In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

Zusammenfassung

In diesem Video-Artikel beschreiben wir die in vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen.

Zusammenfassung

Die exogene Lieferung von Codierungs synthetischen Boten-RNA (mRNA) für die Induktion der Proteinsynthese in gewünschten Zellen hat ein enormes Potenzial in den Bereichen der regenerativen Medizin, Grund Zellbiologie, Behandlung von Krankheiten und Reprogrammierung von Zellen. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt das für die Erzeugung der modifizierten mRNA mit verringerter Immunaktivierungspotential und eine erhöhte Stabilität, die Qualitätskontrolle des hergestellten mRNA, die Transfektion von Zellen mit mRNA und Verifizierung der Protein-Expression induziert durch Durchflusszytometrie. Bis zu 3 Tage nach einer einzigen Transfektion mit eGFP mRNA, die transfizierten HEK293 Zellen produzieren eGFP. In diesem Video-Artikel wird die Synthese von eGFP mRNA als ein Beispiel beschrieben. Jedoch kann das Verfahren für die Herstellung von anderen gewünschten mRNA angewendet werden. Verwendung des synthetischen modifizierten mRNA können Zellen induziert werden, um vorübergehend die gewünschten Proteine, die sie normalerweise nicht ausdrücken würde auszudrücken.

Einleitung

In Zellen, die Transkription von Messenger-RNA (mRNA) und die folgende Übersetzung der mRNA in die gewünschten Proteine ​​zu gewährleisten das reibungslose Funktionieren von Zellen. Angeborene oder erworbene genetische Störungen können zu einer unzureichenden und dysfunktionale Synthese von Proteinen führen und zu schweren Krankheiten. Somit ist ein neuer Therapieansatz, um die Produktion von fehlenden oder defekten Proteine ​​induzieren die exogene Lieferung von synthetischen modifizierten mRNA in Zellen, die für das gewünschte Protein. Dabei werden Zellen ausgelöst, um funktionelle Proteine, die sie normalerweise nicht produzieren oder wäre natürlich nicht nötig zu synthetisieren. Mit diesem Ansatz können genetische Erkrankungen, die durch Einführung von mRNA korrigiert werden, dass die für das defekte oder fehlende protein ^1. Die mRNA-Therapie kann auch für die Impfung verwendet werden, um Protein-Antigene, die von Tumorzellen oder Pathogene exprimiert werden, zu synthetisieren sind. Dadurch kann Immunsystem des Wirts aktiviert werden, effektiv zu eliminieren oder zu verhindern, Tumorzellen InFEctions ^2,3. Ferner ist in den letzten Jahren mRNA wurde erfolgreich verwendet, um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten mit mRNAs transfiziert, um induzieren die Expression von Reprogrammierungsfaktoren ^4-6 und sie in iPS-Zellen mit einem enormen Potenzial in der regenerativen Medizin zu konvertieren.

Bisher wurde die Verwendung von herkömmlichen mRNA mit niedriger Stabilität und starke Immunogenität assoziiert. So wurden klinische Anwendungen der herkömmlichen mRNAs beschränkt. Aber der Austausch von Cytidin und Uridin durch 5-Methylcytidin und Pseudouridin in der mRNA-Moleküls durch Kariko und Kollegen gerendert mRNA-Molekülen in biologischen Flüssigkeiten stabil und drastisch reduziert Immunaktivierung ^7-10, die nun ermöglicht die klinische Anwendbarkeit der modifizierten mRNA.

Verwendung synthetisch hergestellte modifizierte mRNAs können gewünschte Gentranskripten vorübergehend in vivo ¹¹ geliefert werdenoder in vitro, um die Proteinexpression zu induzieren. Die eingeführte mRNA unter physiologischen Bedingungen durch die zelluläre Translationsmaschinerie übersetzt. Aufgrund mangelnder Integration in das Wirtszellgenom Vergleich zu viralen Gentherapie-Vektoren, wird das Risiko einer Onkogenese verhindert ^12,13. Somit wird die Therapie mit modifizierten Kunst mRNA besser klinische Akzeptanz in der Zukunft.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der modifizierten mRNA (Figur 1), die Transfektion von Zellen mit mRNA und die Bewertung der Protein-Expression in transfizierten Zellen.

Protokoll

1. Augmentation von Plasmiden, die gewünschten Codier- DNA-Sequenzen (CDS)

1. Vorwärmen SOC-Medium, das in der Transformationssatz enthalten ist, auf Raumtemperatur, und die LB-Agarplatten, die 100 ug / ml Ampicillin und 37 ° C. Äquilibrieren das Wasserbad auf 42 ° C.
2. Tauwetter ein Fläschchen von chemisch Komponente E. coli auf Eis.
3. In 1-5 ul der Plasmid (10 pg bis 100 ng), die die CDS in das Fläschchen aus chemisch Komponente E. coli und vorsichtig mischen. Die Zellen nicht mischen durch Pipettieren. Nach der Zugabe von Plasmiden, mischen durch Antippen des Rohres sanft.
4. Inkubieren der Mischung auf Eis für 30 min.
5. Hitzeschock der E. coli für 30 sec bei 42 ° C in einem Wasserbad ohne Schütteln.
6. Stellen Sie die Durchstechflasche auf Eis für 2 min.
7. In 250 ul vorgewärmtes SOC-Medium in den E. coli und schüttelt die Bakterien horizontal bei 300 rpm über 1 Stunde bei 37 ° C in einem bakteriellen Inkubator.
8. Verbreiten Sie 100 ul und 150 ul von Transformationsansatz auf vorgewärmten LB-Agar-Platten, invertieren die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
9. Nachdem Kolonien sichtbar werden, zu inokulieren eine einzelne Kolonie von jeder Platte in eine 15 ml-Kulturröhrchen mit 5 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin. Über Nacht inkubieren bei 37 ° C mit Schütteln bei 300 rpm, bis die Kultur in der späten log-Phase oder stationären.
10. Für die langfristige Lagerung von transformierten E. coli, Pipette 75 ul 100% Glycerin in die Kryoröhrchen. In 225 ul der Bakterienkultur (gefroren Lager werden 25% Glycerin), gut mischen und speichern die Kryoröhrchen bei -80 ° C.
11. Isolierung der Plasmide, die die erforderlichen CDS mit einem Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
12. Bestimmen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektralphotometer.
13. Bereiten Aliquots von 20 ul und im Kühlschrank bei -20 ° C für längere Zeit.

_title "> 2. Amplifikation von Plasmid-Einsätze und Hinzufügen von Poly T-Leitwerk durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. HINWEIS: Um die DNA-Matrize für die in vitro Transkription (IVT), der CDS von Interesse, hier eGFP wird mittels PCR amplifiziert zu erhalten. Gleichzeitig wird ein Poly-T-Schwanz 120 Thymidin (T) an dem Einsatz unter Verwendung eines Reverse-Primer mit einem T ₁₂₀ Erweiterung hinzugefügt. Dadurch werden die erzeugten mRNAs erhalten einen Poly-A-Schwanz mit definierter Länge nach dem IVT.
2. PCR-Gemisch herzustellen, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
3. Mischen Sie das Reaktionsgemisch gründlich. HINWEIS: PCR-Produkt kann in 4-5 IVT-Reaktionen verwendet werden. Um die DNA-Matrize für die IVT Menge zu erhöhen, kann Gesamtvolumen des PCR-Gemischs erhöht werden. Mehrere PCR-Röhrchen, die jeweils 100 & mgr; l PCR-Gemisch verwendet werden, um eine ausreichende Ausbeute an PCR-Produkt zu erhalten.
4. Legen Sie die PCR-Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie die PCR unter Verwendung des PCR-Zyklusprotokoll (Tabelle 2).
5. Bereinigen Sie die PCR-Reaktion unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kit nach Herstellerangaben isoliert und eluiert die DNA unter Verwendung von 20 & mgr; l Nuklease-freies Wasser.
6. Messen der Konzentration der DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. HINWEIS: Die DNA-Konzentration nachgewiesen ist ungefähr 300 & mgr; g / ml. Daher sollte die erwartete Gesamtmenge ~ 6 & mgr; g. Die Menge an DNA für andere Proteine ​​können in Abhängigkeit von der Länge der CDS unterscheiden, die Menge an Plasmid für die PCR, Annealingtemperatur von Primern und Zykluszahl verwendet.
7. Frieren Sie die DNA bei -20 ° C für eine lange Zeit oder verwenden Sie es direkt für IVT.

3. Kontroll Schritt: Qualität der PCR Produkt

1. Überprüfen Sie die Qualität des PCR-Produkts durch DNA-Gelelektrophorese.
2. Mischen Sie die gewünschte Menge an Agarose mit 1x TBE in einem Kolben. Für eine 1% Agarosegel mit 0,5 g Agarose in 50 ml 1x TBE.
3. Mikrowellen, bis die Agarose aufgelöst. Lassen Sie es nicht zu kochen. Sicherzustellen, dass die Agarose vollständig in Lösung.
4. In 5 ul Nukleinsäure Gel Fleck auf 50 ml Agarose-Gel.
5. Gießen Sie das Gel in einem Agarose-Gel-Box, stellen Sie den Kamm, und warten Sie etwa 1 Stunde, bis das Gel verfestigt.
6. Nehmen Sie den Kamm und platzieren Sie das Gel Box in einem Gelträger.
7. Mix 2 ul (200 ng) 80-10,000 bp DNA-Leiter und 200 ng PCR-Produkt mit jeweils 2 & mgr; l Ladepuffer 6x in einem Gesamtvolumen von 12 ul.
8. DNA-Proben vorsichtig in die Vertiefungen des Agarosegels geladen.
9. Mit 1x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Agarose-Gel bei 100 V für 1 Stunde.
10. Visualisierung der DNA-Banden auf einem Abbildungssystem (2).

4. In vitro-Transkription (IVT)

1. HINWEIS: Nach der PCR wurde die Plasmid-Inserts verstärkt und ein Poly-T-Schwanz angefügt. Während der IVT wird genetische Information von der DNA zur RNA transkribiert. Die erzeugte mRNA-Transkript wird verwendet, um Proteine ​​in Zellen zu erzeugen.
2. Reinigen Sie die Arbeitsfläche und Pipetten mit einem RNase decontamination Lösung. Verwenden PCR clean und steril Dual-Filterpipettenspitzen und häufig Handschuhe wechseln, um eine Kontamination zu minimieren Reaktionsmischungen mit RNasen.
3. Bereiten Sie die NTP / cap analoge Mischung, wie in Tabelle 3 beschrieben.
4. Mischen Sie die NTP / cap analoge Mischung gründlich durch Vortexen und kurz abzentrifugieren.
5. Montieren Sie das IVT Reaktionsgemisch wie in Tabelle 4 beschrieben.
6. Mischen Sie das IVT Reaktionsgemisch gründlich durch sanftes Auf- und Abpipettieren. Anschließend zentrifugieren Sie das PCR-Röhrchen kurz, um das Gemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln.
7. Inkubieren bei 37 ° C für 3 Stunden in einem Thermomixer.
   HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit hängt von der Länge der Einsätze und transkriptionale Effizienz der gegebenen Vorlage. Für kurze Einsätze (<500 nt), kann eine längere Inkubationszeit von Vorteil sein. Ein Zeitverlaufsexperiment durchgeführt, um die optimale Inkubationszeit für maximale Ausbeute zu bestimmen. Daher up IVT Reaktionen gesetzt, für example für 1, 2, 3, 4, 6 h und Inkubation über Nacht und bestimmen die mRNA Menge. Die Kinetik der in vitro-Transkription zur Erzeugung von eGFP mRNA ist in Abbildung 3 dargestellt.
8. Um die Vorlage DNA zu entfernen, fügen 1 ul DNase (2 U / ul) an die IVT Reaktionsgemisch, gut mischen und Inkubation 15 min bei 37 ° C.
9. Reinige das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines RNA Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Eluieren die modifizierte mRNA aus dem Spin-Säule Membran zweimal mit 40 ul Nuklease-freies Wasser. HINWEIS: Die RNA-Konzentration nachgewiesen ist etwa 1500 & mgr; g / ml. Daher sollte die erwartete Gesamtmenge ~ 120 & mgr; g. Die Menge des synthetisierten mRNA für andere Proteine ​​können in Abhängigkeit von der Länge der CDS und der Menge des PCR-Produkts für die IVT unterscheiden.

5. Behandlung von gereinigten mRNA mit Antarctic Phosphatase

1. HINWEIS: Der generierte mRNA wird mit Phosphatase behandelt, um 5 entfernen 'triPhosphate, die von RIG-I, um die Immunaktivierung erkannt und führen kann. Ferner verhindert die Phosphatase-Behandlung Wieder Zirkularisierung selbstLigaTionsReaktion.
2. In 9 ul 10x Antarctic Phosphatase Reaktionspuffer auf 79 ul gereinigte mRNA-Lösung. Anschließend fügen Sie 2 ul Antarctic Phosphatase (5 U / ul) und vorsichtig mischen die Probe. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 30 min.
3. Reinige das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines RNA Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Eluieren die modifizierte mRNA aus der Spinsäule Membran zweimal mit 50 & mgr; l Nuklease-freies Wasser.
4. Messung der Konzentration der modifizierten mRNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. Überprüfen Sie, ob das Verhältnis der Absorption bei 260 nm / 280 nm (A ₂₆₀ / A ₂₈₀₎ ist ≥ 1,8 und das Verhältnis von A ₂₆₀ / A ₂₃₀ ist 2,0, was Reinheit zeigt.
   HINWEIS: Die erwartete Gesamtrendite sollte etwa 90 ug werden, was sufficie istnt für ca. 36 mRNA Transfektionen.
5. Stellen Sie die Konzentration der mRNA bis 100 ng / ul durch Zugabe von Nuklease-freies Wasser.
6. Aliquot der modifizierten mRNA in Einweg Aliquots für Transfektionen und bei -80 ° C erforderlich. Vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren und Auftauen. Richtig zubereitet und gelagert mRNA ist seit vielen Jahren stabil. Während der Arbeitszeit, immer das modifizierte mRNA auf Eis.

6. Steuer Schritt: Qualität synthetisierter Modifizierte mRNA

1. Überprüfen Sie die Qualität der modifizierten mRNA durch RNA-Gelelektrophorese.
2. Mischen Sie die gewünschte Menge an Agarose mit 1x TBE in einem Kolben. Für eine 1% Agarosegel mit 0,5 g Agarose in 50 ml 1x TBE.
3. Mikrowellen, bis die Agarose aufgelöst. Lassen Sie es nicht zu kochen. Sicherzustellen, dass die Agarose vollständig in Lösung.
4. In 5 ul Nukleinsäure Gel Fleck auf 50 ml Agarose-Gel.
5. Gießen Sie das Gel in ein Agarose-Gel-Box, stellen Sie den Kamm, und warten Sie etwa 1 Stunde, bis das Gel solidified.
6. Nehmen Sie den Kamm und platzieren Sie das Gel Box in einem Gelträger.
7. Mix 3 & mgr; l (3 & mgr; g) von 0,5-10 kb RNA-Leiter und 200 ng der synthetisierten modifizierten mRNA mit jeweils 7 & mgr; l Ladepuffer in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Die Zusammensetzung des Ladepuffers ist in Tabelle 5 beschrieben.
8. Denaturieren der Leiter und die mRNA-Proben bei 70 ° C für 10 min.
9. Die Leiter und die mRNA-Proben auf dem 1% Agarosegel sorgfältig zu laden.
10. Führen Elektrophorese bei 100 V für 1 h mit 1x TBE als Laufpuffer.
11. Visualisieren Sie die Leiter und mRNA-Banden auf einem UV-Transilluminator und fotografieren mit einem Geldokumentationssystem (Abbildung 4).

7. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion

1. Platte 2 x10 ⁵ Zellen (HEK293-Zellen) pro Vertiefung der Platte mit 12 Vertiefungen.
2. Die Zellen bei 37 ° C über Nacht inkubieren in einem Zellinkubator. HINWEIS: Am Tag der Transfektion wurden die Zellen sollten reac habenhed 80-90% Konfluenz.

8. Durchführen von mRNA Transfektion von Zellen

1. Auftauen modifizierten mRNA.
2. Generieren Sie die Lipoplexe für die Transfektion.
3. Hinzufügen von 25 ul (2,5 ug) der modifizierten mRNA und 2 & mgr; l kationisches Lipid Transfektionsreagenz bis 473 & mgr; l Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I Serummedium, das Transfektionsgemisch zur Transfektion eine Vertiefung einer 12-Well-Platte zu erzeugen, reduziert. Scale up die Volumina entsprechend der Anzahl von Brunnen zu transfizierenden. Als negative Kontrolle, bereiten eine Transfektion Gemisch ohne mRNA.
4. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren der Transfektion Mischung bei Raumtemperatur für 20 min bis Lipoplexe zur Transfektion zu erzeugen.
   HINWEIS: Die Transfektion Mischung enthält keine Antibiotika. So kümmern sich um die Sterilität zu gewährleisten, während der Handhabung Zellen.
5. Wash-Zellen mit 500 ul DPBS / well.
6. Gib 500 ul Transfektionsgemisch in eine Vertiefung einer 12-Well-plate.
7. Inkubieren der Zellen für 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
8. Saugen Sie das Transfektionsmischung und 1 ml komplettes Zellkulturmedium zu den Zellen.
9. Inkubieren der Zellen für 24 h in der Zelle Inkubator.
10. Zuführen fluoreszenzmikroskopische Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). ANMERKUNG: Um die Expression von anderen Proteinen in Zellen, die durch Transfektion mit anderen mRNA als eGFP kodierende mRNA hergestellt werden untersuchen, können die Zellen auf Deckgläsern gezüchtet werden. Dann wird die Transfektion durchgeführt werden kann und die Zellen können mit geeigneten Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert.

9. Durchflusszytometrische Analysen der eGFP-Expression in Zellen

1. Entfernen Zellkulturmedium aus den Vertiefungen und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml DPBS (ohne Calcium und Magnesium). Gib 500 & mgr; l Trypsin / EDTA pro Vertiefung, um die Zellen von der Oberfläche der Zellkulturplatten zu lösen. Anschließend fügen Sie 500ul TNS pro Well Trypsin inaktivieren.
2. Zentrifugieren der abgelösten Zellen 5 min bei 300 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand so dass nur die Pellets. Zellpellet in 150 ul Zellfixierungslösung und übertragen Sie die Zellsuspension in eine Durchflusszytometrie Röhre.
3. Analyse des Prozentsatzes der eGFP-exprimierenden Zellen und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung von Geo Mittelwert (geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität) (Figur 6).

10. Die Messung der Proteinexpression im Laufe der Zeit

1. Zuführen mRNA-Transfektion von Zellen in 3 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen, wie in Schritt 8 beschrieben Zusätzlich inkubieren 3 Vertiefungen von HEK293-Zellen mit dem Transfektionsgemisch ohne Zugabe von mRNA.
2. Messen der Expression des eGFP 1, 2 und 3 Tage nach der Transfektion, die Dauer der Protein-Expression (Figur 7) zu bewerten.

Ergebnisse

Mit einem pcDNA 3.3 Plasmid, das die CDS der eGFP wurde die Synthese von modifizierten eGFP mRNA hergestellt (Abbildung 1). Nach Einsatz von PCR-Amplifikation und Poly-T-Tailing ist eine klare Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen (Abbildung 2). Erhöhen der IVT Zeit verstärkte die Ausbeute an mRNA (Figur 3). Nach der IVT wurde ein klares mRNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen, die auf die Länge des eGFP mRNA produziert werden (F...

Diskussion

Die mRNA-Therapie hat ein enormes Potenzial im Bereich der regenerativen Medizin, Behandlung von Krankheiten und Impfungen. In diesem Video zeigen wir die Herstellung einer stabilisierten, modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen. Unter Verwendung dieses Protokolls kann andere gewünschte mRNA erzeugt werden. Die in vitro Synthese von modifizierten mRNA erlaubt die Transfektion von Zellen mit der gewünschten mRNA die Expression von Zielproteinen zu induzieren. Dadurch wird das gewünsc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur
DMEM, hoher Glukosegehalt	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	100x
L-Glutamin	PAA	M11-004	200 mM
DPBS ohne Calcium und Magnesium	PAA	E15-002
0,04 % Trypsin / 0,03 % EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Trypsin-Neutralisationslösung, 0,05 % Trypsin-Inhibitor in 0,1 % BSA
HEK-293 Zellen	ATCC	CRL-1573<
Gewebekulturplatten, 12-Well	Corning	3512
Zellkulturflasche (75 cm2)	Corning	430641
DNase- und RNase-freie 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml konische Tuben	greiner bio-one	188271
PCR-saubere und sterile epT.I.P.S. Dualfilter-Pipettenspitzen	Eppendorf	10 & micro; l: 022491202; 100 &Mikro; l: 022491237; 1.000 & Mikro; l: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
14 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen für Bakterienkulturen	BD Falcon	352059
Plasmidamplifikation und -reinigung
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid	Addgene	26822
One Shot Top10 chemisch komponentiert Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Steriles Wasser (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	25 g L-1 in sterilem Wasser auflösen.
LB-Agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	40 g L-1 in sterilem Wasser auflösen.
Ampicillin Fertige Lösung	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Bausatz	Qiagen	27104<
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Bausatz	Life Technologies	AM1334
5-Methylcytidin-5&akut;-triphosphat	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
Pseudouridin-5&akut;-triphosphat	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5&akut;)G-RNA-Kappenstruktur analog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µ l
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/&Mikro; l (aus dem MEGAscript T7 Kit)
Antarktische Phosphatase	New England Biolabs	MO289S
RNeasy Mini-Bausatz	Qiagen	74104
RNaseZap-Lösung	Life Technologies	AM9780<
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	11668-019	Kationisches Reagenz zur Lipidtransfektion
Opti-MEM I Reduziertes Serum Medien	Invitrogen	11058-021	Verbessertes minimales essentielles Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum (FBS) ermöglicht
Gelelektrophorese
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Geliertes Nukleinsäure-Gel-Färben	Biotium	41003	10.000x in Wasser
peqGOLD Range Mix DNA-Leiter	Peqlab	25-2210<
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x Konzentrat
Primer für Insert-Amplifikation und Poly (T) Tail PCR
Forward Primer (HPLC-Qualität) 10 & Mikro; M	Ella Biotech		5&akut;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&akut;
Reverse Primer (HPLC-Qualität) 10 & Mikro; M	Ella Biotech		5&akut;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&akut;
Equipment
Cell Inkubator	Binder		CO2 (5%) und O2 (20%)
CASY Zellzähler	Schä rfe System
Sterile Werkbank	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bakterien-Inkubator	Incutec
Wasserbad
ScanDrop Spektralphotometer	Analytischer Jena
PCR Thermocycler	Eppendorf
Mikrozentrifuge	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Gel Gerät für die Elektrophorese	Bio-Rad
Gel Dokumentationssystem	Bio-Rad
FACScan System	BD Biosciences
Fluoreszenzmikroskop	Nikon
Phasenkontrast-Mikroskop	Zeiss