Et høyt innhold Imaging Assay for Identifisering av botulinumneurotoksin hemmere

Introduction

Bakterien Clostridium botulinum produserer botulinumneurotoksin, en av de mest potente biologiske giftene vi kjenner til ^ett. Det er 7 forskjellige Bont serotyper (Bont / AG). Bont / A-Gall indusere lammelse ved nevromuskulære krysset på grunn av Snare kompleks proteolyse ^2,3. Snare proteolyse hindrer signalstoffet vesikkel-membran fusion og derfor blokker eksocytose av nevrotransmittere ^4. Den spesifikke snare målet avhenger av det spesielle bont serotype involvert i rus prosessen. Bont / A og Bont / E cleave SNAP-25 mens Bont / C kløyver begge SNAP-25 og syntaxin ^5. Den gjenværende serotyper henge fast synaptobrevin (også kalt Vesikkel-assosiert membranprotein (VAMP). Bont / A ble valgt for analyse utvikling som den er ansvarlig for en stor andel av naturlig forekommende botulisme og har den lengste varighet av virkning ^{til 6.} Utvikling av lite molekyl therapeutics mot Bont / A er et hovedmål forvår drug discovery-programmet og har benyttet tradisjonelle mål-baserte metoder for å identifisere aktive nettstedet proteolytiske hemmere ^{7, 8-10.} Imidlertid vil etableringen av aktive nettstedet hemmere med bredspektret aktivitet mot flere serotyper og etter eksponering effekt trolig være utfordrende.

Vi har derfor iverksatt en innovativ, fenotypiske drug discovery tilnærming som bruker Bont SNAP-25 cleavage som en funksjonell endepunkt for å identifisere små molekyler som kan blokkere Bont-mediert motoriske nervecellen rus. SNAP-25 er nødvendig for neurotransmitterfrigivning, som nedbrytning av SNAP-25 er prediktive for lammelse og dødelighet in vivo. For eksempel kan celle-basert screening lede til oppdagelsen av nye modulatorer av cellulære faktorer som er ansvarlige for toksin inaktivering eller inhibering av toksin reaksjonsveier inne målrettede celler. En viktig faktor i fenotypiske assay utvikling er utvalget av fysiologisk relevante biologiske modeller. We og andre har beskrevet mus embryonale stamceller (ES) celle-stammer motoriske nevroner som rekapitulere den immunologiske karakter av primære motoriske nerveceller, blant annet uttrykk for SNAP-25 ^{11- 13.} Viktigere, disse mobilsystemer er svært følsomme for Bont / A rus og demonstrere doseavhengig spalting av SNAP-25 som svar på økende konsentrasjoner av toksin ^11,12. De differensierte motoriske nerveceller er også produsert i mengder som er tilstrekkelig for høy gjennomstrømning plate basert analyse og tillatt utformingen av en rekke cellulære tester.

Den fenotypiske analysen er en immunfluorescens metode å benytte to forskjellige antistoffer å kvantifisere spalting av endogent uttrykt full lengde SNAP-25 under Bont / A forgiftning av mus motoriske nervecellen kultur. En karboksylterminal Bont / A cleavage følsomme (BACS) antistoff som gjenkjenner bare full lengde SNAP-25 gjør at vurderingen av Bont / A mediert proteolyse av SNAP-25uttrykk i mus motor nevroner ^10. Et skjematisk diagram av HCI-analysen er vist i figur 1.

Protocol

Tallerken 20000 differensiert mus ES-celler (MES) / brønn i en 96-brønners poly-D-lysin-belagte plater og opprettholde i motoriske nevroner terminal differensiering medier i 5-7 dager.

1. Forbindelse Administrasjon og Beruselse med Bont / A

Utføre alle følgende arbeid i et BSL2 kabinett for å opprettholde samsvar med CDC / NIH retningslinjer.

1. Forbered 10 mM stamløsninger av hvert bibliotek forbindelsen i 100% DMSO i polypropylen 96-brønners plater. Bruk av 10 mM lager for å fremstille en mellomliggende fortynning plate som er 10 ganger større enn den ønskede konsentrasjon screening. Forbered 100 uM mellomliggende plate ved dispensering av 10 mM lagerløsning i 96-brønns plate og fortynn det til 100 uM ved hjelp av kulturmedier. Tilsett 10 mL av forbindelsene på 90 mL av media på cellene ^11. Test forbindelsene ved 10 uM sluttkonsentrasjon, og sikre den endelige prosentandel av DMSO overskrider ikke 0,5%.
2. Utføre alle studkaper som benytter levende celler og aktiv toksin etter biosikkerhetsnivå 2 forhold. Bytt ut de gamle mediene i 96-brønners plater med 80 mL av fersk terminal differensiering media ved hjelp av en 12 kanals manuell pipette. Utføre aspirasjon og dispensere trinn av rader for å unngå eksponering av cellene til medier uten at den omgivende luft.
3. Forbehandle celler med forbindelser før påføring av toksin ved tilsetning av 10 ul av 10 x forbindelser fra kilden platen ved hjelp av en 12 kanal pipette, etterfulgt ved blanding ved aspirasjon (to ganger). For hver 96-brønns plate, behandle to kolonner med 6 brønner med 10x DMSO fortynnet i media for å tjene som signal med høy og lav signal kontroller. Kolonnen uten Bont behandling viser det høyeste nivået i full lengde SNAP-25 (høy signalkontroll). Behandles den andre kolonne med bont alene (uten forbindelser) som den lave signalkontrollen. Bruk lav kontroll for å observere effektiviteten av Bont spalting av SNAP-25 og dens deteksjon med BACS antistoff (figur 2).
4. Inkuber cellene med forbindelser i 30 minutter ved 37 ° C og 6% CO ₂ i cellekulturinkubator.
5. Forbered botulinum neurotoxin A fra en 1 mg / ml kommersiell kilde i fosfatbufret saltvann (PBS) til en endelig arbeids 10x lager ved fortynning med terminal differensiering medier.
6. Initiere rus ved å legge til 10 mL av 10x Bont / En aksje i brønner som er beregnet for behandling og lav signalkontroller ved hjelp av en flerkanals pipette (figur 2). Unn brønnene utpekt som høy kontroll med mediene alene.
7. Decontaminate all plast ware og andre forbruksmateriell som kommer i kontakt med Bont / A i løpet av studien ved nedsenkning i 0,825% hypokloritt løsning i vann i minst 20 min. Utfør alle prosedyrer i biosikkerhet skap og decontaminate arbeidsområder både før og etter forsøkene med 5% vaskemiddel desinfiseringsmiddel som Microchem løsning.
8. Merke platene klart å betegne toksin bruk og incubspiste platene behandlet med 1 nM / L bont / A i 4 timer ved 37 ° C og 6% _CO2 i en cellekulturinkubator. Vise riktig skilting for å informere kolleger at toksinet er i bruk i laboratoriet.
9. Stopp Bont / A proteolysespalting av metanolfiksering. Fjern medier som inneholder toksin og forbindelser fra hver brønn med en flerkanals pipette og kast i 10% blekemiddel løsning. Legg iskald metanol (100 ul) direkte til hver brønn.
10. Inkuber platene i 15 minutter ved romtemperatur (RT) for å tillate fiksering skal skje.
11. Etter fiksering, trygt håndtere kasserte reagenser (betraktet nøytralisert) med biosikkerhet nivå 1 protokoller og kast deretter.
12. Kast metanol og bruke 100 mL PBS å vaske cellene og rehydrere dem før farging. Utfør to ekstra PBS vasker.
13. Etter siste vask, la PBS i brønner, tetningsplatene med mikro selvklebende film og oppbevar ved 4 ° C inntil analyse. Oppbevar plater på 4 ° C for flere dager.

2. Farging

Den immunofarging prosedyren er en arbeidskrevende, flertrinns operasjon som omfatter gjentatte reagenvolumer dispensere / aspirer sykluser og omfattende plate vaske som kan føre til potensiell innføring av betydelig intraplate og Inter variabilitet. En semi-automatiske metoden anvendes for å lagre tidspunktet for laboratoriepersonell, øke assay gjennomstrømning, og minimalisere variabiliteten farging.

1. Bruke en automatisert arbeidsstasjon utstyrt med en 96-brønnhode er i stand til å overføre volumer opp til 250 pl og integrert med en robotgriperarmen til å bevege seg inn i laboratorie forskjellige steder på moduldekket (se Materialer og utstyr) for denne protokoll.
   1. Den modulære dekk er laget for å være vert for ulike typer laboratorie og kan støtte opptil 11 elementer på en gang. Den automatiserte mikrohåndterer er utstyrt med en dual magasin mikrostabler for å holde ogmanipulere opp til 50 plater per syklus.
   2. Den automatiserte arbeidsstasjon er plassert inne i en klasse II biosikkerhet kabinett designet for laboratorie automatisering utstyr for å gi sterilitet og sikkerhet. For automatisert immunofarging, er dekket anordnet som vist på figur 3 for å muliggjøre tilgang reagens etter behov, og uten menneskelig inngripen.
2. Pre-load plater som inneholder faste celler inn i platen magasin og overføring til dekk etter behov for væskehåndtering operasjoner. Bruk 96 pipette hodet utstyrt med 250 mL tips til å suge PBS fra brønnene ned til 10 pl. Permeabilize cellulære membraner for å lette antistoff-binding til intracellulære mål med permeabilization buffer (0,1% Triton X-100). Dispensere permeabilization buffer (100 ul) i hver brønn før retur av platene til den annen lagringsmagasin av den mikroplatestabler etter en 15 min inkubasjon ved romtemperatur (RT).
3. Fjern permeabilization buffer og perform plate vasking med PBS (to ganger) som beskrevet tidligere i trinn 1.13.
4. Etter siste vasketrinn, fjerner PBS-buffer og dispenser 100 ul blokkeringsbuffer inneholdende 1% hesteserum og 0,1% Tween 20 i PBS i alle mikroplater før retur dem til platen magasin for 1 time inkubering ved RT.
5. Bruk to primære antistoffer for farging: en kaninpolyklonalt anti-mus BACS antistoff, for påvisning av full lengde SNAP-25 og en mus monoklonalt anti-III tubulin antistoff for påvisning av nevroner (se Materiale og utstyr). Etter 60 min inkubering, fjernes blokkeringsbuffer og dispenser 50 ul av 4ug / ml BACS antistoff og 0,5 ug / ml III-tubulin i blokkeringsbuffer i alle platene.
6. Inkuber i 1 time ved RT fjerne de primære antistoffer, og vaskes 3 ganger med 100 ul PBS inneholdende 0,05% Tween (PBST).
7. Bruke et anti-mus-IgG merket med Alexa Fluor 647 for å visualisere tubulin-III og anti-kanin-IgG merket med Alexa Fluor 568 å visualisere BACS antistoff. Forbered begge antistoffene som en 2 pg / ml fortynning i blokkeringsbuffer og dispenser 50 ul av blandingen i hver brønn.
   MERK: De sekundære antistoffer som er valgt for immunofarging er merket med forskjellige fluoroforer til å tillate deteksjon av deres utsendte fluorescerende lys ved forskjellige bølgelengder ved hjelp av forskjellige kanaler innenfor detektoren av det høye innhold Imager.
8. Inkuber i 1 time ved RT. Aspirer sekundære antistoffer, og vaskes 3 ganger med 100 ul PBST.
9. Etter den siste vask, tilsett 100 ul PBS inneholdende Hoechst fargestoff (32 uM) for å sette flekker på DNA for deteksjon kjerner.
10. Forsegle platene med en lys ugjennomtrengelig film for å beskytte fluoroforene fra fotobleking. Platene kan lagres ved 4   ° C i flere uker uten vesentlig tap av signal.

3. Imaging

MERK: Utfør image oppkjøpet ved hjelp av høyt innhold Imaging System (Se Materialer og utstyr).

1. Spesifikasjon av høyt innhold Imager Definisjoner:
   1. Velg Plate type, layout, antall felt, objektiv: Greiner u klart, 96 brønns, 16, henholdsvis 20X vann.
   2. Velg kanaler: nucleus eksitasjon EX: 405 nm som kanal 4; cytoplasma EX: 644 nm som kanal 2; antigen spesifikt antistoff kanal EX: 561 nm som kanal 3 og Sett opp eksitasjon effekt av hver laser, Setup eksperiment som to eksponeringer, Exposure en med en eksitasjon ved 644 nm, Exposure to med to excitations på 405 nm og 561 nm. Velg binning som papirtrauet2.
   3. Bruk høye kontrollbrønner for eksponering optimalisering med maksimal intensitet som SNAP-25 kanal og lave kontrollbrønner for minimal intensitet.
   4. Juster eksponeringen, slik at intensiteten av hver kanal er omtrent halvparten av metningsnivået (2,000-2,500 relative enheter).
   5. Identifisere den optimale Z fly på celle maske kanal med delta korreksjon script. Se Figur 5 for resultater etter farging og bildebehandling. Eksportere data til serveren der bildeanalyse programvare er bosatt.

4. Bildeanalyse (figur 6)

MERK: Følgende trinn beskriver anvendelsen av Columbus programvare algoritmer.

1. Velg en passende algoritme for å segmentere de primære objekter (kjerner). Juster om nødvendig bakgrunns terskel og parametere kontrast. The Columbus programvare gir fire kjerner deteksjonsmetoder. Velg den metoden som segment kjerner nøyaktig ved visuell inspeksjon segmentert kjerner (i F igur 6a metode M er valgt).
2. Velg neurite algoritmen (CSIRO neurite Analysis 2) for å segmentere neuritter Juster om nødvendig bakgrunnsterskel og kontrast parametere for å fjerne bakgrunnen. Se figur 6b for parametrene som brukes til å oppdage neuritter.
3. Identifiser neurite regioner (neurite segmenter) based på sekundære objekter (neuritter) ved hjelp av en piksel -3 utvidelse av β-III-tubulin kanalen (Alexa Flour 640) som maske (figur 6c).
4. Beregne intensiteten av signal kanaler (SNAP-25, (Alexa mel 568) for neuritter regionen og β-III tubulin kanal (figur 6d og 6e).
5. Velg ønskede parametre for eksport, for eksempel neurite lengde, gjennomsnitts intensiteter av SNAP-25, β-III tubulin, atomkjerner nummer, neurite segment nummer osv (figur 6f).
6. Overfør platene fra platestablere ved hjelp av robot og last inn High Content Imager for bildeopptak.

5. Dataanalyse:

For å vurdere robustheten i designet analysen, beregne følgende parametere fra platebaserte eksperiment.

1. Signal (S) for å bakgrunn (B): S / B = midlere intensitet av høyt signal kontroll) / midlere intensitet av lav signalkontrollen
<li> variasjonskoeffisient (CV) for signal og bakgrunn (for å måle jevnheten av det spesifikke signalet): CV = (standardavvik (SD) / middelverdi av prøve) x 100 (%), for å bestemme variasjon i væskehåndtering, reagenser, etc.
2. Signal til Støy: S = (gjennomsnittlig intensitet av signal - mener intensiteten av lav signalkontroll) / SD av lav kontroll
   1. Beregn Z 'faktor med forgiftning av en halvdel av en 96-brønns plate og en rus etterligning av den andre halvparten. Z '= 1 - 3 * (SD av høy signalstyre + SD for lavt signal kontroll) / (middel av høy signalstyre - middel av lav signal kontroll). For videre analyse av data screening, normalisere noen av de primære rå parametre på en plate basis for å tillate sammenligning mellom platene og mellom ulike dager eksperimenter.
3. Prosent av spalting, noe som reflekterer reduksjonen av signalet forbundet med full lengde SNAP-25 detektert av spesifikt antistoff (BACS): Cleavage% = 100% * (mean intensiteten av høyt signal kontroll - intensiteten på prøve) / bety intensiteten høy signalkontroll.
4. Prosent Inhibering av spaltning:% Hemming = 100% * (intensiteten av prøven - midlere intensitet av lavt signal kontroll) / (midlere intensitet av høy signalstyre - midlere intensitet av lavt signal kontroll).

Representative Results

Data fra høye og lave kontroller opprettet to forskjellige populasjoner med forskjellen på to medianer enn 3 standardavvik (figur 7A). Målet for screening prosessen er å finne de forbindelser i prøven populasjon med verdier nærmere positiv kontroll populasjon, forutsatt en normal fordeling innenfor prøvepopulasjon (figur 7B, (i)). Datapunkter som er 3 standardavvik utover den midlere anses statistisk forskjellig fra støy og klassifiseres som en aktiv "hit" (figur 7B (ii), røde boksene). De forbindelser som er klassifisert som "treff" vil bli utsatt for ytterligere bekreftelse testing i fremtidige studier. Figur 7B (ii) viser påvisning av positive treff i populasjonen av prøvene fra en representativ delmengde av avskjermingsplatene. Alle fire punkter som hadde verdier lavere enn (median prøver - 3 * SD av prøvene) tilhørtesamme inhibitor som ble oppdaget i forskjellige steder innen 4 ulike screening plater. Denne inhibitor viste robust SNAP-25 beskyttelse mot bont / A, som vist i figur 5.

Figur 1: Arbeidsflyt for sammensatte screening i Bont / A HCI analysen.

Fig. 2: Den 96-brønners plate kart for HCl analyse høy kontrollbrønner (rosa) ble behandlet med 0,5% DMSO som kontroll og kun lave kontrollbrønner (blå) ble behandlet med 1 nM bont / A og 0,5% DMSO. Prøvebrønner (grønn) ble behandlet med 1 nM toksin og 10 mm av forbindelser i 0,5% DMSO. De ytre kolonner og rader (grå) ble ikke brukt på grunn av inkompatibilitet med den optimaliserte plate formatte og manglende evne til 20X vann Immersion mål å brønner image edge.

Fig. 3: Utformingen av automatisert arbeidsstasjon dekk for farging assay blokkeringsbuffer, primært antistoff, sekundært antistoff og cellulære flekker ble dispensert i 96-brønners plater for å redusere polypropylen dødvolum reagens tap. PBS ble utlevert i en skuff som kan holde 300 ml. Manifolden anvendes for flytende avfall aspirasjon er vist på det innfelte bilde.

Figur 4: Skjermbilde av det høye innholdet Imager eksperimentell satt opp.

ng> Figur 5:. Høyt innhold avbildning av SNAP-25 spalting i muse ES-avledet motoriske nerveceller Cellene ble behandlet med 1 nM Bont / A med og uten tillegg av en iM inhibitor (Toosendanin) ¹⁴ eller ubehandlet uten gift. SNAP-25 ble påvist med BACS antistoff. I en annen kanal, ble nevroner oppdaget ved hjelp av et β-III-tubulin antistoff for å lage maske av neuritter for SNAP-25 bildeanalyse. Dette er en enkelt representativt bilde fra en av de 16 bilder tatt fra en gitt brønn. Blå indikerer kjerner farget med Hoechst 33342, rødt er BACS signal og grønt er β-III-tubulin signal. Bilder ble oppnådd med Opera som beskrevet. Størrelse bar: 10 mikrometer

Figur 6: Skjermbildene som viser ulike trinn i bildeanalyse rørledningen.

s ">
Figur 7: Statistisk visualisering av dataene som kommer fra HCI-skjermen. (A). (I) Box plot-analyse av% Spaltning beregnet fra kontrollbrønnene; vist som medianverdier med sine respektive SD (n = 16). Pink representerer høyt signal kontroll (HSC); blå representerer lav signalkontroll (LSC). Z '= 0,97 (ii) Histogram fordelingen av de samme verdier som i (i) for å demonstrere avstanden mellom to kontrollpopulasjoner. Median og 3 SD ble beregnet ut fra de statistiske verdier knyttet til den tilsvarende box-plot. (B). Fordeling av 192 forbindelsen behandlede prøver fra det samme eksperiment. (I) Box-plott som viser de statistiske verdier for% cleavage for prøver i forhold til kontroller, samt statistisk signifikante uteliggere. (Ii) og (iii), Histogram fordeling av de samme verdier i populasjonen av alle data fra skjermen (grønnfarge). Hits (uthevet i rød firkant), ble valgt ut fra uteliggere som har% cleavage verdier mindre enn 3SD fra medianen av prøven befolkningen (<25,89% cleavage). De fire treff uthevet under valget (iii) på histogrammet av alle datapunktene har lignende verdier til høyt signal kontroll og representerte den samme forbindelsen, tilsatt i platen for testene, en kjent Bont / A-hemmer (Toosendanin) som sperret SNAP -25 cleavage.

Discussion

Den kraftige effekten av Botulinum nervegifter og det er relativt enkelt av deres weaponization har resultert i deres klassifisering som kategori A (høyest prioritet) biothreat agenter ved US Centers for Disease Control and Prevention. Dessverre er det ingen FDA godkjente therapeutics å motvirke Bont rus etter at toksinet har blitt internalisert av motoriske nerveceller. Enhver druggable mekanisme som fremmer neuronal utvinning fra Bont forgiftning kan føre til utvikling av en potensiell terapi for å beskytte både de væpnede tjenester og offentlig mot dette biologiske trusselen. I denne artikkelen presenterer vi en detaljert HCI analyseprotokollen for screening hemmere av dødelige giftstoffer som Bont / A. En uvanlig aspekt av denne analysen er samvittighetsfull innlevering av giftstoffer og implementering av strenge biosikkerhet protokoller for å sikre laboratoriesikkerheten. Ekstrem forsiktighet må utøves mens aktiv toksin er i bruk. Bont / A inaktive via metanol fiksering og mikro decontaminatipå med 10% blekemiddel og 5% overflate Serviettene er viktige skritt som gjør at mikro å bli fjernet fra biosikkerhet skap for nedstrøms evaluering i biosikkerhet nivå 2 laboratoriemiljøer.

På grunn av den stadig voksende størrelse av sammensatte biblioteker kombinert med treg motor nevron ekspansjon (celle nummer), HKI-analyser for neurotoxin antagonister har en tendens til å gå over flere uker. Dette krever at variabiliteten mellom platene og på tvers av tid må elimineres eller minimeres. I denne protokollen gir vi automasjons metoder for farging, image oppkjøpet og analyse for å redusere analyse variabilitet. Videre pålitelighet og konsistens kan oppnås ved automatisering av rutineoppgaver knyttet til denne protokollen inkludert celle plating, vasking, og fiksering. Vår gruppe er ferdig med å vurdere effekten av disse forbedringene med den hensikt å innlemme dem i vår protokoll i nær fremtid.

I denne rapporten beskriver vi en SNAP-25cleavage analysen bruker høyt innhold bildebehandling for å måle relative fluorescens av intakt SNAP-25 i motoriske nevroner. Denne analysen bruker BACS og β-III tubulin antistoffer for påvisning av full-lengde SNAP-25 og β-III tubulin henholdsvis ^11. β-III-tubulin blir brukt som en markør for å spesifikt identifisere neuroner (figur 4). Mens Bont / A kløyver SNAP-25 og reduserer SNAP-25 signal, små molekyler som hemmer noen del av denne prosessen bedre SNAP-25 signal i bildeanalyse. Som denne analysen er avhengig av fluorescens signal generert fra SNAP-25 fordelt på mange små neuritter, bilder av høy kvalitet er helt nødvendig. Derfor er automatiserte mikroskoper som produserer høy oppløsning confocal bilder anbefalt (figur 4). Vi rutinemessig fange opp feltene 6-16 / brønn i en 96-brønners format ved bruk av 20X objektiv vann-nedsenking. Antallet felts bildepåførte er avhengig av det totale antall neuritter som kreves for å vanligvis genererere statistisk signifikante resultater.

Modulære bildeanalysealgoritmer ble brukt til å trekke ut Funksjoner med flere data (figur 6). Columbus modulære bildeanalysealgoritmer er relativt enkelt å generere for enklere analyse scenarier. For mer komplisert analyse eller utforming av spesifikke parametre for komplekse avlesninger, kan Acapella baserte skript brukes innen operamiljøet så vel som inne sammenheng med Columbus. I tillegg til de fluorescensintensiteter erholdt fra de SNAP-25 og β-III-tubulin kanaler, vi rutinemessig samle andre parametere som for eksempel total celle nummer (indirekte mål for cytotoksisitet), neuritt-lengde, neuritt-forgrening, og andre endepunktene til å kvantifisere helse under neuronal analysen. De rå endepunkt data eksporteres til statistisk analyse programvare for videre dataanalyse og traff utvalg (figur 7). Dataene presentert her viser evnen til HCI-analyse til å være efficiently utnyttes for fenotypisk screening i søk etter Bont / A-hemmere ved hjelp av en fysiologisk relevant motor neuron modell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack