primer.
   2. Führen Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen der folgenden Schritte: 95 ° C Denaturierung für 10 Sekunden bei 58 ° C Annealing für 10 sec und 60 ° C Extension für 30 Sekunden. Führen PCR-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung.
   3. Überprüfen Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass ein einzelner Peak ist für jedes Primerpaar beobachtet.
   4. Erhalten die Werte Quantifizierung Zyklus (CQ) durch die Berechnung der zweiten Ableitung Werte der Verstärkungskurven.
   5. Berechnen der relativen Menge (RQ) des Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zu der nicht-induzierten Probe unter Verwendung des 'Delta-Delta-Cq (ΔΔCq) "-Methode, wie durch die folgende Formel gezeigt. Verwenden Housekeeping-Gene, wie GAPDH oder TBP, als Referenz.

Um genauer zu berechnen relativen Werte von Spleiß-Isoformen, ter von mehreren Referenzgenen verwenden sollten berücksichtigt werden. Die Ergebnisse können unter Verwendung eines von Pfaffl et al ^33,34 beschriebenen modifizierten Absolutwert Quantifizierungsmethode analysiert werden.

4. Prüfung der Splice-Isoformen auf Proteinebene

1. Sammeln Zellen in 100 ul eiskaltem RIPA-Puffer.
2. Stellen Lysate auf Eis für etwa 10 min.
3. Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstandes.
4. Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays.
5. Verdünnte Proteinproben in SDS-Beladungspuffer geladen 20-40 ug Proteine ​​in 10% SDS-PAGE-Gelen.
6. Führen SDS-PAGE-Gelen bei 20 mA für 1,5 Stunden.
7. Transfer-Proteine ​​auf PVDF-Membranen in einer Nasstransfersystem bei 4 ° C für 3 h bei 85 V. Einstellen der Übertragungszeit nach dem Molekulargewicht des Zielproteins.
8. Block Membran in 5% fettfreier Milch 30 min bis 1 h bei RT.
9. Inkubieren Membran witen einen primären Antikörper bei 4 ° CO / N. Der Bereich für die Primärantikörperverdünnung in der Regel zwischen 1: 200 und 1: 5.000, bestimmen die optimale Verdünnung für jeden Antikörper experimentell. Die Verdünnung der Antikörper in diesem Protokoll verwendet werden, können in "Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte" zu finden.
   1. Um Spleiß-Isoformen erkennt, verwenden Sie spezifische Antikörper, die eine bestimmte Isoform zu erkennen. Alternativ können einen Antikörper, der das Epitop im konstitutiven Exon codierenden Region erkennt und erfassen Spleiß-Isoformen gleichzeitig aufgrund ihrer unterschiedlichen Proteingrößen.
   2. Zur gleichen Zeit, zu überwachen EMT durch Immunoblotting EMT-Marker. Sie können den E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin als epithelialer Marker und Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin als mesenchymalen Marker.
10. Waschen der Membran dreimal mit TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) in einem 5-Minuten-Intervall.
11. Inkubieren Membran mit einem HRP-konjugierten sekundären Ameisenibody in einer 1: 10.000-Verdünnung für 1 h bei RT.
12. Waschen der Membran dreimal mit TBS-T bei einer 5-min-Intervall.
13. Visualisieren Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und setzen die Membran auf eine Autoradiographiefilm.

Ergebnisse

Die oben beschriebenen Verfahren stellen eine robuste Methode zur alternatives Spleißen während EMT erfassen. Repräsentative Ergebnisse der CD44 splice Isoform Schalt bei Twist-induzierte EMT sind nachfolgend als Beispiel angegeben.

Twist-induzierte EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen wurde durch einen Übergang von einem Kopfstein wie epitheliale Phänotyp zu einem länglichen Fibroblasten-Phänotyp (2A), das Fehlen von epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und die d...

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis des alternativen Spleißens in einem induzierbaren EMT-Modell. Als solche dynamische Veränderungen der Spleiß-Isoform-Expression im gesamten zeitlichen Verlauf der EMT erfasst werden. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der Verwendung von unterschiedlichen epithelial- oder mesenchymalen-Zelllinien, die für den Vergleich von alternativen Spleißen, weil verschiedene genetische Hintergründe aus un-verwandten Zelllinien konnte mäßig beeinflussen alternative Spleißen. A...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904	Stellen Sie eine Stammlösung her, indem Sie 4-Hydroxytamoxifen in Ethanol auf 200 μM auflösen. Halten Sie die Lösung bei -20 ° C vor Licht geschützt.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation Kit	Omega Bio-Tek	R6731	Total RNA Isolation Kit
GoScript Reverse Transcription System	Promega	A5001	Reagenz für qRT-PCR Assay
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	Reagenz für qRT-PCR Assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche		Equipment für qRT-PCR Assay
CD44 Antikörper	Forschung & Forschung D Systems	BBA10	1:1.000 Verdünnung
E-Cadherin Antikörper	Cell Signaling Technology	4065	1:2.500 Verdünnung für Immunblotting; 1:50 Verdünnung für Immunfluoreszenz
Gamma;-Catenin Antikörper	Cell Signaling Technology	2309	1:1.000 Verdünnung
Occludin Antikörper	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-5562	1:500 Verdünnung
Fibronektin Antikörper	BD Transduction Laboratories	610077	1:5.000 Verdünnung
N-Cadherin Antikörper	BD Transduction Laboratories	610920	1:2.000 Verdünnung
Vimentin Antikörper	NeoMarker	MS-129-p1	1:500 Verdünnung
GAPDH Antikörper	Millipore Corporation	MAB374	1:10.000 Verdünnung
Amasham ECL Western-Blotting-Detektionsreagenz	GE Health Life Science	RPN2209	Chemilumineszenz-System