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Biology

पौधों और हरी शैवाल का प्रकाश कटाई परिसर के इन विट्रो पुनर्गठन में

Published: October 10, 2014 doi: 10.3791/51852
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physics and Astronomy, VU University Amsterdam

Abstract

पौधों और हरी शैवाल में, प्रकाश प्रकाश कटाई परिसरों (LHCs), chlorophylls और कैरोटीनॉयड समन्वय कि अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के एक परिवार ने कब्जा कर लिया है. में विवो, इन प्रोटीनों thylakoid झिल्ली में डाला जाता है जो परिसरों के लिए फार्म पिगमेंट के साथ जोड़ रहे हैं क्लोरोप्लास्ट की. साथ में वे आसानी से अलगाव के दौरान पिगमेंट खो सकते हैं कि इस तथ्य के साथ परिवार के सदस्यों के रासायनिक और भौतिक गुणों में उच्च समानता, एक देशी राज्य में उनकी शुद्धि चुनौतीपूर्ण बना देता है. LHCs के सजातीय तैयारी प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण यह देशी की है कि इसी तरह के गुणों के साथ परिसरों में जिसके परिणामस्वरूप, शुद्ध पिगमेंट और सामने आया apoproteins से शुरू विट्रो में इन परिसरों पुनर्गठित करने के लिए संभव था कि पता चला है, जो 1987 में 1 Plumley और श्मिट द्वारा विकसित किया गया था परिसरों. यह इन विट्रो के लिए जीवाणु व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करने के लिए रास्ता खोला (जैसे, वर्णक बाध्यकारी साइटों) या प्रोटीन डोमेन (जैसे, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, तह) की भूमिका. यह विधि कई प्रयोगशालाओं में अनुकूलित और प्रकाश कटाई परिसरों की सबसे करने के लिए लागू किया गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता विट्रो में प्रकाश कटाई परिसरों पुनर्गठन की विधि का विवरण और विधि के आवेदन का वर्णन उदाहरण प्रदान की जाती हैं.

Introduction

पौधों और शैवाल का संश्लेषक तंत्र अभिन्न झिल्ली (सीएचएल एक) क्लोरोफिल एक बाँध कि प्रोटीन, बी (सीएचएल ख) और कैरोटीनॉयड (कार) शामिल हैं. ये वर्णक प्रोटीन परिसरों कटाई प्रकाश ऊर्जा और यह आरोप जुदाई 2 को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है जहां प्रतिक्रिया केन्द्रों तक कि उत्तेजना ऊर्जा में परिवर्तित करने में सक्रिय हैं. उन्होंने यह भी उच्च प्रकाश क्षति 3,4 से संश्लेषक तंत्र की रक्षा है कि नियामक प्रतिक्रिया तंत्र में शामिल किया जाता है. प्रकाश कटाई परिसरों (LHCs) पौधों और शैवाल 5 में संबंधित प्रोटीन के एक बड़े परिवार के शामिल हैं.

परिवार के प्रत्येक सदस्य के सजातीय शुद्धि परिसरों की अत्यधिक समान रासायनिक और भौतिक गुणों से जटिल कर दिया गया है. इसके अलावा, शोधन प्रक्रियाओं अक्सर ऐसे लिपिड के रूप में पिगमेंट या अन्य संभावित सहकारकों की हानि में परिणाम. इन विट्रो पुनर्गठन प्रतिनिधिटीएस एक शक्तिशाली तरीका इन समस्याओं को दूर करने के लिए. द्वितीय Photosystem (LHC II) के साथ जुड़े LHC पहले शोधकर्ताओं संयंत्र क्लोरोप्लास्ट से अलग delipidated प्रोटीन और pigments निकाले. 1987 1 में Plumley और श्मिट ने इन विट्रो में पुनर्गठन किया है, और फिर लिथियम की उपस्थिति में पिगमेंट के साथ गर्मी विकृत प्रोटीन जोड़ दिया गया था ठंड और विगलन 1 के तीन चक्रों के बाद dodecyl सल्फेट (एलडीएस),. वे पुनर्गठन LHC परिसरों के वर्णक्रम गुण पौधों से शुद्ध परिसरों के लिए बहुत समान थे कि पता चला है. जीवों से शुद्ध परिसरों को अलग करने में कठिनाई के साथ, कारण कुछ निहित आत्म विधानसभा की सुविधा के लिए LHC वर्णक प्रोटीन परिसरों, संभावना पुनर्गठन की आसानी, अन्य शोधकर्ताओं द्वारा विधि के त्वरित गोद लेने के लिए नेतृत्व किया. Escherichia कोलाई (ई कोलाई) में overexpressed संश्लेषक प्रोटीन का पुनर्गठन 1990 6 में Paulsen और उनके सहयोगियों द्वारा प्राप्त किया गया था. ई मेंकोलाई, overexpressed झिल्ली प्रोटीन आम तौर पर शामिल किए जाने के शरीर में निहित हैं जो सुविधाओं उनकी शुद्धि. पुनर्गठन प्रोटीन तह शुरू की जो pigments के अलावा द्वारा पीछा LDS की उपस्थिति में पुनः संयोजक प्रोटीन युक्त समावेश निकायों की गर्मी विकृतीकरण के माध्यम से हासिल की है. LHCII परिसर की तह एक दो कदम प्रक्रिया है: पहला, क्लोरोफिल एक कम से कम 1 मिनट में ही है; दूसरा, क्लोरोफिल बी कई मिनट पर 7 बाध्य और स्थिर है.

तह गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis के साथ संयुक्त विट्रो पुनर्गठन में विशिष्ट एमिनो स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण एसिड (जैसे, 8,9) या वर्णक समन्वय की पहचान की अनुमति दी है (उदाहरण के लिए, 10). ऐसे वर्णक रचना या डिटर्जेंट के रूप में मानकों का समायोजन करके शर्तों refolding का हेरफेर भी तत्वों के महत्वपूर्ण पहचान की हैऐसे LHCII जटिल के लिए Xanthophylls की आवश्यकता के रूप में उचित तह, एल (जैसे, 1,11). इसके अलावा, परिसरों के लिए बाध्य व्यक्तिगत पिगमेंट की संपत्तियों की जांच विवो में पुनर्गठित परिसरों का उपयोग संभव हो गया है (उदाहरण के लिए, 10).

यहाँ वर्णित विधि pigments के अलगाव (chlorophylls और कैरोटीनॉयड) पालक से और हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii के साथ शुरू होता है. ई से एक LHC प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि शामिल किए जाने के शव के रूप में कोलाई तो नी आत्मीयता स्तंभ द्वारा LHC के पुनर्गठन और बाद शुद्धि के बाद, विस्तृत है. अंतिम चरण में, पुनर्गठन परिसरों आगे मुक्त पिगमेंट और सामने आया apoprotein दूर करने के लिए sucrose ढाल centrifugation द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल से अधिक विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा पेश किया गया है कि कई संशोधनों को शामिल एक अनुकूलित प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता हैसमय 1,6,10,12 -14.

Protocol

पालक की पत्तियों से 1 कुल वर्णक निकालना

  1. ठंड पीस बफर के 100 मिलीलीटर में पालक की पत्तियों (~ 20 ग्राम) की एक मुट्ठी homogenize 20 सेकंड के लिए एक ब्लेंडर का उपयोग (1 टेबल देखें).
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1500 XG पर 20 माइक्रोन और अपकेंद्रित्र छानना की एक ताकना व्यास के साथ नायलॉन कपड़े का एक दो परतों के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.
  3. एक नरम कलाकारों के साथ क्लोरोप्लास्ट युक्त गोली ठंड धो बफर के 1 मिलीलीटर में ब्रश पेंट Resuspend (1 टेबल देखें). गोली resuspended है एक बार, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर धो बफर और अपकेंद्रित्र के 50 एमएल समाधान जोड़ने.
  4. धो बफर के 50 एमएल में गोली (thylakoids) resuspend धीरे सतह पर तैरनेवाला निकालें और (1 टेबल देखें).
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटायें. इस बिंदु पर, रंग ऑक्सीकरण से बचने के लिए, अंधेरे में निम्नलिखित कदम बाहर ले. ना 2 सीओ 3 के साथ बफर 80% एसीटोन की 20 मिलीलीटर पिगमेंट निकालने के लिए (1 टेबल देखें) ~ जोड़ें. कभी कभी vortexing, 10 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान के लिए छोड़ दें.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा सेलुलर घटक गोली.
    नोट: पिगमेंट पूरी तरह से निकाला नहीं कर रहे हैं, गोली एक हरे रंग की है और 1.6 दोहराया जाना चाहिए कदम होगा.
  7. एक जुदा कीप में सतह पर तैरनेवाला लीजिए. , Diethylether की 0.4 संस्करणों जोड़ें सख्ती से हिला और गैस बाहर निकलने के लिए वाल्व खुला.
  8. 0.33 एम NaCl के 0.8 संस्करणों जोड़ें और सख्ती मिश्रण. परतों को अलग करने के लिए ~ 10 मिनट की अनुमति दें. शीर्ष पर आकाश चरण निकाले पिगमेंट शामिल हैं. स्पष्ट निचले चरण निकालें.
    नोट: जुदाई स्पष्ट नहीं है, स्थिर और चरण जुदाई में सुधार करने के लिए समाधान पिघलना.
  9. एक उपयुक्त ग्लास कंटेनर में जुदा कीप के ऊपर से गिरने से आकाश निकालें. ग्रान के एक चम्मच जोड़कर सूखीular निर्जल सोडियम सल्फेट. समाधान भंवर और आकाश से पानी को अवशोषित करने desiccant के लिए ~ 5 मिनट की अनुमति है.
    नोट: सोडियम सल्फेट पूरी तरह से एक साथ clumped प्रकट होता है इस चरण को दोहराएँ; आकाश पर्याप्त सूख जाता है जब कुछ मुक्त अस्थायी क्रिस्टल होना चाहिए. एक पानी परत रूपों, तो अतिरिक्त निर्जल सोडियम सल्फेट जोड़ने से पहले एक पाश्चर pipet के साथ इस को हटा दें.
  10. पीछे सोडियम सल्फेट ठोस छोड़ने, एक नया ग्लास कंटेनर के लिए आकाश छानना.
  11. एक रोटरी speedvac में या एन 2 की एक धारा के तहत आकाश लुप्त हो जाना.
  12. 100% एसीटोन के 10 एमएल में पूरी तरह से पिगमेंट भंग.
  13. 80% एसीटोन के 1 मिलीलीटर में एक छोटी राशि (~ 3 μl) पतला और अवशोषण स्पेक्ट्रा उपाय और Porra एट अल द्वारा वर्णित विधि के साथ Chl ए / बी अनुपात और Chl एकाग्रता का निर्धारण. (1989) 15.
  14. एसीटोन है जब तक विभाज्य और एक रोटरी speedvac में या 2 एन धारा के तहत पिगमेंट सूखीपूरी तरह से सुखाया. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे पिगमेंट स्टोर.

पालक से carotenoids के 2 निकालना

  1. कदम 1.1-1.5 का पालन करें. इस बिंदु पर, रंग ऑक्सीकरण से बचने के लिए, अंधेरे में निम्नलिखित कदम बाहर ले.
  2. पिगमेंट निकालने के लिए ना 2 सीओ 3 (1 टेबल देखें) के साथ बफर ~ 50 मिलीलीटर 96% इथेनॉल में thylakoid गोली Resuspend. 5 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान के लिए छोड़ दें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा सेलुलर घटक गोली.
    नोट: पिगमेंट पूरी तरह से निकाला नहीं कर रहे हैं, गोली एक हरे रंग की है और 2.2 दोहराया जाना चाहिए कदम होगा.
  4. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और (w / v) साबुन बनाने का काम शुरू करने के लिए 80% KOH के 0.1 मात्रा में जोड़ें.
  5. 4 डिग्री कंपनी / एन पर समाधान छोड़ दो, कसकर छाया हुआ है और प्रकाश से सुरक्षित.
  6. एक जुदा कीप में घोल लीजिए. Diethyl ईथर के 1 मात्रा जोड़ें और धीरे मिश्रण.
  7. 0.8 वॉल्यूम जोड़ें0.33 एम NaCl के umes और धीरे मिश्रण. परतों को अलग करने के लिए ~ 10 मिनट की अनुमति दें. शीर्ष पर नारंगी आकाश चरण saponified carotenoids शामिल हैं. कीप का पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से draining द्वारा हरी कम चरण निकालें.
  8. पानी के 3 खंडों जोड़ें और पोटेशियम हाइड्रोक्साइड दूर करने के लिए धीरे मिश्रण. परतों को अलग करने की अनुमति दें. नोट: ऊपरी चरण बादलमय प्रकट होता है, NaCl की एक छोटी राशि जोड़ (जैसे, 3 समाधान की 200 मिलीलीटर में NaCl के छ) और धीरे ज़ुल्फ़ भंग करने के लिए.
  9. कीप का पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से draining से कम चरण निकालें.
  10. पालन ​​1.10-1.13 कदम.
  11. 80% एसीटोन के 1 मिलीलीटर में एक छोटी राशि (~ 3 μl) पतला और 80% एसीटोन में 440 एनएम पर अवशोषण स्पेक्ट्रा उपाय. एकाग्रता का निर्धारण, carotenoids के लिए औसत गुणांक विलुप्त होने का उपयोग निम्न सूत्र में 16 (440 = 255 ε): कार [मिलीग्राम / एमएल] = (ABS 440 एनएम / 225) x 11 (ऑप्टिकल पथ) = 1 सेमी.
  12. विभाज्य और carotenoi सूखीएक speedvac में या सभी diethylether तक 2 एन धारा के तहत डी एस सुखाया गया है. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे पिगमेंट स्टोर.

Chlamydomonas से 3 कुल वर्णक और कैरोटीनॉयड निकालना reinhardtii

  1. सी बढ़ो सतह पर तरल संस्कृति की एक छोटी राशि के प्रसार के द्वारा एक पेट्री डिश में ठोस नल मध्यम 17 पर reinhardtii. 20 μmol तस्वीरें पीएसए एम -2 सेकंड के सतत रोशनी प्रवाह के अधीन हो जाना -1 कोशिकाओं के एक हरे रंग की परत दिखाई देता है जब तक.
  2. एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग, सी की एक छोटी राशि फसल ठोस नल मध्यम से reinhardtii और एक 1 एल कुप्पी में नल मध्यम 17 की 500 मिलीलीटर में कोशिकाओं डाल दिया. 20 μmol तस्वीरें पीएसए एम -2 सेकंड की एक सतत रोशनी प्रवाह के तहत 170 आरपीएम आंदोलन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति विकसित -1.
  3. 5-6 दिनों के बाद, संस्कृति लघुगणक चरण के अंत तक पहुँचना चाहिए (6 x 10 6 सेल / एमएलया 750 एनएम पर 2-2.5 ऑप्टिकल घनत्व). 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4000 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र.
  4. कुल वर्णक निकासी के लिए, कदम 1.6-1.15 का पालन करें.
  5. सी का पूर्ण विकास संस्कृति की 500 मिलीलीटर से शुरू कुल वर्णक निकालने की उपज reinhardtii + बी / मिलीलीटर 0.5 मिलीग्राम सीएचएल एक की एकाग्रता के साथ समाधान का लगभग 5 मिलीलीटर है.
  6. Carotenoids निकासी के लिए, कदम 2.2-2.12 का पालन करें.

समावेशी पिंड के 4 शोधन

  1. मानक आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक दूसरे से जुड़ने सी टर्मिनल उनकी टैग में यह परिणाम है कि एक अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की LHC प्रोटीन की कोडिंग अनुक्रम क्लोन. ई में इस निर्माण रूपांतरण ऐसे BL21 (DE3) के रूप में कोलाई मेजबान तनाव.
  2. तैयार lysis बफर, डिटर्जेंट बफर, ट्राइटन बफर, ते (1 टेबल), 1 एम इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग मध्यम 18.
  3. एक singl उठाओई ई मानक प्रक्रियाओं 6 का उपयोग कर उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग माध्यम की ~ 5 मिलीलीटर में एक नया रेखादार थाली से अभिव्यक्ति क्लोन युक्त कोलाई कॉलोनी. कम से कम 16 घंटे के लिए 220 आरपीएम आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने.
  4. हे की 2.5 मिलीलीटर जोड़ें / उचित एंटीबायोटिक के साथ पूरक लेग के 250 मिलीलीटर के साथ एक 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क में एन संस्कृति.
  5. 2-3 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित 220 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस (या आयुध डिपो तक 600 ~ 0.6 है).
  6. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता IPTG जोड़ें. 220 आरपीएम 3-4 घंटा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए जारी रखें.
  7. एक पूर्व तौला अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5000 XG पर 10 मिनट के लिए संस्कृति अपकेंद्रित्र. अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर वजन और अपकेंद्रित्र ट्यूब वजन घटाकर वजन गोली निर्धारित करते हैं.
  8. ई Resuspend 0.8 मिलीग्राम / जोरदार vortexing द्वारा lysis बफर के जी में कोलाई सेल गोली.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सेल गोली -80 में जमे हुए किया जा सकता हैबाद में उपयोग के लिए सी. एक जमे हुए गोली के साथ शुरू करते हैं, तो lysis बफर जोड़ने से पहले पूरी तरह से गल अनुमति देते हैं.
  9. कोशिकाओं के ग्राम प्रति lysozyme के 2 मिलीग्राम जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कभी कभी vortexing साथ गीला बर्फ पर सेते हैं.
  10. 20 माइक्रोग्राम / एमएल DNase, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी NaCl, 20 माइक्रोग्राम / एमएल RNase जोड़ें. भंवर और 30 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया.
  11. कोशिकाओं के ग्राम प्रति ठंड डिटर्जेंट बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 5 मिनट के लिए आरटी रखना.
  12. 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरण (यदि आवश्यक हो तो दो ट्यूबों में विभाजित). 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र समावेश निकायों गोली.
  13. बफर ठंड ट्राइटन के 1 मिलीलीटर जोड़ें और पूरी तरह से sonification द्वारा गोली (20 सेकंड के अंतराल के साथ 3 दालों एक्स 5 सेकंड एक्स 50% बिजली) resuspend. नोट: sonification दौरान ठंड इसे रखने के लिए बर्फ के पानी से घिरे एक छोटे बीकर में ट्यूब है. कई ट्यूबों के मामले में, मेजबान के बाद एक ट्यूब में resuspended शामिल किए जाने के शव गठबंधन.
  14. 12,000 से कम 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर XG समावेश निकायों गोली.
  15. दोहराएँ कदम 4.13 और 4.14 दो बार.
  16. ट्राइटन बफर दूर करने के लिए एक अंतिम धोने के लिए sonification साथ ठंड ते के 1 मिलीलीटर में शामिल किए जाने के शव Resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र समावेश निकायों गोली.
  17. Sonification से ठंड ते के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend.
  18. ऐसे ब्रैडफोर्ड परख 19 के रूप में मानक तरीकों से प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर शामिल किए जाने निकायों के स्टोर aliquots.

5 पुनर्गठन

Absorbance QY क्षेत्र (600-750 एनएम) में मापा जाता है जब इस प्रोटोकॉल आम तौर पर 4 के एक आयुध डिपो के साथ पुनर्गठन प्रोटीन की 1-2 मिलीलीटर पैदावार. देखभाल प्रक्रिया के दौरान उचित अनुपात को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए, हालांकि मात्रा, के रूप में वांछित समायोजित किया जा सकता.

  1. 2x पुनर्गठन बफर, 20% ओग, 2 एम KCl, ते: तालिका 1 में वर्णित के रूप में निम्नलिखित समाधान तैयार करें. निम्नलिखित है प्रदर्शन करनामंद प्रकाश में teps.
  2. एक 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में 400 μl ते के कुल में LHC समावेशन निकायों के 800 माइक्रोग्राम Resuspend. 2x पुनर्गठन बफर और भंवर संक्षिप्त के 400 μl जोड़ें.
  3. 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए β-mercaptoethanol (शेयर 14.8 एम) के 0.6 μl जोड़ें. 98 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए प्रोटीन हीट. 3 मिनट के लिए आरटी पर भंवर संक्षिप्त और जगह.
  4. सख्ती 1-2 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में 1 मिनट या जगह के लिए vortexing द्वारा 30 μl 100% EtOH में कुल सूखे क्लोरोफिल pigments के 500 माइक्रोग्राम से अधिक 80 माइक्रोग्राम कैरोटीनॉयड पिगमेंट Resuspend.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,800 XG पर ~ 30 सेकंड वर्णक मिश्रण स्पिन और कोई गोली है कि वहाँ की पुष्टि करें. एक गोली है, तो vortexing और / या sonification दोहराएँ. महत्वपूर्ण: मेजबान और स्पिन के बाद, तुरंत प्रोटीन के लिए रंग जोड़ने के लिए, या यह कुल कर सकते हैं और फिर resuspended करने की आवश्यकता होगी.
  6. Vortexing जबकि धीरे धीरे ठंडा प्रोटीन के लिए रंग मिश्रण जोड़ें. भंवर 5-10 एस के लिए जारी रखेंगीला बर्फ पर चुनाव आयोग और जगह ट्यूब. प्रोटीन ट्यूब के शीर्ष अतिप्रवाह कर सकते हैं के रूप में भी सख्ती भंवर सावधान रहें.
  7. 20% Octyl β-D-glucopyranoside (ओग) (अंतिम एकाग्रता 2%), भंवर संक्षिप्त के 94 μl जोड़ें और बर्फ 10 मिनट पर रहते हैं.
  8. संक्षेप में KCl 2 एम (अंतिम एकाग्रता 150-200 मिमी), भंवर के 90 μl जोड़ें और बर्फ 20 मिनट पर रहते हैं. नोट: स्तंभ तैयारी (धारा 6) इस समय शुरू किया जा सकता है.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,800 XG पर 10 मिनट के लिए स्पिन. एक 10 मिलीलीटर ट्यूब (एलडीएस उपजी) गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें. ठंड और प्रकाश से सुरक्षित रखें.

6 निकल स्तंभ शुद्धि

  1. ओग बफर, ओग कुल्ला बफर, क्षालन बफर: 1 टेबल में वर्णित के रूप में निम्नलिखित समाधान तैयार करें.
  2. कोई हवा इस कदम और निम्न चरणों के दौरान स्तंभ के अंदर हो जाता है यह सुनिश्चित करना कि एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए एक नी Sepharose स्तंभ (1 मिलीलीटर) या समकक्ष कनेक्ट करें.
  3. टी की गति सेट करेंवह 1 मिलीग्राम / मिनट के लिए पंप और भंडारण समाधान निकालने के लिए पानी की 5-10 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला.
  4. ओग बफर के 3-4 मिलीलीटर के साथ स्तंभ संतुलित करना.
  5. स्तंभ के लिए प्रोटीन नमूना और लोड करने के लिए ओग बफर के 3-4 मिलीलीटर जोड़ें. नोट: प्रोटीन एलडीएस को हटाने के बाद अब से 10 मिनट के लिए बर्फ पर बैठा दिया गया है 1 मिनट के लिए किसी भी अतिरिक्त LDS वर्षा को दूर करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,800 XG पर फिर से स्पिन.
  6. ओग बफर के 5 एमएल के साथ स्तंभ कुल्ला.
  7. ओग कुल्ला बफर के 2 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला.
  8. 3 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ ही प्रोटीन elute. पुनर्गठन प्रोटीन होता है जो हरे Elute लीजिए. नोट: यह आमतौर पर कुल में लगभग 1 मिलीलीटर है.

7 सुक्रोज ढाल centrifugation

  1. Sucrose के समाधान, 0.06% β-डीएम, 0.01 एम HEPES, पीएच 7.6: 1 टेबल में वर्णित के रूप में निम्नलिखित समाधान तैयार करें.
  2. -20 डिग्री कंपनी / एन ओ पर sucrose के समाधान और फ्रीज के साथ ultracentrifuge ट्यूब भरेंआर -80 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से कम 1 घंटा.
  3. फ्रीजर से ट्यूब निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अबाधित पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: फ्रीज / पिघलना प्रक्रिया 0.1 से 1 एम sucrose के लिए एक ढाल बनाता है. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब आमतौर पर के बारे में 3 घंटे में thaws.
  4. ध्यान से ऊपर से कदम 6.8 में निकल Sepharose स्तंभ से eluted हरी अंश के रूप में एक ही मात्रा को हटा दें. फिर ढाल परेशान बचने के लिए धीरे धीरे शीर्ष पर पुनर्गठित नमूना लोड.
  5. त्वरण और ब्रेक के बिना रोक धीमा करने के लिए सेट 18 घंटे के लिए एक दप-41 या दप-60 झूल बाल्टी रोटर, का उपयोग कर एक ultracentrifuge में बैलेंस ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस पर 200,000 XG पर स्पिन.
  6. ध्यान संदंश के साथ ट्यूब धारक से ढाल बाहर ले. ऊपर से अंश एकत्र करने के लिए एक कुंद उद्घाटन किया है कि एक लंबी सुई के साथ एक सिरिंज का प्रयोग करें. नोट: वैकल्पिक रूप से, एक सुई के साथ ट्यूब भेदी और बूंदों को इकट्ठा करके नीचे से भिन्न इकट्ठा.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल विट्रो में chorophyll ए / बी बाध्यकारी प्रोटीन पुनर्गठित करने के लिए एक विधि का विवरण. इस तकनीक संयंत्र या शैवाल से निकाली इन वर्णक प्रोटीन एक heterologous प्रणाली में overexpression द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो apoprotein, से शुरू विट्रो में परिसरों, और पिगमेंट की तह परमिट. पुनर्गठन के बाद, refolded वर्णक प्रोटीन जटिल pigments के अतिरिक्त और दो चरणों में सामने आया apoprotein से शुद्ध होता है. पहला कदम (चित्रा 1 एबी) अनबाउंड pigments के बड़े हिस्से को हटाने के परमिट जो प्रोटीन, के सी टर्मिनल पर उनकी टैग की उपस्थिति पर आधारित है. दूसरा शुद्धि कदम सामने आया प्रोटीन आमतौर पर पुनर्गठन प्रोटीन युक्त हरे बैंड की तुलना में धीमी migrates जहां सूक्रोज घनत्व ढाल centrifugation, (चित्रा 2) का इस्तेमाल करता है. इन विट्रो में पुनर्गठन का लक्ष्य एक ही उचित साथ परिसरों प्राप्त करने के लिए हैदेशी लोगों के रूप में संबंधों. इस परिणाम को वर्णन करने के लिए, एक में विवो प्रकाश कटाई परिसर के स्पेक्ट्रोस्कोपी गुण विट्रो 13,20,21 में पुनर्गठित वही LHC परिसर के साथ तुलना की जाती है. दिखाई रेंज (350 एनएम और 750 एनएम) में LHCs के अवशोषण स्पेक्ट्रम वर्णक के पर्यावरण पर साथ ही साथ, परिसर के रंग संरचना पर निर्भर करता है (प्रोटीन भी शामिल है) और यह इस तरह की गुणवत्ता की जांच करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण है पुनर्गठन की. चित्रा 3, CP24 के अवशोषण स्पेक्ट्रम, में एक क्लोरोफिल ए / बी विट्रो में पुनर्गठन Arabidopsis thaliana, से प्रोटीन बाध्यकारी, Arabidopsis thylakoids 21 से एक ही परिसर में शुद्ध के स्पेक्ट्रम के साथ तुलना की जाती है. स्पेक्ट्रा में, यह QY और एक (चोटियों 671/439 एनएम) Chl की Soret संक्रमण और Chl बी (649/466 एनएम पर चोटियों) पहचान करने के लिए संभव है. देशी और पुनर्गठन परिसरों समान abso दिखानेएक लगभग समान रंग संरचना और संगठन का संकेत rption स्पेक्ट्रा,. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का पुनर्गठन परिसर की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा preferentially विभिन्न रंजकों उत्तेजित जो अलग तरंग दैर्ध्य, पर उत्तेजना पर मापा जाता है: Chl एक 440 एनएम, Chl 475 एनएम पर बी, और 500 एनएम पर Xanthophylls पर. एक ठीक से मुड़ा हुआ प्रोटीन वर्णक परिसर में, Chl बी और Xanthophylls कुछ picoseconds के भीतर मुख्य रूप से Chl एक करने के लिए उनकी उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण, और प्रतिदीप्ति एक ही आकार और Maxima में सभी तीन उत्तेजना के साथ एक एकल शिखर में जिसके परिणामस्वरूप एक thermally equilibrated प्रणाली से निकलती है तरंग दैर्ध्य (चित्रा -4 ए बी). प्रोटीन के लिए समन्वित नहीं ख Chl की उपस्थिति 475 एनएम उत्तेजना (चित्रा 4C) पर 650 एनएम के आसपास एक अतिरिक्त शिखर या कंधे से पहचाना जा सकता है. मुक्त Chl की उपस्थिति एक के बजाय ले जाता है440 एनएम उत्तेजना पर मुख्य रूप से मौजूद है जो 675 एनएम, चारों ओर अतिरिक्त उत्सर्जन के लिए. 475 पुनर्गठन दोनों के एनएम उत्तेजना और देशी CP24 परिसरों (चित्रा 4D) पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का पुनर्गठन जटिल सही ढंग से जोड़ रहा है यह दर्शाता है कि 681 एनएम पर एक भी शिखर दिखा. वर्णक प्रोटीन जटिल सही ढंग से पुनर्गठन किया है कि एक अतिरिक्त पुष्टि परिपत्र Dichroism (सीडी) माप से आता है. दृश्य क्षेत्र में सीडी संकेत पिगमेंट के बीच excitonic बातचीत पर निर्भर करता है और इस प्रकार यह chromophores 22 के संगठन में भी छोटे बदलाव करने के लिए बहुत ही संवेदनशील है. विशिष्ट फिंगरप्रिंट चोटियों पर साथ, पुनर्गठन और देशी CP24 की सीडी स्पेक्ट्रा दिखाता 5 चित्रा 681 एनएम, 650 एनएम और 481 एनएम. अंत में, स्पेक्ट्रोस्कोपी देशी के गुण और पुनर्गठन CP24 कि पुनर्गठन प्रक्रिया पैदावार देशी की तरह परिसरों Suita की पुष्टि के बीच उच्च समानता प्रकाश कटाई प्रोटीन की इन विट्रो अध्ययन के लिए ble.

चित्रा 1
एक निकल स्तंभ का उपयोग कर एक उनके टैग के साथ पुनः संयोजक LHC प्रोटीन की शुद्धि की संख्या 1 प्रतिनिधित्व. (ए) दोनों का पुनर्गठन परिसरों (हरी षट्भुज) और संयुक्त राष्ट्र के पुनर्गठन / एकत्रित प्रोटीन के शामिल शुद्धि, उनकी टैग प्रोटीन, के दौरान (नारंगी अपार पिगमेंट (छोटे रंग के धब्बे) के माध्यम से प्रवाह जबकि षट्भुज), नी Sepharose (नीला स्पॉट) की सतह के लिए बाध्य कर रहे हैं. (बी) स्तंभ क्षालन बफर imidazole युक्त से धोया जाता है, पुनर्गठन और संयुक्त राष्ट्र के पुनर्गठन प्रोटीन के माध्यम से प्रवाह में एकत्र कर रहे हैं.

hres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
पुनर्गठन LHCII चित्रा 2 सुक्रोज ढाल निकल स्तंभ से शोधन के बाद. पुनर्गठन परिसरों घनत्व ढाल से मुक्त रंग से अलग हो रहे हैं. गहरे हरे रंग के बैंड का पुनर्गठन LHCII का प्रतिनिधित्व करता है और हरे रंग पीला पृष्ठभूमि मुक्त पिगमेंट से बना है.

चित्रा 3
पुनर्गठन प्रोटीन CP24 (rCP24, लाल रेखा) और Arabidopsis thaliana से अलग देशी एक (nCP24, काला लाइन) के चित्रा 3 अवशोषण स्पेक्ट्रा. दोनों स्पेक्ट्रा में, यह QY और Chl एक की Soret संक्रमण (चोटियों पहचान करने के लिए संभव है 671/439 एनएम) और Chl बी (649/466 एनएम पर चोटियों) में. यह आंकड़ा Passarini एट अल से संशोधित किया गया है. 2014 21.


चित्रा 4 प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. एक सीएचएल को Chl बी और Xanthophyls से कुशल ऊर्जा हस्तांतरण दिखा अधिकतम (बी) को पुनर्गठित CP24 wildtype जटिल (ए) और सामान्यीकृत की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. पुनर्गठन CP24 (rCP24) और Arabidopsis thaliana से पृथक (nCP24) देशी जटिल (सी) प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. स्पेक्ट्रा शिखर (डी) की अधिकतम करने के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 परिपत्र Dichroism स्पेक्ट्रा. पुनर्गठन CP24 (rCP24, लाल रेखा) और Arabidopsis thaliana से अलग देशी जटिल (nCP24, काला लाइन) बहुत समान स्पेक्ट्रा से पता चलता है.

चित्रा 6
CP29 जंगली प्रकार (CP29_WT) और उत्परिवर्तित CP29 (CP29_A2) की चित्रा 6 अवशोषण स्पेक्ट्रा. ग्रीन लाइन दो भूखंडों के बीच मतभेदों को दर्शाता है.

px "> सुक्रोज N-Dodecyl बीटा-D-Maltoside (β-डीएम)
सभी बफ़र्स 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
अवयव अंतिम एकाग्रता अतिरिक्त नोट्स
पीस बफर Sorbitol 0.4 एम
Tricine 0.1 एम पीएच 7.8
NaCl 10 मिमी
2 MgCl 5 मिमी
मिल्क पाउडर 0.5% w / v
धो बफर Sorbitol 50 मिमी
5 मिमी पीएच 7.8
EDTA 10 मिमी पीएच 8
Lysis बफर Tris 50 मिमी पीएच 8
सुक्रोज 2.5% w / v
EDTA 1 मिमी पीएच 8
डिटर्जेंट बफर NaCl 200 मिमी NaCl
Deoxycholic एसिड 1% w / v
1% w / v
Tris 20 मिमी पीएच 7.5
EDTA 2 मिमी पीएच 8
बीटा mercaptoethanol 10 मिमी
ट्राइटन बफर ट्राइटन X-100 0.5% w / v
Tris 20 मिमी पीएच 7.5
बीटा mercaptoethanol 1 मिमी
बफर ते Tris 50 मिमी पीएच 8
EDTA 1 मिमी पीएच 8
पुनर्गठन बफर HEPES 200 मिमी
सुक्रोज 5% w / v
Lithiumdodecylsulfate (एलडीएस) 4% w / v
Benzamidine 2 मिमी
Aminocaproic एसिड 10 मिमी
ओग बफर Octylglucoside 1% w / v
12.5% ​​w / v
NaCl 0.2 एम
HEPES 20 मिमी
Imidazole 10 मिमी
ओग कुल्ला बफर N-Dodecyl बीटा-D-Maltoside (β-डीएम) 0.06% w / v
HEPES 40 मिमी पीएच 7.5-9
NaCl 0.2 एम
क्षालन बफर Imidazole 0.5 एम
0.06% w / v
HEPES 40 मिमी पीएच 8
NaCl 0.2 एम
Sucrose के समाधान सुक्रोज 20% w / v
N-Dodecyl बीटा-D-Maltoside (β-डीएम) 0.06% w / v
HEPES 0.01 एम पीएच 7.6
एसीटोन 80% सोडियम कार्बोनेट के साथ बफर एसीटोन 80% वी / वी सोडियम कार्बोनेट एम 1
सोडियम कार्बोनेट के साथ बफर इथेनॉल 96% इथेनॉल 96% वी / वी
सोडियम कार्बोनेट एम 1

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया buffers और समाधान की तालिका 1 सूची.

"> 9 पीटी, चौड़ाई: 48pt "चौड़ाई =" 64 "> rCP26
Chla ए / बी मिश्रण Chla सीएचएल एक सीएचएल बी नियो वियोला ल्यूट सीएचएल मुन्ना सीएचएल / कार
nCP26 - 2.2 ± 0.05 6.2 2.8 0.61 0.38 1.02 9 4.5 ± 0.1
rCP26 8 2.71 ± 0.05 6.57 2.43 0.72 0.32 0.97 3.9 ± 0.04
rCP26 5.5 2.25 ± 0.05 6.23 2.77 0.77 0.3 0.96 9 4.0 ± 0.1
rCP26 3 2.08 ± 0.04 6.08 2.92 0.76 0.3 1.04 9 4.1 ± 0.1
rCP26 1 1.7 ± 0.05 5.7 3.3 0.7 0.3 0.9 9 4.3 ± 0.05
rCP26 0.3 1.11 ± 0.04 4.7 4.28 0.7 0.3 0.9 9 4.2 ± 0.2
0.05 0.23 ± 0.01 1.4 5.6 0.58 0.24 1.11 7 3.1 ± 0.06
rCP26 <0.01 0.11 ± 0.01 0.7 0.64 0.3 1.08 7 3.06 ± 0.06

CP26 देशी तालिका 2 वर्णक सामग्री जटिल अलग Chl ए / बी अनुपात 39 के साथ पुनर्गठन प्रोटीन वर्णक परिसरों की तुलना में.

Discussion

झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इतना आसान नहीं हैं. देशी झिल्ली प्रोटीन के अलगाव प्रोटीन को नुकसान पहुंचा और आवश्यक सहकारकों हटा सकते हैं जो डिटर्जेंट के साथ लिपिड bilayer solubilize करने की जरूरत है, से जटिल है. ये प्रोटीन भी जैविक झिल्लियों में निम्न स्तर पर उपस्थित हो सकता है, या मुश्किल एकल परिसरों की शुद्धि करता है कि प्रकाश कटाई परिसरों के मामले में के रूप में, निकट से संबंधित प्रोटीन के साथ मिश्रित किया. ई में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति कोलाई और इन विट्रो पुनर्गठन में इन समस्याओं से बचने के लिए संभावना प्रदान करता है. इन विट्रो एकरूपता 24 को शुद्ध नहीं किया जा सकता कि परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता देशी परिसरों 20,21,23 और इस तरह के लोगों को बहुत ही लक्षण अधिकारी परिसरों में पुनर्गठन और मुड़ा हुआ प्रोटीन परिणामों की शुद्धि - 27.

इस विधि attainab आसानी से जो पालक, का उपयोग करता हैकुल वर्णक और कैरोटीनॉयड की तैयारी के लिए एक स्रोत के रूप में ले वर्ष दौर,. शैवाल के लिए देशी प्रोटीन के कुछ reconstitutions के लिए, शैवाल से शुद्ध पिगमेंट के उपयोग के कारण अलग रंग रचनाओं को पसंद किया जाता है. Chl ए / बी अनुपात और Chl / कार अनुपात की परवाह किए बिना वर्णक स्रोत का ही रहता है.

यह पुनर्गठन की दक्षता आमतौर पर लगभग 35% से 28 का एहसास है कि महत्वपूर्ण है. इस प्रकार यह पुनर्गठन के बाद समाधान से गैर बाध्य pigments और सामने आया apoprotein दूर करने के लिए आवश्यक है. एक दो कदम शुद्धि प्रोटोकॉल (भी परिणाम देखें) इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है. हालांकि, यह सूक्रोज ढाल कदम apo- और Holo प्रोटीन की पूरी जुदाई की अनुमति नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. Apoprotein कार्यात्मक माप के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, इस प्रकार पिगमेंट होते हैं और यह नहीं है के रूप में सबसे विश्लेषण के लिए यह एक समस्या नहीं है. हालांकि, मामले में यह पूरी तरह से fr से apoprotein दूर करने के लिए आवश्यक हैपुनर्गठन जटिल (उदाहरण के लिए, प्रोटीन stoichiometry को वर्णक गणना करने के लिए) युक्त कार्रवाई, एक anionic विनिमय स्तंभ (देखें Passarini एट अल. विवरण के लिए 2009 29) का उपयोग किया जा सकता है.

क्षमता इन विट्रो में पृथक पिगमेंट के साथ पुनः संयोजक प्रकाश कटाई प्रोटीन refold जिससे परिणामस्वरूप परिसर की विशेषताओं में परिवर्तन, विभिन्न तरीकों से पुनर्गठन "पर्यावरण" संशोधित करके परिसरों "हेरफेर" के लिए एक अवसर प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, पुनर्गठन के दौरान रंग संरचना को बदलने बदल वर्णक संरचना के साथ एक जटिल में परिणाम कर सकते हैं. यह सुविधा विभिन्न रंजकों परिसर की संरचना और स्थिरता पर है प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. 1 और 2.9 का एक Chl / कार अनुपात: आमतौर पर पालक से प्राप्त वर्णक तैयारी 3 के एक Chl ए / बी अनुपात है 1. इस अनुपात आम तौर पर एन के रूप में एक ही गुण के साथ एक पुनर्गठन प्रोटीन का उत्पादनएक ative. 33 - हालांकि, शुद्ध Chl एक या बी के अलावा द्वारा Chl ए / बी अनुपात के समायोजन बाध्यकारी साइटों 30 के चयनात्मकता अलग होने के कारण विभिन्न रंजकों के बंधन को प्रभावित कर सकते हैं. वर्णक बाध्यकारी साइटों की सबसे Chl एक या Chl बी के लिए पूरी तरह से चयनात्मक नहीं कर रहे हैं, लेकिन दोनों को समायोजित कर सकते हैं, क्योंकि यह संभव है, हालांकि अलग आत्मीयता 10,30,34 के साथ. 38 - एक समान तरीके में, कैरोटीनॉयड बाध्यकारी साइटों को भी एक से अधिक Xanthophyll प्रजातियों 8,35 पूरा करने में सक्षम होना दिखाया गया. CP26, विभिन्न रंग रचनाओं का उपयोग उच्च पौधों की एक और वर्णक प्रोटीन परिसर के विभिन्न reconstitutions तालिका 2 39 में दिखाए जाते हैं. ये reconstitutions विशेष पिगमेंट 39 के लिए बाध्यकारी साइटों की आत्मीयता का आकलन किया गया. यह एक ही रंग ग के साथ एक जटिल प्राप्त करने के लिए है कि दिलचस्प है ध्यान दें1: देशी रूप omposition, रंग मिश्रण के Chl ए / बी अनुपात 3 होना चाहिए. इस उच्च पौधों 20,40 के सभी LHC परिसरों के लिए मामला प्रतीत हो रहा है.

पुनर्गठन तकनीक के साथ आणविक जीव विज्ञान के संयोजन एक Chl बाध्यकारी परिसर के गुण अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है. 44 - परिसरों, या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में उनकी भागीदारी की स्थिरता और तह पर विभिन्न प्रोटीन डोमेन के महत्व, apoprotein छोटा या यादृच्छिक mutagenesis 8,41 प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया गया है. 52 - अलग pigments के समन्वय के लिए महत्वपूर्ण एकल एमिनो एसिड के अवशेष व्यक्ति पिगमेंट के गुणों का विश्लेषण या जटिल 10,28,29,45 के समारोह और स्थिरता के लिए उनके योगदान का आकलन करने के क्रम में साइट निर्देशित mutagenesis के माध्यम से बदला जा सकता है. चित्रा 6 शो के साथ Lhcb4 (CP29) का पुनर्गठनस्थिति 216 53 पर हिस्टिडीन की एक उत्परिवर्तन. wildtype और उत्परिवर्ती परिसरों के रंग संरचना की तुलना उत्परिवर्तन लक्षित साइट गुम्मट परिसर में एक Chl एक accommodates यह दर्शाता है कि एक अणु एक Chl के नुकसान लाती है कि पता चलता है. WT और उत्परिवर्ती का अवशोषण स्पेक्ट्रा के मतभेद, वर्णक सामग्री को सामान्य बनाने पर, भी खो वर्णक के अवशोषण गुण को दर्शाता है. इस मामले में, अंतर Chl His216 द्वारा समन्वित एक इस तरंग दैर्ध्य में अवशोषित (इस उत्परिवर्ती के बारे में अधिक जानकारी के लिए और स्पेक्ट्रोस्कोपी गुण MOZZO एट अल. 2008 53 देखें) यह दर्शाता है कि 680 एनएम पर मुख्य शिखर में देखा जा सकता है. म्यूटेशन विश्लेषण भी पिगमेंट 54 के स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों पर पर्यावरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अंत में, प्रकाश कटाई प्रोटीन आसानी से वर्णक-protei में जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में पुनर्गठन किया जा सकता हैदेशी परिसरों के लिए बहुत इसी तरह की संपत्ति के साथ n परिसरों. भी आगे के अध्ययन के लिए उच्च उपज और पवित्रता के साथ प्रोटीन तैयारी देते हुए इस तरह, देशी प्रोटीन को अलग करने की कठिनाइयों, समाप्त हो जाते हैं. एक 3 का महत्व: एक प्रामाणिक जटिल उत्पादन में 1 Chl ए / बी अनुपात पर बल दिया है, और पुनर्गठन wildtype और उत्परिवर्ती LHCs के उदाहरण तकनीक के आवेदन को वर्णन करने के लिए प्रदान की जाती हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HisTrap HP GE Healthcare 17-5247-01
Nylon cloth  20 μm pores
Soft artists paint brush 
NONIDET P-40 Sigma 74385
Beta-DM Sigma D4641
DNAase ThermoScientific EN0525
Milk Powders
RNAase ThermoScientific EN0531
Sonicator
Octyl β-D-glucopyranoside Sigma O8001 
Ultracentrifuge XL Beckman-Coulter
TAP medium see reference 17
LB medium see reference 19

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 92 पुनर्गठन प्रकाश संश्लेषण क्लोरोफिल Carotenoids प्रकाश कटाई प्रोटीन,
पौधों और हरी शैवाल का प्रकाश कटाई परिसर के <em>इन विट्रो</em> पुनर्गठन <em>में</em>
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Natali, A., Roy, L. M., Croce, R.… More

Natali, A., Roy, L. M., Croce, R. In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae. J. Vis. Exp. (92), e51852, doi:10.3791/51852 (2014).

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