Eine neue Methode der Drug Administration auf mehrere Zebrafisch ( Danio rerio) Und die Quantifizierung der Widerrufs

Zusammenfassung

Eine neuartige Methode zur Verringerung der Variabilität bei der Exposition von Fischen gegenüber Drogen wird erläutert. Bei Fischen, die verschiedenen Mustern der Ethanolexposition ausgesetzt waren, wurde in einem Hell/Dunkel-Scototaxie-Assay festgestellt, dass sie während des Entzugs ein verändertes Angstniveau aufwiesen.

Zusammenfassung

Angsttests bei Zebrafischen werden oft in Kombination mit der Anwendung pharmakologischer Substanzen untersucht. In diesen Studien werden die Fische routinemäßig mit Netzen versehen und zwischen Heimaquarien und Dosierbecken transportiert. Um die Verabreichung von Verbindungen zu erleichtern, wurde eine neuartige Methode für den Transfer von Fischen zwischen Tanks zur Arzneimittelverabreichung entwickelt. Einsätze, die für das Laichen bestimmt sind, wurden verwendet, um Gruppen von Fischen in die Wirkstofflösung zu überführen, was eine genaue Dosierung aller Fische in der Gruppe ermöglichte. Dies erhöht die Präzision und Effizienz der Dosierung, was bei langen Zeitplänen wiederholter Arzneimittelverabreichung sehr wichtig ist. Wir haben dieses Verfahren für eine Studie implementiert, in der das Verhalten von Zebrafischen im Hell-Dunkel-Test nach Verabreichung von Ethanol mit unterschiedlichen 21-Tage-Schemata untersucht wurde. Bei Fischen, die täglich moderaten Mengen Alkohol ausgesetzt waren, gab es einen signifikanten Unterschied in der Standortpräferenz nach 2 Tagen Entzug im Vergleich zur Kontrollgruppe. Ein signifikanter Unterschied in der Standortpräferenz in einer Gruppe, die einer wöchentlichen Binge-Verabreichung ausgesetzt war, wurde jedoch nicht beobachtet.

Dieses Protokoll kann verallgemeinert werden für die Verwendung mit allen Arten von Verbindungen, die wasserlöslich sind, und kann in jeder Situation verwendet werden, in der das Verhalten von Fischen während oder nach langen Verabreichungsplänen untersucht wird. Der Hell-Dunkel-Test ist auch eine wertvolle Methode, um entzugsbedingte Veränderungen der Angst zu beurteilen.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein kleines Knochenfisch-Arten mit Ursprung in Indien, die eine sinnvolle Modellorganismus für Verhaltens ¹ und medizinischen Forschung ^2,3 ist. Zebrafische sind auch häufig bei der Prüfung von verschiedenen pharmakologischen Substanzen eingesetzt, um deren Auswirkungen auf das Verhalten zu charakterisieren. Verschiedenen Dosierungen und Zeitpläne der Arzneimittelverabreichung verwendet worden, um das Verhalten der Zebrafisch nach der Verabreichung von Verbindungen, wie Stimulanzien ^4, Anxiolytika ⁵ und Ethanol ^6-8 zu untersuchen.

Unser Labor hat die Auswirkungen der unterschiedlichen Zeitpläne der Ethanol-Administration an Zebrafischen Angst und Fortbewegung in der gut validierten Hell / Dunkel-Assay ^{9, 20,} auch gemeinhin als scototaxic Assay bezeichnet sucht. Eine neue Methode der Ethanol-Verabreichung wurden entwickelt, um die Effizienz für wiederholte tägliche Verabreichung über einen langen Zeitraum (21 Tage) ⁶ zu erhöhen . Bisher verwendete Methoden waren praktisch, allerdings haben wir versucht, eine Methode, die Netting reduziert, mit den damit verbundenen Einmalkosten entwickeln und erlaubt die gleichzeitige, zeitgenaue Verabreichung des Arzneimittels von Interesse, eine große Anzahl von Fischen. In der traditionellen Forschung mit Ethanol, Zebrafisch saldiert und von einem Tank zum anderen, die die geeignete Mischung aus Ethanol und Wasser ^10-12 übertragen. Während diese Methode ist weitgehend akzeptiert, kann Netting Zebrafisch die Variabilität in der Zeit, die die Einführung und entfernen Sie den Fisch aus der Wirkstofflösung zu erhöhen. Daher kann die genaue Exposition gegenüber der Verbindung von Interesse im Verlauf eines Experiments mit wiederholter Dosierung variieren. Eine Methode, die Fehlerquellen die sich aus Schwankungen der Transportzeiten reduziert ist daher wünschenswert. Mit unserer Methode können wir alle Fische gleichzeitig zu bewegen, was zu identischen Dosierung Zeit in jedem Fisch. Nach Ethanolexposition (hier beschrieben), können Zebrafisch in jeder numbe getestet werdenr von Verhaltenstests, einschließlich derjenigen, die Angst zu bewerten. Dosierungsgruppen von Fischen mit der neuen Methode hat praktische Anwendungen jenseits der Fähigkeit, genau zu replizieren und zu standardisieren Dosierung zwischen Subjekten und zwischen Gruppen von Fischen. Das Aufkommen der neuen Software, die für die Verfolgung mehrerer Fisch ermöglicht auf einmal sehen können Forscher nutzen unsere Methoden, um Reproduzierbarkeit und Genauigkeit in ihren Experimenten zu gewährleisten. Angesichts der weit verbreiteten Einsatz von Zebrafisch als Modellorganismus für Behavioral Neuroscience, wird diese Methode Effizienz und Praktikabilität in Zukunft pharmakologische Studien zu erhöhen.

Im vorliegenden Paradigma wurde eine wiederholte Dosierungsschema verwendet, dass etwa spiegelt menschliche Trinkpläne. Anlage, täglicher-mäßig oder Wochen-Binge: Die Fische wurden randomisiert einer von drei Gruppen zugeordnet. Das Dosierungsschema war 21 Tage in der Dauer, gewählt, weil es deutlich Belichtungszeiten in früheren Studien ⁷ überschritten. Kontrollfische erhielten Null alcohol, erhielten täglich mäßiger Fisch 0,2% Alkohol einmal pro Tag, und Wochen-binge Fische erhielten 1,4% Alkohol einmal pro Woche. Der Hell / Dunkel Aufgabe wurde verwendet, um Angst nach 2 Tagen Widerrufs beurteilen. Dies ist ein relativ einfacher Test, um zu verwalten, welche einen rechteckigen Arena, in der die Wände auf einer Seite weiß und auf der anderen Seite sind dunkel ⁹ verwendet. Erwachsenen Zebrafisch lieber robust die dunkle Seite der Arena unter Kontrollbedingungen ^6,9,13. Erhöhte Angst operational als deutlich mehr Zeit in der dunklen Zone verbracht definiert und verminderte Angst kann davon ausgegangen, wenn die Fische relativ mehr Zeit in der Lichtzone verbracht verbringt werden. Mit bewegungs Tracking-Software können auch andere informative Variablen auch quantifiziert werden, einschließlich Durchschnittsgeschwindigkeit, Immobilität, mäandernden und Zonenübergänge ^14.

Die in unserem Labor entwickelt Dosierverfahren kann zu jeder Forschungs in denen wasserlösliche Verbindungen sind, eine oder mehrere zebrafi verabreicht geltensh. Viele andere pharmakologische Mittel, die von dieser Methode profitieren können, sind derzeit im Zebrafisch getestet. Häufigsten getesteten Verbindungen umfassen Nikotin, Chlordiazepoxid, Buspiron und Scopolamin, die in ähnlicher Weise wie in Ethanol gelöst; durch Vermischen der geeigneten Menge der Chemikalie in Wasser. Deshalb ist die allgemeine Aufgabe der vorliegenden Verfahren viel breiter und nicht beschränkt auf Ethanol. Außerdem nach der Gabe von Medikamenten für mehrere Tage, ist die Hell / Dunkel-Aufgabe nur eine von vielen Verhaltenstests, die eingesetzt werden könnten. Nach Verabreichung des Arzneimittels oder bei der Entnahme, anderen beliebten Assays, die verwendet werden können, gehören die neuartigen Tank Tauchtest ¹⁵ und Tests des Sozialverhaltens wie shoaling ^16. Das folgende Verfahren wird ein effizientes Verfahren zum wiederholten Übertragung Fischgruppen oder einzelne Fische in Lösungen, die eine pharmakologische Verbindung von Interesse zu skizzieren. Zusätzlich wird der Prozess der Prüfung Angst mit der Hell / Dunkel-Testin Gruppen von Fischen, die, nachdem sie lange Listen der Alkoholverwaltung ausgesetzt, der zur Rücknahme sind, beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren und Verhaltenstests wurden von MacEwan University Animal Research Ethics Board unter Protokollnummer 06-11-12, die nicht im Einklang mit dem kanadischen Rat für Richtlinien Animal Care ist für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren ist genehmigt.

1. Bereiten Dosierbehälter, Lösungen und Applikationsplan

1. Bereiten Sie eine Verabreichungsschema, so dass die Tiere in der gleichen Umgebung und während der gleichen Zeit des Tages, um alle verwechselt der Zeit oder Vorspann auf visuelle Reize zu vermeiden dosiert.
2. Zu erhalten, wie viele identische, 1,5 L, klare Polypropylen Laichbehältern für die Anzahl der Gruppengrößen wie nötig. Verwenden Sie Gruppen von 8 Fischen pro Behälter, die für 2 Gruppen von Fischen erlaubt, pro Tag später im Verfahren geprüft werden (siehe Schritt 3). Verwenden Sie eine Haltetank und ein Dosierbehälter pro Gruppe (2x Gesamtzahl der Gruppen).
   1. Zeigen 400 um Laich Einsätze in allen Haltetanks. Fill die Tanks mit Lebensraum Wasser oder Umkehrosmosewasser bei der richtigen Temperatur (für Zebrafisch, 25-28 ° C), die im Einklang mit der Temperatur Fisch ist in der Regel bei untergebracht.
      HINWEIS: Es können unerwünschte chemische Wechselwirkungen zwischen einigen Drogen und die chemischen Komponenten der gepufferten Lebensraum Wasser sein. In dieser Situation verwenden Umkehrosmose mit minimalen oder keinen Aquarium Salze zur Verabreichung des Arzneimittels gepuffert, als auch für die Kontrollgruppen.
   2. Sicherzustellen, daß die Behälter in einer neutralen Umgebung Anlage Fisch externe visuelle Reize bei der Dosierung zu vermeiden.
3. Bereiten Sie die Medikamentenlösung. Mischen Sie die entsprechende Menge des Arzneimittels mit Lebensraum Wasser in den Laichbehältern. Bereiten Sie die 0,2% ige Ethanollösung durch die Kombination von 3 ml einer hochgradigen Ethanol (95% nicht denaturierten Ethanol) mit 1497 ml Wasser. Vorbereitung der 1,4% igen Ethanollösung durch Kombinieren von 21 ml Ethanol mit 1,479 ml Wasser.

2. Netting Fische und Ethanol Verwaltungsordnung

1. Sorgfältig Netto Fische aus ihrem Lebensraum Tanks und Überführung in die entsprechenden Vorratstank, der die Laicheinsatz. Idealerweise beherbergen die Fische in der Laich Einlage zusammen beseitigen Netting.
2. Mit aller Fische in ihren jeweiligen Haltetanks, heben die Laicheinsatz aus dem Auffangbehälter und legen Sie sie in den entsprechenden Tank Wirkstofflösung (Abbildung 1A).
   1. Notieren Sie die Dosierzeit nach Bedarf. Verwenden 30 min in der Ethanol-Lösung für das hier beschriebene Verfahren.
   2. Wenn möglich, haben Assistenten helfen bei der Übertragung aller Versuchsgruppen auf die Arzneimittellösung gleichzeitig auf eine genaue Dosierung zu gewährleisten. Alternativ übertragen eine Gruppe zu einem Zeitpunkt und zu verfolgen, einzelne Gruppen 'Dosierzeiten (Abbildung 1A).
3. Am Ende der erforderlichen Dosierungsperiode, entfernen Sie den Fisch aus der Ethanollösung durch vorsichtiges Anheben des Laicheinsatzaus der Wirkstofflösung und Platzierung sanft zurück in den Vorratsbehälter.
4. Sanft Netto die Fische in den Haltetanks und legen Sie sie zurück in ihren Lebensräumen bis zum nächsten geplanten Dosierung Zeit, oder legen Sie das Laich einfügen zurück in den Vorratsbehälter zu Netting beseitigen.
5. Wie vorher, wenn möglich innerhalb der Parameter der Tierhaltungsgeräte, Haus die Tiere in demselben Tank und Laicheinsatz, der als Haltetank verwendet wird erwähnt. Dies wird zusammen beseitigen während der Verwaltungsverfahren Netting.

3. Behavioral Testing

1. Besorgen Sie sich eine hell / dunkel-Arena 9,5 cm breit und 55 cm lang und 9,5 cm tief mit einem weißen wasserdichten Boden (Abbildung 1B). Bringen weiß und schwarz wasserdicht entspiegeltes Papier an den Innenwänden der Arena mit Klettverschluss, mit der Hälfte der Arena abgedeckt in weiß und halb in schwarz abgedeckt. Füllen Sie die Arena zu einer Tiefe von 5 cm mit Lebensraum Wasser mit einer Temperatur von 25-28 ° C. Maintain diese Temperatur während des Tests.
2. Minimalize externe visuelle Reize, indem er eine weiße dreiseitigen Gehäuse für die Arena in entfernt werden. Stellen Sie sicher, das Testgebiet hat diffundieren Deckenbeleuchtung, die nicht Reflexionen auf der Wasseroberfläche hervorruft, noch ausreichend hell für die Bewegung Tracking-Software, oder senden -hoc manuelle Quantifizierung von Videobildern.
3. Legen Sie die Arena in das Gehäuse und setzen Sie die Aufzeichnung und Bewegungsanalyseparameter des Verhaltens-Tracking-Software. Legen Sie die Testdauer auf 5-15 min, je nach Fragestellung.
   HINWEIS: Hier verwendeten wir 5 min.
4. Transportieren Sie die Gruppe der Fische auf den Forschungsbereich in den Lebensraum Tank getestet werden und legen Sie sie außerhalb der Arena Gehäuse. Akklimatisieren Sie den Fisch für 10 min.
5. Sanft Netto ein Fisch aus der entsprechenden Gruppe und in der Mitte der Hell / Dunkel-Arena, wobei Sie auf den Fisch zu lösen, wenn sie parallel zu der langen Achse der Arena positioniert, um AVOid Vorspannen der Fisch auf den hellen oder dunklen Zone.
6. Starten Sie die Aufnahme Verhalten sofort nachdem das Tier losgelassen wird. Achten Sie auf jegliche Softwareprobleme bei der Verfolgung der Fisch oder für Fische springen oder Gefrieren. Drehen der Arena 180 ° nach der Hälfte der Probanden wurden getestet, alle verwechselt zu verhindern wegen Verzerrungen, die sich aus dem Ende der Arena wird zum offenen Ende des Gehäuses ausgerichtet ist.
7. Nach Ablauf der Test hat, sanft net beendet und entfernen Sie den Fisch aus der Arena in einen Vorratstank oder Lebensraum Tank.

4. Analyse

1. Untersuchen Zeit in Licht verbrachte gegen Dunkelzonen. Für jede Gruppe und jeden Fisch, erhalten die relative Zeit in den hellen und dunklen Zonen verbracht und zu analysieren, mit einem eine Probe t-Test (oder Wilcoxon-Test für nicht-parametrische Daten; Unterschied (die Hälfte der gesamten Probezeit) 150 sec) zu ermitteln, ob Gruppen ein Bereich über den anderen deutlich bevorzugen.
2. Um Einstellungen zu vergleichen, berechnen preferenzIndex durch Subtrahieren der Zeit entsprechend der Zone von der Zeit, in der dunklen Zone aufgewendet und vergleichen Unterschiede zwischen den Gruppen. t- Tests können verwendet werden, um zwei Gruppen zu vergleichen. Vergleichen Sie mehrere Gruppen mit einer Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten).
3. Vergleichen Geschwindigkeit, Anzahl der Zonenübergänge, mäandernden, und Unbeweglichkeit in Gruppen. Verwenden Sie Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten).

Ergebnisse

Um die Genauigkeit und die Steuerung in pharmakologischen Studien mit Zebrafisch ist es wichtig, wenn die Dauer der Verabreichung Ethanol konsequent und genau wie oben beschrieben erhalten. Unsere Vorgehensweise kann die Leichtigkeit und den Durchsatz des Dosierungsverfahren zu erhöhen. Die Verabreichung von Ethanol auf entweder eine wöchentliche-binge oder täglich mäßiger Plan führte zu veränderten Angst Ebenen, mit der Hell / Dunkel-Test gemessen, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wenn zwei Tage nach der letzten Dosier...

Diskussion

Vorherige Studien mit Medikamentenverabreichung im Zebrafisch haben einfach auf Netting Fische, um sie aus ihrer Heimat Tank in der Arzneimittellösung ^12,16 transportieren verlassen. Netting ist nicht immer konsistent und dauert oft länger als aufgrund der Fluchtreaktion der Zebrafisch, die erhebliche individuelle Variabilität hat erwartet. Traditionelle Methoden der Übertragung, während nützlich, können auf durch Verringern der Menge der Gesamtzeit der Fisch außerhalb des Wassers zu verbringen, als auch die ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dreischaliges Labormöbel-Beherbergungssystem	Aquatic Habitats	N/V
1,5-L-Laichbecken mit 400 μm-Baffel	Aquatic Habitats	N/V
Reiner Getreidealkohol	Luxco, INC	N/V
Ethovision XT-Bewegungsverfolgungssoftware	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Hell/Dunkel-Arena	Individuell angefertigt		Wie im Verfahren beschrieben herstellen. 9,5 cm breit, 9,5 cm tief, 55 cm lang.