Die Konkurrenz in Streptococcus pneumoniae wird durch Bacteriocine vermittelt, kleine antimikrobielle Peptide mit inhibitorischer Aktivität gegenüber Pneumokokken und anderen verwandten Spezies. Hier beschreiben wir einen optimierten bakteriellen Overlay-Assay, der die Charakterisierung der Bakteriocinaktivität und des inhibitorischen Spektrums, der Bacteriocin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sekretierten Quorum-Sensing-Peptiden ermöglicht.
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Methodenartikel
Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Streptococcus pneumoniae besiedelt die hochdiverse polymikrobielle Gemeinschaft des Nasopharynx, wo er mit ansässigen Organismen konkurrieren muss. Wir haben gezeigt, dass bakteriell produzierte antimikrobielle Peptide (Bakteriocine) das Ergebnis dieser kompetitiven Interaktionen bestimmen. Alle vollständig sequenzierten Pneumokokkenstämme beherbergen einen bActeriocin-l ike peptid (blp) Locus. Der blp-Locus kodiert für eine Reihe verschiedener Bakteriocine und alle hochkonservierten Komponenten, die für ihre Regulation, Verarbeitung und Sekretion benötigt werden. Die Diversität der Bakteriozine, die in der Bakteriocin-Immunitätsregion (BIR) des Locus vorkommen, trägt wesentlich zur Pneumokokken-Konkurrenz bei. Zusammen mit den Bakteriozinen befinden sich Immunitätsgene im BIR, die benötigt werden, um die Erzeugerzelle vor den Auswirkungen ihres eigenen Bakteriozins zu schützen. Der Overlay-Assay ist eine schnelle Methode, um eine große Anzahl von Stämmen auf kompetitive Wechselwirkungen zu untersuchen, die durch Bakteriocine vermittelt werden. Der Overlay-Assay ermöglicht auch die Charakterisierung der Bakteriozin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sezernierten Quorum-Sensing-Peptiden. Der Assay wird durchgeführt, indem eine Agarplatte mit einem Stamm vorbeimpft wird, der auf die Bakteriocinproduktion getestet werden soll, gefolgt von der Anwendung einer weichen Agar-Überlagerung, die einen Stamm enthält, der auf Bacteriocin-Empfindlichkeit getestet werden soll. Eine Clearance-Zone, die den Stich umgibt, zeigt an, dass der Overlay-Stamm empfindlich auf die Bakteriocine reagiert, die von dem vorinokulierten Stamm produziert werden. Wenn keine Clearance-Zone beobachtet wird, ist entweder der Overlay-Stamm immun gegen die produzierten Bakteriocine oder der vorgeimpfte Stamm produziert keine Bakteriozine. Um zu bestimmen, ob der blp-Locus in einem gegebenen Stamm funktionsfähig ist, kann der Overlay-Assay angepasst werden, um die Peptid-Pheromon-Sekretion durch den vorinokulierten Stamm zu bewerten. In diesem Fall wird eine Reihe von vier lacZ-Reporterstämmen mit unterschiedlicher Pheromonspezifität im Overlay verwendet.
Einleitung
Streptococcus pneumoniae, eine gemeinsame Kolonisator des polymikrobiellen Gemeinschaft des Nasenrachenraums, ist in der Lage, mit anderen Pneumokokken und eng verwandten Arten durch die Produktion von bakteriell produzierten antimikrobiellen Peptide (Bacteriocine) konkurrieren. Jeder vollständig sequenzierten Pneumokokken-Stamm bis heute untersucht enthält eine Version des b acteriocin- l ike p eptide Ort, BLP. Bacteriocin-Produktion durch Pneumokokken nachgewiesen wurde im Ergebnis der in vitro und in vivo Konkurrenz 1-4 wichtig. Wettbewerbsdynamik werden durch die Expression von verschiedenen Bakteriozine zusammen mit verwandten Proteinen Immunität in Reaktion auf eine spezifische Peptid-Pheromon beeinflusst. Induktion der BLP-Locus durch ein Quorum Sensing System, bei dem ein Peptid-Pheromon, BLPC, bindet an das Sensorkinase, BlpH gesteuert und löst eine Signalkaskade, was zu derTranskription des BLP Locus 5,6. Es gibt vier allelische Variationen BLPC dass jede Bindung an seinen zugehörigen BlpH 6. Für die Zelle, die Auswirkungen seiner eigenen Bakteriocin überleben, werden die Gene, die Proteine kodieren verwandten Immunität auf der gleichen Operon wie jede der Bakteriocin-Genen transkribiert. Tötung tritt auf, wenn ein Teilnehmer-Stamm ist nicht in der Lage, die BLP-Locus in Antwort auf exogene Pheromon hochregulieren oder, wenn der Stamm fehlt die spezifische Immunität Gen zum Schutz benötigt. Der Transporter-Komplex, BlpAB ist für die Sekretion und Prozessierung des Peptids Pheromon und Bakteriocin-Peptide 2,4 erforderlich. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein signifikanter Anteil der Pneumokokken-Stämme "Betrüger" bedeutet, dass sie eine Mutation im konservierten blpA Gen, das sie nicht in der Lage Pheromone und Bakteriozine 1,2 sezer macht haben. Diese Stämme sind in der Lage, auf exogene BLPC 2 durch Wiehern sezerniert reagierenBohren Stämme so dass für die Herstellung von Proteinen Immunität.
Obwohl rohe Zubereitungen von Bakteriozine aus Überständen aus Produktionsstämme mit biochemischen Methoden vor, um Reinheit zu erzielen, hergestellt werden, ist dieser Ansatz nicht nützlich für das Screening von großen Sammlungen von Isolaten und wenn der Pegel des Bakteriocin Expression niedrig in Brühe gewachsenen Kulturen 2,7 9. Die Overlay-Assay ist als schnelle Möglichkeit, die Wettbewerbsdynamik zwischen den Stämmen, die in vitro zu untersuchen existieren können verwendet. Um dies zu tun, ist eine Pneumokokken-Stamm vorgeimpft auf einer Agar-Platte und erlaubt, zu wachsen, um lokale Bakterienkonzentrationen ausreichend für die Induktion des BLP Ort zu erreichen. Ein zweiter Stamm wird dann in einem geschmolzenen weichen Agar-Lösung, die dann über die vorgeimpft Stamm zur Empfindlichkeitstest wird angewendet, inokuliert. Um die Aktivität der BLP-Locus (unabhängig von der Inhibitoraktivität) zu bewerten, können Stämme mit einer Reihe von th lagert werdenree zuvor beschriebenen BLPC Reporter-Stämme. Diese Stämme wurden konstruiert, um eine von drei verschiedenen blpH Allele, die zu den drei häufigsten BLPC Pheromone vom Pneumokokken sezerniert antworten enthalten. Die Reporterstämme haben einen integrierten lacZ-Gen, das unter der Kontrolle eines BlpH abhängigen Promotor ist und tragen eine Deletion im Gen, das BLPC Selbststimulation 10,11 verhindert.
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Protokoll
1. Vorbereitung der Produzentenstammes
- Streak eine Pneumokokken-Stamm für Bakteriozin Produktion auf einem 5% Schafblut CASO-Agar Platte von -80 ° C Gefrierschrank Aktien getestet werden.
HINWEIS: Die Verwendung von Blut-Platten für das anfängliche Wachstum des Stammes zu Inhibitionstest erhöht die Reproduzierbarkeit des Tests. Zusätzlich können andere nicht-Pneumokokken-Stämme, die Bakteriozine verwendet werden, obwohl die Wachstumsbedingungen müssen für einen bestimmten Organismus verändert werden. Wir haben Streptococcus mitis und Lactococcus lactis in der Overlay-Assay erfolgreich eingesetzt. - Inkubieren der Platte über Nacht (O / N) bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Nach der Inkubation des Produzentenstammes, bereiten Sie die CASO-Agar (TSA) Platte durch Pipettieren von 3.000 bis 4.000 Einheiten Katalase auf Platten mit 25 ml TSA und die Ausbreitung der Katalase-Lösung mit sterilen Glasperlen. Lassen Sie die Platte trocken für etwa 10 min untereinem biologischen Sicherheitsschrank.
- Sammeln Sie eine sichtbare Menge von Bakterien auf einer Pipettenspitze. Stechen die Pipettenspitze in die getrocknet TSA Platte.
HINWEIS: Mehr als ein Produktionsstamm können in einem einzigen TSA Platte erstochen werden. Es ist wichtig, Raum aus, so dass die Stichverletzungen resultierenden Halos nicht überlappen.- Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden.
HINWEIS: Positive und negative Kontrollen sind zuvor veröffentlicht und sind auf Anfrage erhältlich 10.
- Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden.
- Inkubieren TSA-Platte, die mehrere Stichverletzungen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Stunden.
2. Erstellen Glycerol Stocks des Overlay Dehnungs
- Glycerin-Stammlösungen herzustellen (Kulturen mittleren exponentiellen Phase nach Zugabe von Glycerin gezüchtet und dann bei -80 ° C gelagert) vor dem Tag des Overlay-Assay. Impfen 5-10 Kolonien von Pneumokokken-strain für Empfindlichkeit oder Pheromon-Sekretion in Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) getestet werden.
HINWEIS: Der Bau der BLPC induzierbaren Reporter ist bereits beschrieben worden und 2 Stämme sind auf Anfrage erhältlich. - Mit 5 ml THY mit fest geschlossenen Deckel in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren 5-10 Kolonien in Glasröhrchen ohne Schütteln.
- Kulturen bei 37 ° C inkubieren, bis sie eine OD 620 zu erreichen von 0,3 bis 0,5.
HINWEIS: Diese wird ca. 4-5 Stunden dauern, abhängig von der Belastung eingesetzt.- Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig ein paar Mal vor der Messung der OD.
- Wenn das Experiment kann nicht am selben Tag durchgeführt werden, oder die Belastung wird mehrfach in der Zukunft genutzt werden, stellen Glycerin Aktien und wieder den Versuch zu einem späteren Zeitpunkt. Für Glycerinstamm Fügen Glycerin Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 20%. Aliquoten Kulturen in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. HINWEIS: Die Proben können sMonate bei -80 ° C überwacht. Wenn nicht machen Glycerin Aktien, verwenden Proben direkt für Overlay-Assay.
3. Overlay Assay
- Kurz vor der Anwendung zu überlagern, mischen Sie die Overlay-Komponenten. In einem 15 ml konischen Röhrchen, 5 ml THY, 3.000-4.000 U Katalase und 200 ul der Overlay-Stamm Bouillonkultur, die entweder gewachsen war, wurde an diesem Tag oder ein Glycerin Lager der Kultur, die bei Raumtemperatur aufgetaut wurde. Bei Verwendung der Reporter-Stamm, werden 50 ul X-Gal (40 mg / ml) zu dem Überlagerungsmischung. Verwenden Sie eine konische Röhrchen pro Platte.
- Äquilibrieren Overlay Mischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe des geschmolzenen TSA.
- Entfernen TSA-Platte mit erstochen Belastung von Inkubator. Schmelzen festen TSA in Mikrowelle und halten bei 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. 3 ml geschmolzenem TSA mit 1,5% Agar und 55 ° C abgekühlt, um Mischung zu überlagern.
- Bereiten Sie die Overlay-Gemisch unmittelbar vor dem Pipettieren wird die Mischung beginnt zu sehr verfestigenschnell. HINWEIS: Wenn die Überlagerung beginnt vor Beschichtung verfestigt, werden die Ergebnisse nicht interpretierbar sein.
- Mischen Sie die Mischung durch Overlay-und Abpipettieren mehrmals mit einer 5 ml Pipette man aufpassen, nicht zu Blasen in die Mischung einführen. Langsam pipettieren Overlay Mischung direkt auf die Platte TSA erstochen. Halten Sie die Platte auf dem Labortisch für wenige Minuten und ermöglicht es der Agar zu verhärten.
- Die Platte, um die Overlay-Mischung verteilen nicht drehen, wird dieses Wachstum von der erstochen Kultur in den Überlagerungs ziehen.
- Vorsichtig TSA-Platte mit Overlay in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 h).
- Beachten Sie die Platten nach Wachstum über Nacht. Die Platten sollten nur in Bereichen, in denen die Hemmung oder Pheromonsignal aufgetreten undurchsichtig vom Wachstum des Overlay-Belastung angezeigt. Diese werden als entweder klar oder blau Zonen rund um den Stamm erscheinen erstochen auf.
HINWEIS: Obwohl Messements der Durchmesser der blau oder Clearing zur quantitativen Beurteilung bestimmt werden kann, Unterschiede in der Durchmesser kann auch in Abhängigkeit von der Menge der Bakterien, die in die Platte gestochen wurde, abhängig. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, jede quantitative Bewertung sollte mit Vorsicht interpretiert werden. Jede sichtbare Lichtung im Vergleich zur Negativkontrolle wird als Aktivität angesehen.
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Ergebnisse
Es gibt zwei mögliche Ergebnisse in der Overlay-Assay. Es sollte möglich sein, das Wachstum des Stammes erstochen nach Inkubation über Nacht zu sehen. In 1A ist die Overlay-Stamm empfindlich für die Bakteriocine produziert. Ein Freiraum visualisiert die Belastung erstochen Umgebung werden. Zusätzlich ist Verwirbelung der gestochen Belastung in den Überlagerungsmischung möglich ist und in der Figur 1A zu sehen ist. In 1B ist die Overlay-Stamm immun gegen die Bakteriozine...
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Diskussion
Das Overlay-Assay ist ein schneller Weg, um den Bereich der Tätigkeit für Bakteriozin Hersteller zu ermitteln und Wettbewerbs Wechselwirkungen, die unter Pneumokokken-Stämme auftreten können, zu demonstrieren. Die Overlay-Assay lässt sich an für das Screening mehrere Stämme für Bakteriozin Produktion auf einer einzigen Platte zu verwenden. Wir haben erfolgreich große Stammsammlungen mit diesem Test mit Hilfe eines 48-Pin-Replikator an SBA-Platten von einer Hälfte einer 96-Well-Platte zu impfen gescreent. Nach Inkubation...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Elizabeth E. Kennedy Research Award.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Trypticase-Soja-Agar mit 5% Schafsblut | Fisher | B21261X | Für das Wachstum aus Tiefkühlkulturen |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4.741 Einheiten pro Platte |
| Todd Hewitt Bouillon + Hefeextrakt (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g THB, 5 g Hefeextrakt, 1 l ddH2O Autoklav |
| Trypticase Sojabrühe + Agarplatten (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g TS, 15 g Agar, 1 L ddH2O Autoklav |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolyl β-D-galactopyranosid (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Lösen in Dimethylformamid-Petrischalen |
| Fisher | |||
| Misst die OD620 von Kulturen | |||
| 37 ° C Wasserbad | |||
| 37 > C Inkubator mit 5% CO2 | |||
| 15 ml konisches Röhrchen |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
