Summary
Denne metoden ble utviklet med mål om å levere en jevn narkotika løsning via halspulsåren, for å vurdere farmakokinetikken av nye medikamenter i musemodeller.
Abstract
Når foreslår bruk av et legemiddel, legemiddelkombinasjonen, eller levering av legemidlene i et nytt system, må man vurdere farmakokinetikken av stoffet i studiemodellen. Som bruk av musemodeller er ofte et viktig steg i preklinisk medikamentoppdagelse og legemiddelutvikling 1-8, er det nødvendig å utforme et system for å innføre medikamenter inn i mus i en jevn, reproduserbar måte. Ideelt sett bør systemet tillater innsamling av blodprøver ved regelmessige intervaller i løpet av en innstilt tid selvfølgelig. Evnen til å måle medikamentkonsentrasjoner i masse-spektrometri, har tillatt søkere å følge endringer i plasmalegemiddelnivåer over tid i individuelle mus 1, 9, 10. I denne studien ble paclitaxel innføres i transgene mus som en kontinuerlig arteriell infusjon over tre timer, mens blodprøver ble samtidig tatt av retro-orbital blødninger på sett tidspunkter. Karotidarterie infusjoner er et potensielt alternativ til halsvene infusjoner, når faktorer såsombrystkjerteltumorer eller andre hindringer gjør hals infusjoner upraktisk. Ved hjelp av denne teknikken, paclitaxel konsentrasjoner i plasma og vev oppnådd tilsvarende nivåer i forhold til hals infusjon. I denne opplæringen vil vi vise hvordan du lykkes kateterisere halspulsåren ved å forberede en optimalisert kateter for den enkelte mus modell, og deretter vise hvordan du setter inn og sikre kateter inn i musa halspulsåren, træ enden av kateteret ut gjennom baksiden muse hals, og hekt musen til en pumpe for å levere en kontrollert hastighet av narkotika tilstrømningen. Flere lavt volum retro-orbital blødninger tillate analyse av plasmakonsentrasjon av legemidlet over tid.
Introduction
Drug infusjon gjennom karotid kan utføres på en pålitelig og reproduserbar måte ved å optimalisere utstyr og teknikk. Prosedyren er ikke innviklet, selv om det krever god kontroll og oppmerksomhet på detaljer. Overlegen omsorg og fingerferdighet trengs for å isolere halspulsåren og inn kateteret, som generelt kan erverves gjennom praksis. Kirurgi av en erfaren tekniker bør ikke overstige en time. Etter vellykket operasjon, bør den muse vises normale og sunne (selv om musen kan reagere på selve medikamentet infusjon), og medikament (er) kan administreres på en kontrollert, jevn kontinuerlig dosering. Blodprøver må tas fra et annet sted enn halspulsåren nettstedet; retro-orbital blødninger viste seg lett å samle inn og tilfredsstillende for analyse av legemiddelkonsentrasjon.
Katetre av optimal størrelse og form er en uvurderlig ressurs i å utføre en vellykket infusjon 11. Vi fant katetre tilgjengelig kommersielt gjennomføry ofte for å være for store og / eller for fleksibel for å tillate enkel tilgang til muse arteria carotis. Det viste seg å foretrekke fremfor mote katetre fra polyetylen rør som brukes til å koble musen til infusjons sprøyte. Dermed er alle rør, koblinger og nåler var av konsistente dimensjoner, som forenklede infusjonsenheten. Ved hjelp av denne teknikken, er det ikke nødvendig å presse spissen av kateteret i arterien forbi det punkt der det er fremdeles synlig, og blodstrømmen til karotidarterien ikke er gjenopprettet før etter at kateteret er i utgangspunktet festet. Dette reduserer farene ved punktering arterien, eller ved å ha kateteret skyves ut ved høyt trykk på blodstrømmen. Kateteret utforming heri ikke innlemme en "bump" for å holde den på plass, så sikre kateteret godt med sting og kirurgisk tape er en prioritet.
Infusjoner kan være å foretrekke fremfor de vanlige iv bolusinjeksjoner, som et bedre etterligner av klinisk administrasjon avstoffer som taxaner 3, 12, 13. Den teknikk som er beskrevet her ble opprinnelig utviklet for å tillate infusjon i musemodeller, karakterisert ved at tilgang til vena eller lårvenen ble avskåret ved brysttumorvekst og / eller overdreven vaskularisering av innføringsområdet. Denne metoden kan ofte være hensiktsmessig selv i tumorfrie mus: selv om isolering og KATETERISERER carotis er litt mer invasive, har vi funnet det fordelaktig å jugular, fordi tilbøyeligheten av vena veggen for å rive resulterte i mer mislykkede innsettinger og svikt for å fullføre 3 timers tid kurset.
Mens resultatene vist her er fra C57BL / 6J (in-house-avlet) mus, har vi brukt denne teknikken for å kunne sette mot paclitaxel i flere stammer av mus, inkludert FVB og blandet-stammer, for å følge farmakokinetikken i musemodeller transgent manipulert å ned-regulere cellulære transporter funksjoner. Blod og vevsprøver oppsamlede viste forventede nivåer av paclitaxel, i størrelsesorden nivåene etter hals infusjoner en. Denne teknikken kan forventes å arbeide like godt i andre musemodeller og med andre infusjonsoppløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er godkjent av Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care og bruk komité og ved Laboratory Animal Facility, og funnet å være i samsvar med institusjonelle retningslinjer for human behandling av dyr.
1. Foreløpige Forberedelse
- Fremstilling av kateteret: Fremstill et kateter fra en kort lengde av polyetylenrør, modifisert til å danne et fortynnet, avstumpet ende (figur 3A). Lag flere katetre på forhånd og spare på ubestemt tid.
- Tenn et Bunsen brenner, og justere for å etablere en lav jevn flamme. Hold tubing nær å flamme å myke polyetylen. Når slangen begynner å smelte, sakte trekke fra hverandre de to endene til å skape en tynnet delen av slangen, ca 0,25 mm OD.
- Skjær en skrå ende ca 0,75 cm langs tynne delen. Dette sikrer tilstrekkelig rør som skal festes i arterien, uten å skape en altfor lang kateter.
MERK: En lang tynne enden på the kateter har en tilbøyelighet til å tette. En altfor lange enden kan også holde nok væske til å betydelig endre kateteret likvide volumkapasitet. - Sløv den skrå enden ved å passere raskt gjennom flammen - når den skal varmes opp, blir slutten litt avrundet og forstørret. Spissen kroker litt tilbake, noe som bidrar forankre slangen mens du setter inn i arterien.
- Kutt slangen 6,0 cm fra det punktet hvor det begynner å tynne. Dette gjør en svært overkommelig kateter, er det lenge nok til å træ gjennom til exit fra nakken og å holde og arbeide med komfortabelt, men kort nok til å hindre musen fra gnager på overskytende slange eller krever for mye ekstra infusjonsvolumet for å fjerne innledende saltvann .
- Forbered en sprøyte med ca 0,2 ml heparin løsning, toppet med en avstumpet nål. Sett nålen inn i den brede enden av kateteret (figur 3B). Fyll kateter med heparin, er forsiktig med å sikre at det ikke er noen bobler islangen. Sett heparin sprøyte og kateter til side på et sterilt område. Steriliser katetre med gammastråling, ved å plassere kateteret (r) i en petriskål, og utsette til 20 Gy av gammabestråling. Hvis du ikke har tilgang til en gammastrålekilde, sjekk med ditt dyr anlegget for å undersøke andre former for sterilisering, for eksempel gass- eller kjemisk-sterilisering. Ikke autoklaver, som polyetylen ikke kan varme sterilisert.
- Opprettelse av en saltløsning bly (Figur 3B).
- Forbered en ny sprøyte med ca 0,5 ml sterilt saltvann, er forsiktig med å sikre en boble-fri linje.
- Skjær en annen slange, ca 15 cm, og skli på avstumpet sprøytespissen. Fest en tilkoblingsporten til den ledige enden av slangen.
- Test at strømmen av saltvann er uhindret av jevnt rykkende et lite volum av saltløsning gjennom ledningen. Bruk denne saltvann ledelsen etter kateterinnleggelse, for å sjekke flyten gjennomkateteret, og for å skylle linjen av blod. Sett saltvann sprøyten til side på et sterilt område.
- Før kirurgi, sterilisere utstyr ved autoklavering, eller alternativt ved gass-sterilisering eller glassperle sterilisering.
- Forbered sterile kirurgiske området.
- Tørk benk og mikroskop flater med desinfiserende middel som 70% etanol eller klordioksid. Dekk benk og mikroskop base med en ren absorberende engangs pad.
- Forbered et kirurgisk bord ved å dekke med to lag ren, absorberende papir, sikkert festet med tape.
- Legge ut alle kirurgiske forsyninger (som katalogisert i Materials List) slik at de er lett tilgjengelig.
- Skjær tre lengder av steril sutur, 8 cm hver, og sett til side med andre forsyninger. Plasser en port hvor det vil være lett tilgjengelig (Figur 3B).
2. Kirurgi
- Fremstilling av dyret
- Anesthetize mus ved eksponering til 2-3% isofluran anestesi i kammeret koblet til presisjon fordamper. Trekk musen fra kammeret, og barbere håret fra musen nakke / overkropp, og under høyre øret (område av kateter exit). Administrer veterinær petrolatum oftalmisk salve til øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Sikre at dyret ikke vekke under kirurgiske preparater ved å tillate tilstrekkelig tid mus i kammeret før inhalering prep (minst to min), eller ved administrering av isofluran til mus ved hjelp av en nesekonus ved prep. Returnere musen til anestesi kammer.
- Når musen er tilstrekkelig inert, flytte til sterile kirurgiske området, plasserer anestesi nesen membran over musens nese og munn, og avlede strømmen av isofluran til nese kjegle. Bekreft riktig anesthetization ved å knipe labben med pinsett; når musen viser ingen reaksjon, går du videre til neste trinn.
- Plasser musen på ryggen, med hodet vendt motetterforsker. Sikre ørene, forgrunnen-poter og hind-poter til kirurgisk bord med teip eller andre holdeanordning for å holde muse stødig. Rens innsnitt området med povidon-jod og 70% etanol.
- Isolering av arteria carotis
- Lag en 1 cm lengde kuttet litt til høyre for midtlinjen av nakken. Bruk pinsett til å skille fett og muskler for å avsløre luftrøret (figur 4A). Lokal karotidarterien som går parallelt med luftrøret (figur 4B).
- Bruke nøye tang til eget fascia liggende arterien (figur 4C). Lett trekke vagusnerven bortsett fra carotis, og sett tang inn i mellomrommet mellom. Forsiktig åpne tang for å lage et hull i konseptet, og trekk forsiktig bort nerven fra arterien, fra gaffelen i arterien nær strupehodet (fremre enden), opp (posterior) så langt som mulig (minst 3 mm) ( Figur 4D).
- Fjerne noen reværende fascia til arterie er godt isolert (figur 4E). Tilsett en dråpe saltvann til operasjonen området av og til for å holde vevet fuktig, og dermed mindre sprø og mindre tilbøyelige til å rive tilfeldig.
- Sutur plassering og arterie forberedelse til kateterinnleggelse (figur 4, 5).
- Bruk pinsett til å trekke en silke sutur tråden under arterien. Knyt en sikker knute å stenge av arterien så langt mot anterior som mulig (figur 4F).
- Tegn en andre tråden under arterien. Knyt en uttrekkbar knute for å midlertidig stenge av arterien så langt mot bakre som mulig (figur 4F).
- Trekke et tredje tråden under arterien. Tie en meget løs knute mellom de to første sting, som skal brukes til raskt å feste kateteret etter plassering (figur 4G).
- Holder endene av alle suturer ut av veien ved å fukte dem med en bit av 70% etanol.
- Med sutur, ta tak i nedre knute for å trekke arterien litt stram. Nick arterien ovenfor, men svært nær, anterior sutur (figur 4H). Vær forsiktig med å kutte for dypt, men sjekk slit å sørge for at åpningen er uhindret.
- Fjern heparin fylt kateter fra sprøytespissen, prøver å unngå å skape store luftlommer i hver ende. Manipulere kateteret for å posisjonere skråkant på et behagelig vinkel, vanligvis nedover, og litt til høyre (for høyrehendte).
- Mens du holder på å sutur for å holde arterien rester litt stram, forsiktig sette inn kateter inn slit (figur 4I). Bruk pinsett til å holde fremre sutur og trekk arterie ned over kateter (skyve opp overdrevent med kateter kan forårsake den skrå enden å punktere arterie). Slipper nøye kateteret og anterior sutur.
- Fest kateteret ved å stramme knuten på midten sutur, nær inngangen av kateteret inn i arterien. Gjør et stramt trippel knute, men pass på å ikke trekke så stramt som å hindre flyten gjennom kateteret. Videre sikre kateteret ved å knytte det ned med fremre sutur, under inngangen til arterien.
- Fest saltløsning fører til kateteret ved hjelp av koplings plug, igjen prøver å unngå innføring av luftbobler inn i linjen.
- Ta tak i endene av posterior sutur og dra forsiktig for å løsne knuten. Manøvrere sutur ned arterien, over enden av kateteret (ikke fjern tråden). Blodet bør strømme inn i kateteret; hvis det ikke er blodstrøm, forsiktig wiggle kateter for å forsøke å fjerne innsnevringen.
- Når flyten vises uhindret, bruker den siste tråden (fra bakre sutur) å knytte en ekstra knute, litt over midten sutur.
- Med tang i hver hånd, bruk en pinsett til å holde på kateteret rett under fremre sutur, og med den andre, trykker på en kink i kateteret så det vil lett bøye til side. Gjenta for å opprette en ny knekk. Dette gjør det mulig for den frie ende av kateteret å bli trukket mot baksiden av mus hode, uten å tvinge spissen på kateteret for å vende sideveis mot veggen av arterien.
- Snu musen på sin (venstre) side, holde nesen membran plassert over munn og nese, og rengjør innsnitt området med 70% etanol og povidonjodid. Lag et lite snitt (ca 4 mm) under og bak høyre øre. Bruk pinsett for å holde den åpne hudlapp, mens arbeids den butte hule sonde under huden til å opprette en kanal gjennom kinnet, til hulrommet ved halsen. Det anbefales å bringe sonden rundt spyttkjertelen, i stedet for å prøve å gå mellom kjertelen og huden. Bruk pinsett til å nøye frigjøre en plass for sonden å avslutte.
- Tråd port plugg / kateter gjennom sonde for å gå ut i nakken. Ikke trekk for hardt; være sikker på at kateteret er ikke knuse eller hemme blodkar eller organer.
- Administrer aktuell smertestillende til brystet snitt, og nær såret med silke eller stifter.
- Fjern musen fra anestesi, og la dyret å komme seg i en ren, varmet plass (plassen bur på toppen av en varmeputeeller under en varmelampe), i minst 30 min.
3. Infusion
- Forbered alikvoter av 5 mg / ml oppløsning av paklitaxel / metanol.
- Mål 50 mg av paclitaxel i en 15 ml sentrifugerør. Tilsett 10 ml sterilt metanol. Cap tube. Roterer for hånd eller på en roterende rystemaskin ved romtemperatur inntil pulveret er oppløst.
- Delmengde 500 mL av løsningen til 20 små, fryser trygge rør, og oppbevares ved -20 ° C.
- Tine individuelle alikvot ved værelsestemperatur eller i 37 ° C vannbad, umiddelbart før infusjon.
- Klargjør infusjonspumpe (figur 6).
- Skjær en lang lengde av polyetylen rør på ca 40 cm. Fest en avstumpet kanyle til en ende, og en kontaktåpningen til den andre.
- Tegn opp medikamentet i en sprøyte med en kjent indre diameter (de fleste programmerbare pumper vil kreve diameteren av sprøytesylinderen, for å beregne hastigheten av the pumpearmen). Fest nålen på sprøyten og legg stoffet gjennom nålen og tubing.
- Plasser sprøyten inn i pumpen i henhold til produsentens anvisninger. Prime pumpen slik at stoffet flyter jevnt ut tilkoblingspluggen, og den er klar til infusjon.
- Fest musen til å pumpe.
- Hold muse stødig og bruke pinsetten til å klemme kateter, nær havnen pluggen. Fjern pluggen og erstatte med kontakten festet til sprøyten og slangen.
MERK: Blood kan begynne å strømme tilbake gjennom slangen. - Raskt å administrere en rask pumpe for å fjerne volumet av kateteret (beregnet empirisk ved å observere volum på 6 cm av røret), og deretter umiddelbart slår til ønsket infusjonshastighet.
- Hold muse stødig og bruke pinsetten til å klemme kateter, nær havnen pluggen. Fjern pluggen og erstatte med kontakten festet til sprøyten og slangen.
- Fortsett Paclitaxel infusjon for tre timers kurs.
- Overvåk slangen innimellom for å se etter lekkasjer i veikryss som dette er ofte et tegn på en blokkering i flyten til musen.Se musen for forventede eller uventede reaksjoner på infusjons (apati eller hyperaktivitet, tegn til ubehag).
- Avhengig av lengde og karakter av infusjon, kan det hende at musen ikke spise eller drikke, men sørg for å gi tilgang til mat og vann i henhold til institusjonens etablerte politikken. Vær klar over potensialet for dehydrerende musen gjennom innsamling av store mengder blod.
- Fortsett å holde buret varm med en varmepute eller lampe, med mindre musen ser ut til å ønske å holde seg borte fra varmen. Hvis dyret ikke avlives innen flere timer etter operasjonen, implementere plan for post-kirurgisk behandling av dyr, herunder sterile boforhold og behandling for post-operativ smerte.
- Hold et øye med musen, spesielt i de første få min, for å sikre at det ikke trekke ut slangen gjennom hyperaktivitet, eller irritasjon fra slangen (som kan være et tegn på en dårlig innsetting). Hvis musen ikke er over-aktiv, konstant overvåring kan ikke være nødvendig, men sjekk musen rutinemessig for å være sikker på at dyret ikke blir fast i slangen. Sele og tjore system er tilgjengelig kommersielt, men bruken er utenfor rammen av denne protokollen.
- Innsamling av prøver.
- Samle blodprøver med jevne mellomrom av submandibulære eller retro-orbital blødninger (Hvis protokollen ikke gjøre bruk av brysttumormodeller, vurdere samling av blod via et hals kateter innført på samme tid som den karotide kateter). Vær forsiktig med å trekke på infusjonsslangen. Hvis innsamling av retro-orbital blødninger, lett bedøve mus med en inhalasjonsanestetikumet (f.eks methoxyflurane) så man trenger ikke ta med storm for å sikre musen.
- Spin blod i hemocrit sentrifuge for å skille blodceller fra plasma. Bruk en fil eller diamantpenn å score tube på ansiktet av faseseparasjon. Bryt rør og samle plasma bare, i små, fryser sikker tube. Oppbevar på -80 ° C inntil analyse.
MERK: Dersom en sentrifuge hemocrit ikke er tilgjengelig, overføre blodprøve inn i mikro-sentrifugerør, og spinne i en mikrosentrifuge ved høy hastighet for å separere blodceller fra plasma. Samle plasma inn i et andre rør, og lagre ved -80 ° C. - Avlive mus ved CO 2 kvelning. Samle vev (ca 20 - 50 mg) fra organer av interesse og flash fryse i flytende nitrogen. Oppbevar ved -80 ° C inntil analyse.
4. Sample Analysis
NOTE: Alle prøver for denne protokoll ble analysert gjennom en utenfor laboratoriet ved væskekromatografi tandem-massespektrometri (LC - MS / MS), som er beregnet på paclitaxel-konsentrasjoner som følger:
- Utdrag paclitaxel fra prøvene. Homogen vevsprøve i 0,1% eddiksyre, 50% metanol før ekstraksjon. Ekstraher paklitaxel ved væske / væske-ekstraksjon, ved hjelp av metyl-tert-butyleter (MTBE) forsterket med en intern analog (docetaxel) standard. Fjern MTBE og tørre prøver. Resuspender i 50% acetonitril, 0,1% eddiksyre-løsning.
- Forbered kalibreringsstandarder. Legg til en kjent konsentrasjon av paclitaxel til passende C57BL / 6 matriks for å oppnå en endelig rekke standarder (fra 1 til 20 000 ng / ml for plasmaprøver, fra 0,1 til 5000 ng / ml for vevsprøver). Pakk standarder i to eksemplarer, med samme metode som for studieprøvene ovenfor. Mål paclitaxel topp i prøvene etter HPLC / MS / MS utnytter elektrospray ionisering.
- Beregn konsentrasjon ved hjelp av arealforholdet av paclitaxel til intern standard. Bruk kalibreringsstandarder for å opprette en standardkurve, og interpolert studieprøver ved å passe på kurven. Normalisere konsentrasjonen av studieprøver ved startvekt på prøven før homogenisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Paclitaxel fordeling følger forutsigbare mønstre i løpet av en 3 timers doseringsplan av en 15 min høyhastighets-infusjon, etterfulgt av en 165 minutter med lav hastighet infusjon.
Figur 1 viser en sammenligning av halspulsåren-infusjons plasma paclitaxel konsentrasjoner og arteria carotis-infusjoner. Paclitaxel konsentrasjoner falle raskt i de første 15 min etter en innledende høyt volum infusjon, og deretter flate ut over de neste 150 min. Til sammenligning paclitaxel nivåer i et dårlig infusjon starte relativt lav, og sveve opp og ned i hele analysen. Dette var sannsynligvis forårsaket av en blokkering i linje tidlig i infusjonen. Registreringer av analysen viser musen hadde liten eller ingen reaksjon på ekstern tilførsel, bekreftende ideen om en mindreverdig administrering av medikamentet. Figur 2 viser relative nivåer av paclitaxel i lever- og hjernevev, så vel som blodplasma, ved slutten av 3 timers infusjon.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1:. Plasma paclitaxel nivåer under carotis og hals infusjoner Curves representerer plasma paclitaxel konsentrasjoner i enkelte mus. Hver mus mottok en bifasisk infusjon, som består av en innledende høy hastighet, 15 min infusjon av 0,42 mg / kg / min, umiddelbart etterfulgt av en lav hastighet, 165 min infusjon av 0.021mg / kg / min. Arealet under kurven (AUC) for karotid infusjon var ca. 59 ug / ml ∙ min versus en AUC for jugular infusjon av ca. 37 ug / ml ∙ min. Halveringstiden av paclitaxel beregnet fra kurvene genereres for karotid infusjon var 10 min, og for jugular infusjon var 11 min. Carotis infusjon viser omtrent tilsvarende nivåer av legemiddelkonsentrasjon sammenlignet med vena infusjon. Kontinuerlige lave konsentrasjoner, eller konsentrasjoner som syklus opp og ned, ofte represent en dårlig infusjon.
Fig. 2: Paclitaxel konsentrasjon av vev Umiddelbart etter 3 timers infusjon paclitaxel og samling av den siste blodprøven, ble musen avlivet, og lever og hjerne vevsprøver ble oppsamlet. Paclitaxel konsentrasjonsnivåer i plasma og vev ble kjøpt opp av masse-spec analyse. Disse dataene representerer prøver samlet inn fra carotis Infusion-Mouse i figur 1.
Figur 3: Kirurgisk utstyr. (A) Kateter Produksjon: Trekke seg egne katetre holder nede materielle kostnader, samtidig som resøker å skreddersy størrelsen og formen på kateteret til muse alder og størrelse (B) Forbered før kirurgi.: Tre (3) silke sting, ca 8 cm hver; Sterile port plugg; Saline sprøyte og bly; Kateter, festet til heparin sprøyte.
Figur 4: Utarbeidelse av arteria carotis og kateterinnleggelse. (A) Skjær gjennom huden, flytte på seg kjertler og bruke pinsett til grovt eget fett å utsette muskelen. (B) Bruk pinsett for å forsiktig egen muskel å eksponere høyre side av luftrøret. Arteria carotis vil bli synlig som største, tykke vegger fartøy, som går parallelt med luftrøret. (C) Break fascia rundt arterien. (D) Separat vagus nerve fra halspulsåren. (E) Fortsett å fjerne fascia inntil carotid er helt isolert sammen hulen. (F) søm permanent knute i fremre del, og slip knute i bakre ekstremitet. (G) Tredje sutur er gjenget i henhold carotis og svært løst knyttet. (H) Artery er bretter like over anterior sutur. ( I) Sett kateter inn nick i arterien. Grab anterior sutur med pinsett til å trekke arterie ned over kateteret. (J) Secure kateter i halspulsåren med alle tre sting.
Figur 5:.. Sutur plassering Skjematisk representasjon av operasjonsstedet før og etter installasjon kateter Et fotografi korresponderer med figur 4G, med tillegg av et hakk i arterien, slik som i figur 4H.
Figur 6:. Skjematisk av infusjon set-up sprøyte er fylt med narkotika, og avkortet med en butt nål. Polyetylen linje legger sprøyte til carotis kateter. Pumpe langsomt komprimerer sprøyte, for å levere jevn dosering direkte inn i blodbanen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Halsarterie infusjon er en vesentlig teknikk i denne studien av paclitaxel farmakokinetikk. Halsarterie infusjon er en metode for raskt å fordele stoffet i hele sirkulasjonssystemet 14.. 3 timers infusjon er en nærmere etterligner av klinisk administrering av legemidler som taxaner enn bolusinjeksjoner. Operasjonen kan bli pålitelig utført av en enkeltperson, er kirurgi tid relativt kort, og suksessraten er> 75%. Etter at prøvene er samlet inn, må de bli analysert ved hjelp av egnede metoder. Vi brukte massespektrometri for å bestemme konsentrasjonen paclitaxel i plasma og vevsprøver. For ytterligere å validere denne teknikken, sendte vi blod- og vevsprøver til en uavhengig laboratorium for analyse. Disse data ble plottet som individuelle plasma-paclitaxel konsentrasjonskurver for hvert dyr testet (figur 1), og fordelingen av paclitaxel ble sammenlignet i forskjellige vev (Figur 2). I hvert tilfelle er det imtig å vurdere den beste metode for å analysere medikamentfordeling og / eller metabolisme, avhengig av medikamentet og systemet er av interesse. Andre alternativer for måling av ulike rusmidler kan inkludere HPLC-UV eller immunoassays to.
To primære faktorer avgjørende for vellykket carotis kateterisering er godt dags katetre og overlegen arterie isolasjon. Fashioning kateter i henhold til størrelsen på musemodell er det viktigste. Hvis diameteren kateteret er for tykk, vil innsetting i arterien være altfor vanskelig, mens et for tynt kateter vil bli vanskeligere å sikre og for å tette seg før eller under infusjonen. Vinkelen og skarpheten på kateterspissen må også være i en viss bredde; et tips som er for skarp kan punktere blodåreveggen, mens et tips som er for kjedelig vil være vanskelig å sette inn i arterien. De oppgitte målinger ble utledet ved bruk av ti uker gamle C57BL / 6J-mus, ca. 20 g, som en modell mal. Målinger må skaleresopp eller ned empirisk for å passe individuelle modeller.
Isolering av karotidarterien må være en delikat, bevisst prosess for å unngå unødvendig skade på vev, og for å hindre at store blødninger. Subkutant fett generelt kan lett skilles med lav til middels skarpe tang. Muskelvev over karotid bør skilles med medium til fine tippet tang langs forspenning av muskelfibre. Hvis en mer omfattende gap er nødvendig, må teknikeren være ekstremt forsiktig for å unngå sprekker små blodkar. Når carotis er synlig, vil det fortsatt være en god del av konseptet som må tweezed bort fra arterien med fine tippet tang. Endelig må vagusnerven skilles fra karotidarterien uten å skade enten. Når carotis er riktig isoleres, bør det være mulig å innsette tang undersiden, med en tom plass på hver side av arterien (se figur 4E).
Når allerbare skyting fattige infusjoner, start ved å gjennomgå instruksjonene på pumpen for å være sikker på at etterforskeren har riktig programmert pumpen å levere forventet dosering. Deretter vurdere nøye endre volumet som skal innføre i forsøksdyr. Fortynningen av medikament må beregnes slik at doseringsvolumet er hensiktsmessig: volumet må ikke være for stor for dyret til å tolerere, og ideelt vil ikke vesentlig påvirker blodtrykket; men volumet må være stor nok for pumpen å levere pålitelig, og vil skape en jevn strøm for å unngå tresko i veikryss. Hvis tresko blitt en vanlig foreteelse, bør du vurdere å bytte til en mindre måleren (større diameter) nål og slange. Videre, hvis plasmainnholdet ikke når forventet nivå, bør forskeren kontrollere mus post mortem for å avgjøre om kateteret er fortsatt godt plassert i arterien og frittflytende, og endre fasong / størrelse på kateteret som nødvendig.
Den usefulnesse for denne fremgangsmåte kan være begrenset av slike faktorer som størrelse og generell helse av faget, og den tilsiktede tidsrom av infusjonen. Kirurgi og infusjon kan overtax en allerede distressed emne. Selv i et sunt dyr, er halspulsåren kateter bare egnet for korttids infusjoner, vanligvis flere timer til flere dager. Vurdere hvilke metoder for smerte-lindring vil bli brukt dersom mus viser tegn til ubehag i respons til stoffet infusjon, for eksempel gjentatte anvendelser av aktuell anestesi å såre områder, eller forkjøpsrett systemiske analgetika. Det vil være nødvendig å ha alle dyr arbeid godkjent av den lokale dyreregulerende organisasjon eller IACUC, for å få de nødvendige tillatelser til å utføre denne prosedyren. Hvis det er nødvendig å ha en lengre infusjon, eller å ha muse overleve infusjon i en lengre periode, må alternative infusjonsmetoder bli utforsket.
Etter å ha mestret carotisar perfusjoner i studienav farmakokinetikken til paclitaxel, vi har tenkt å bruke denne teknikken i fremtiden for å undersøke effekten av andre legemidler, og Abcc10 modulatorer i C57BL / 6J og FVB mus og andre musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne FCCC Laboratory Animal Facility for deres støtte i dette prosjektet. Vi takker Wolfe Laboratories, Inc. for deres hjelp i å analysere paclitaxel nivåer i plasma og vev. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health innvilger K01CA120091 til EHB og CA06927 til Fox Chase Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
