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Beurteilung der Murine sportliche Ausdauer, ohne die Verwendung eines Shock Grid: Eine Alternative zur Zwangsübung

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DOI:

10.3791/51846

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14. August 2014

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1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Methode zur Beurteilung der Belastungsausdauer bei Labormäusen ohne die Verwendung eines Schockgitters wird demonstriert. Diese Methode ist eine humane Verfeinerung, die die verwirrenden Effekte von Stress auf experimentelle Parameter verringern kann.

Zusammenfassung

Mit Labormausmodellen werden die molekularen Signalwege für die Stoffwechselleistungen der Ausdauerbelastung verantwortlich beginnt, definiert werden. Die gebräuchlichste Methode zur Beurteilung der Ausdauerübung in Mäusen nutzt gezwungen auf einem motorisierten Laufband mit einem Schock Gitter ausgestattet läuft. Tiere, die Lauf beenden werden durch die Bewegungslaufband auf einem Raster, die einen elektrischen Fuß-Schock liefert geschoben; um den negativen Reiz nicht entziehen, die Mäuse auf dem Band laufen zurück. Allerdings können Vermeidungsverhalten und psychische Belastung durch den Einsatz einer Schockgerät mit Quantifizierung der laufenden Ausdauer, sowie verwechseln Messungen der Nachtrainingszeit Serum Hormon und Zytokin-Ebenen stören. Hier demonstrieren und validieren eine raffinierte Methode, um Ausdauer laufen in naiven C57BL / 6 Mäusen auf einem motorisierten Laufband ohne Verwendung eines Schockgitter messen wir. Wenn Mäuse auf dem Laufband preacclimated, mit Gang freiwillig laufen sie beschleunigt spezifisch für jede mouse. Die Nutzung der Schock Gitter durch sanfte Ermutigung durch einen menschlichen Bediener mit einem Spatel auf den freiwilligen Bereitschaft auf Seiten der Maus laufen gepaart mit Sensibilität ersetzt. Klar Endpunkte zur Quantifizierung Laufzeit zu Erschöpfung für jede Maus definiert und in der Verhaltens Anzeichen von Erschöpfung wie gespreizt Körperhaltung und Atemschwierigkeiten wider. Diese Methode ist eine Verfeinerung, die humane sinkt auch die verwirrende Auswirkungen von Stress auf experimentellen Parameter.

Einleitung

Übergewicht, Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes sind miteinander verknüpft Stoffwechselstörungen, die tiefgreifende Auswirkungen auf die Gesundheit der sowohl in den USA und weltweit Populationen 1-4 auszuüben. Ausdauertraining kann zu verhindern, sowie Genuss, diese Bedingungen 5,6. Darüber hinaus Beurteilung der Gehgeschwindigkeit und Ausdauer werden verwendet, klinisch als Diagnosetests für Gebrechlichkeit, Sarkopenie und die Folgen anderer Erkrankungen wie chronisch-obstruktive Lungenerkrankung, bei Menschen 7.

Die zugrunde liegenden biochemischen Wege die wohltuende Wirkung des Ausdauertrainings auf die Körperzusammensetzung und der Insulinempfindlichkeit beginnen, erläutert, mit Hilfe gentechnisch veränderter Mäuse oder pharmakologisch, die erweitert oder reduziert die körperliche Belastbarkeit 8-11 Display. Allerdings haben viele solcher Studien motorisierten Laufbänder mit Schock Gitter ausgestattet, um Mäuse zu zwingen, 8-11 laufen verwendet. Tiere, die Lauf beenden werden durch geschobendie Bewegungslaufband auf einem Raster, die einen elektrischen Fuß-Schock liefert; um den negativen Reiz nicht entziehen, die Mäuse auf dem Band laufen zurück. Solche Verfahren können psychischer Stress und Vermeidungsverhalten als Störfaktoren beeinflussen experimentellen Parameter 12 einzuführen. Andere Methoden zur Messung von Ausdauer, wie die Quantifizierung der ambulanten Tätigkeit mit einem Strahlgerät Pause oder Quantifizierung von In-Käfig Rad läuft, kann durch Modulation des Tagesrhythmus, Angst, unbeabsichtigte Training oder Essen sucht Verhalten 12-16 verwechselt werden. Darüber hinaus sind diese Verfahren erfordern einzigen Gehäuse, eine andere Quelle der psychologischen Stress für Mäuse. Daher ist eine direkte Messung der sportliche Ausdauer nicht durch Stress verwechselt benötigt.

Um diese Bedenken zu beseitigen, hat sich unser Labor entwickelt und validiert eine Methode, um eine maximale Laufleistung zu bewerten und anhaltender Laufgeschwindigkeit bei untrainierten, naiven Mäusen mit Hilfe eines motorisierten Laufband nicht equipped mit einem Schock Netz. Der Raum am Ende des Laufbandes, wo der Schock Grid meistens wohnt, wird dann zu einer Plattform für die Mäuse, um Ruhe, und bietet einen Platz für Maus, die zu laufen, bis aus der Vorrichtung entfernt sitzen zu verweigern. Mäuse sind aufgefordert, von einem menschlichen Beobachter laufen mit Antippen oder Berühren mit einem Spatel auf den freiwilligen Bereitschaft auf Seiten der Maus laufen gepaart mit Sensibilität. Diese Methode wurde verwendet, um Unterschiede in der Trainingsausdauer zwischen C57BL / 6 Mäusen gentechnisch veränderten und zu kontrollieren, die in der Expression des Zytokins Interleukin abgeleitet Muskel-15 (IL-15) 16,17 unterscheiden zu quantifizieren. Diese Methode ist eine Verfeinerung, die die humane verwirrende Effekte der negativen Verstärkung durch die Verwendung eines Raster Schock verursacht abnimmt.

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Protokoll

Das hier beschriebene Verfahren wurde von der VA Puget Sound Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und erfüllt die ILAR Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Versuchsvorbereitung

  1. Entscheiden, ob vorher Blut oder Gewebesammel bald nach dem Training erforderlich ist, und wenn ja, bestimmen die Post-Belastungs-Intervall zum Leiten solcher Verfahren. Beispiele sind die Bestimmung der Übung induzierte Hormon oder Zytokin-Freisetzung in die Zirkulation (erforderlich Blutentnahme), Bestimmung der Übung induzierte Expression von mRNA-Spezies von Interesse (erforderlich Euthanasie gefolgt von Gewebe-Sammlung). Wenn unmittelbar nach Ausübung Blut oder Gewebe Sammlung angezeigt wird, müssen Materialien für diese Verfahren auf der Hand in den Behandlungsraum. Erhalten Institutional Review Board Genehmigung und durchzuführen, gemäß der Richtlinien. Nicht alle Experimente erfordern Nachtrainingszeit Blut oder Gewebe collectiauf; Ein einfacher Vergleich der laufenden Ausdauer kann alles, was erforderlich ist.
  2. Im Voraus entscheiden, auf experimentellen Gruppen und Nachtrainingszeit Verfahren für Mäuse (Beschreibung siehe oben).
  3. Legen Sie das Laufband auf einen stabilen Tisch in einem ruhigen Raum während der laufenden Studien zu diesem Verfahren gewidmet.
  4. Stellen Sie das Laufband für Maus-Größe Gassen und mit einer Neigung entsprechend dem Protokoll. Die Neigung der +5 o wird hier verwendet, um Muskelschäden durch exzentrische Übung (Verlängerung der Muskeln zur gleichen Zeit wie Kontraktion), die während der Bergabfahrt erfolgt zu vermeiden.
  5. Ein saugfähigen Kissen unter dem Laufband, um Kot zu fangen.

2. Akklimatisierung von Mäusen auf das Laufband

Entscheiden, ob eine "sitzende" (keine Übung) Gruppe von Mäusen notwendig ist, und setzen sitzende Mäuse auf dem Laufband laufen, ohne wie in den Schritten 2.1 skizziert - 2.5. Festzustellen, ob 2 oder 4 Versuchsgruppen benötigt werden,. zB Sitzende / Übung (2 Gruppen); Ausgeübt Kontrollen / Ausgeübt Behandlung (2 Gruppen, keine sitzende Tiere); oder Sitzende / Ausgeübt x Steuer / Behandlung (4 Gruppen). Die "Behandlung" kann ein oder transgenen Knockout-Genotyp, eine pharmakologische Therapie, spezielle Diät oder anderen experimentellen Intervention.

  1. Lassen Sie die Maus, um das Verfahren in seinem Zimmer transportiert Käfig zu gewöhnen, mit Käfig Kollegen, mit 1 - 2 Stunden.
  2. Wählen Sie eine einzelne Maus und Rekord-Tag-Nummer; wiegen Maus und Rekordgewicht.
  3. Bewegen Sie die Maus in dem Laufband ohne Motor eingeschaltet, Akklimatisierung, ca. 5 min. Schalten Sie das Gerät auf, ohne Laufband läuft, und lassen Sie die Maus an die Maschine zu gewöhnen Lärm für weitere 5 min.
  4. Mäuse entfernen in der "sitzende" Gruppen (falls verwendet, siehe Anmerkung 1) aus dem Laufband an dieser Stelle und bringt sie zu ihrem Käfig oder führen nach dem Training Verfahren gemäß dem Versuchsplan (siehe Anmerkung 2).

3. Starten des Run-to-Leistungstest

  1. Nach Akklimatisierung, drehen Sie den Gurt auf eine niedrige Geschwindigkeit (10 m / min), wenn das Tier die Erkundung der Band und nicht auf der Plattform.
  2. Klopfen Sie leicht oder heben Sie die Hinterhand von der Maus mit einem Spatel, ein bis drei Mal, um nur ungern Tiere zu ermutigen, auf dem Laufband laufen und zu bleiben.
    HINWEIS: Die meisten Mäuse leicht laufen, aber sie manchmal für kurze Zeit zu stoppen. Wenn dies der Fall, verwenden Sie den Spatel vorsichtig tippen oder heben Sie den hinteren Teil des Tier um die Wiederaufnahme der laufenden Förderung. Oft haben die Mäuse nicht zu dem Zungenspatel berührt werden; bemerken die Hand mit dem Spatel auf sie zukommen bewirkt, dass die Mäuse, etwas mehr laufen.
  3. Starten Sie ein Labor-Timer, sobald die Maus in der Anfangsgeschwindigkeit von 10 m / min läuft.
  4. Drehen Sie die Geschwindigkeit langsam, wenn die Maus an der Spitze (bergauf) Ende der Gürtel, in Schritten von 1 m / min, ca. alle 2 min.
  5. Drehen Sie den Drehzahl auf dievorherige Einstellung, wenn die Maus immer wieder in kurzen Schüben verläuft und nicht in einem gleichmäßigen Tempo.
  6. Bestimmen Sie die maximale Laufgeschwindigkeit aufrechterhalten jeder Maus (in der Regel 14 bis 17 m / min für C57BL / 6 Mäuse) durch Einstellen der Geschwindigkeit und beobachten Sie die Maus. Notieren Sie sich diese Geschwindigkeit.
    HINWEIS: Die Position des Tieres auf dem Laufband Queues die Ermittler über die Bereitschaft des Tieres, bei einer höheren Geschwindigkeit. Wenn die Maus am anderen (bergauf) Ende und etwa in die Wand laufen, ist es bereit, bei einer höheren Geschwindigkeit. Wenn die Maus in konstanter Geschwindigkeit ausgeführt wird, in der Mitte des Laufbandes kann auf seine maximale Geschwindigkeit sein oder kann weiter angepasst werden müssen, abhängig von der Qualität des Laufs.

4. Endpunkte und Mäuse, die Stop-

  1. Verwenden Sie den Spatel vorsichtig tippen oder heben Sie die Hinterhand der Tiere, die zu stoppen, um die Wiederaufnahme der laufenden Förderung (siehe Anmerkung 3.2). Sie den Timer für vorübergehende Unterbrechungen läuft nicht ab.
  2. Identifizieren und remove Maus, die zu laufen verweigern. Hinweis: Dies auf dem Datenblatt. Je nach Ihrer experimentellen Design, können Mäuse, die sich weigern an einem anderen Tag erneut getestet werden
    HINWEIS: Einige Mäuse vollständig ablehnen zu laufen. Solche Mäuse wird in kurzen Stößen laufen, dann stoppen zu pflegen oder "Pedal", das heißt, sitzen auf der Plattform und nutzen ihre Vorderbeine auf dem Band. Die Haltung dieser Mäuse ist gebeugt, mit allen vier Füßen unter das Tier eingepflanzt, um nicht wieder auf dem Laufband durch den Spatel gedrückt halten. Gelegentlich eine Maus wird aggressiv gegenüber der Spatel, wenn nicht bereit zu laufen, beißen die Spatel oder Klettern bis es als eine Möglichkeit der Flucht. Es ist klar, innerhalb der ersten 5 Minuten der Studie, ob die Maus, oder wird sie nicht, laufen. Mäuse, die aus der Analyse laufen ablehnen, aber nicht zählen sie als "sitzende" Mäuse zu entfernen.
  3. Identifizieren erschöpft Mäusen und stoppen Sie den Timer.
    HINWEIS: Erschöpfung wird von drei aufeinanderfolgenden Haltestellen und Ablehnung der Wieder definiertSume trotz sanfte Ermutigung, sowie körperliche Anzeichen von Erschöpfung wie erschwerte Atmung und Körperhaltung gespreizt läuft. Mäuse erholen sich von Erschöpfung innerhalb von 30 bis 60 min.
  4. Notieren Sie den Gesamtbetrag der Zeit läuft bei allen Geschwindigkeiten.
  5. Abhängig von der Versuchsplanung, entweder die Maus zurück in seinen Käfig, oder Verhaltensweisen sofort Nachtrainingszeit Verfahren wie Blut oder Gewebe Sammlung nach den Richtlinien des Instituts.
  6. Wischen Sie den Gurt sauber und mit einer keimtötenden Tuch nach der Prüfung jeder einzelnen Maus, so dass der Duft des vorherigen Maus nicht beeinflussen Verhalten der nachfolgenden Mäusen getestet.
  7. Testen Sie die nächste Maus. Verwenden Sie eine frische Spatel für jede Maus. Mäuse, die im selben Käfig aufhalten können nacheinander am selben Tag getestet werden, ohne zusätzliche Akklimatisierung an dem Eingriffsraum.

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Ergebnisse

Dieses Verfahren zum Messen von Übungsausdauer spiegeln genau die molekularen und Stoffwechselprofil von verschiedenen Stämmen von C57BL / 6 Mäusen, die in der Expression des Zytokins IL-15 16,17 abweichen. Transgene Mäuse, die eine Überexpression von IL-15 (IL-15 TG-Mäuse) eine deutlich Run-to-Erschöpfung Zeiten im Vergleich zu Kontrollen erhöht Wurf, während Mäuse, die IL-15 (IL-15-KO-Mäuse) aufweisen fehlt Laufzeiten deutlich vor Erreichen reduziert Erschöpfung (Abbildung 1A). Veröffentlic...

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Diskussion

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur freiwilligen Lauf Ausdauer in Mäusen zu bewerten unter Verwendung eines motorisierten Laufband ohne Verwendung eines Schockgitter. Diese Methode kann die Unterschiede zwischen Unterlinien von C57BL / 6 Mäusen, die in der Expression des Zytokins IL-15, was wiederum bewirkt, dass Unterschiede in der Expression von Faktoren, die Übungsausdauer 16,17 zugrunde unterscheiden offenbaren. Im Einklang mit den Grundsätzen der "drei R" in der Versuchstierkunde, kann dies...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Unterstützt von Merit Bewertung # BX001026 aus dem Department of Veterans Affairs (LSQ), und die Nutzung von Ressourcen und Einrichtungen bei VA Puget Sound Health Care System, die transgene Ressourcenkern an der Universität von Washington Nathan Shock Center of Excellence in der biologischen Grundlagen des Alterns (NIA # 5P30AG-013280) und der University of Washington Diabetes Endokrinologie Research Center (NIH # P30 DK-17047). Wir danken Cynthia Pekow DVM und Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, vorausgesetzt, hilfreiche Kommentare zum Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Offenes Nagetier-Laufband Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMDiese Katalognummer gilt für Modelle ohne Stoßgitter. Stoßgitter können bei älteren Modellen manuell entfernt werden (Eco 3/6)
Sani Cloth Keimtötende TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYwerden normalerweise über eine örtliche Einrichtung bestelltEnthält 10% Isopropylalkohol; jedes gleichwertige Produkt kann verwendet werden.
ZungenspatelJeder lokale Lieferant
LabortimerJeder Lieferant
IL-15 TG Mäuse*JAX, Bar Harbor, ME011002Maus IL-15-Transgen, exprimiert von modifiziertem humanem alpha-skelettalem Aktin-Promotor mit veränderter Signalsequenz zur Erleichterung der Sekretion.
C57BL/6J-Mäuse (Wildtyp)*JAX, Bar Harbor, ME000664Kontrollmäuse für IL-15 TG
IL-15 KO-Mäuse*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MHomozygote IL-15 "Knockout"-Mäuse auf C57BL/6 Hintergrund
C57BL/6NTac (Wildtyp)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MKontrollmäuse für IL-15 KO
*Optional; Mauslinien und Behandlungen können spezifisch für die experimentelle Protokoll.

Referenzen

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