RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt die grundlegenden Schritte zur Durchführung einer Gesamttranskriptomanalyse an präparierten embryonalen Rückenmarksproben von Küken nach der Transfektion mit In-Ovo-Elektroporation.

Zusammenfassung

Die In-Ovo-Elektroporation des Neuralrohrs des Kükens ist eine schnelle und kostengünstige Methode zur Identifizierung der Genfunktion während der neuronalen Entwicklung. Die genomweite Analyse differentiell exprimierter Transkripte nach einer solchen experimentellen Manipulation hat das Potenzial, ein nahezu vollständiges Bild der nachgelagerten Effekte zu erhalten, die durch das transfizierte Konstrukt verursacht werden. Diese Arbeit beschreibt eine einfache Methode zum Vergleich von Transkriptomen aus Proben transfizierter embryonaler Rückenmarks, die alle Schritte zwischen der Elektroporation und der Identifizierung differentiell exprimierter Transkripte umfasst. Die erste Stufe besteht aus Richtlinien für die Elektroporation und Anweisungen für die Dissektion von transfizierten Rückenmarkshälften von HH23-Embryonen in einer ribonukleasefreien Umgebung und die Extraktion hochwertiger RNA-Proben, die für die Transkriptomsequenzierung geeignet sind. Die nächste Stufe ist die bioinformatische Analyse mit allgemeinen Richtlinien für die Filterung und den Vergleich von RNA-Seq-Datensätzen auf dem öffentlichen Galaxy-Server, wodurch eine lokale Rechenstruktur für kleine bis mittelgroße Experimente überflüssig wird. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass mit den Dissektionsmethoden qualitativ hochwertige RNA-Proben erzeugt werden und dass die Transkriptome aus zwei Kontrollproben im Wesentlichen gleich sind, eine wichtige Voraussetzung für den Nachweis von differentiellen Expressionsgenen in experimentellen Proben. Darüber hinaus wird ein Beispiel angeführt, bei dem die experimentelle Überexpression eines DNA-Konstrukts nach dem Vergleich mit Kontrollproben visuell verifiziert werden kann. Die Anwendung dieser Methode kann ein mächtiges Werkzeug sein, um neue Entdeckungen über die Funktion neuronaler Faktoren zu ermöglichen, die an der frühen Entwicklung des Rückenmarks beteiligt sind.

Einleitung

Genetische Untersuchungen an lebenden Organismen verwenden häufig den Hühnerembryo als Modell, weil in ovo Elektroporation stellt eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um embryonale Strukturen teilweise Transfektion in vivo mit DNA-Konstrukte ^1-5. Bicistronische Expressionsvektoren, die ein Transkript, das ein fluoreszierendes Reporter zusammen mit dem Gen von Interesse, wie pCIG ⁶ oder Pmes ⁷ kodieren, ermöglichen eine schnelle Überprüfung der Transfektion Qualität in der gewünschten Region unter einem Stereomikroskop vor der Verarbeitung Embryonen für Downstream-Analyse.

Mit den....

Protokoll

1. elektroporieren das Konstrukt von Interesse in der Neural Tuben HH12-13 Hühnerembryonen in ovo

Verwenden Sie einen fluoreszierenden Reporter, vorzugsweise in einem bicistronischen Transkript oder mit einem interkalierenden viralen 2a Peptid ¹¹ an das Protein von Interesse fusioniert, um eine schnelle Identifizierung von Personen mit zufriedenstellenden Niveaus der Transfektion zu ermöglichen. Anmerkung: Typische Inkubationszeit für diese Stufe ist etwa 48 Stunden bei 37,8 ° C.

1. Öffnet sich ein kleines Fenster in der Eier nach dem Entfernen 3 ml Albumin mit einem zu einer 18 G x 1 1/2 Nadelspritze verbunden....

Ergebnisse

Um die beschriebene Methode zu validieren, wurden zwei Kontrollproben aus Embryonen mit dem leeren Vektor Pmes ⁷ und eine Probe von Embryonen mit dem gleichen Vektor, der die Einlage zu konstruieren SCRT2-ZNF, die die Zinkfinger-Domänen von Hühner SCRT2 ¹⁸ kodiert, transfiziert elektroporiert erzeugt. Proben ergab 11-22 ug Gesamt-RNA wurden jeweils aus Pools von 8 bis 12 Embryonen. Alle drei Proben erzielt eine optimale RIN-Wert von 10 in einer Qualitätsprüfung mit dem Bioanalyzer Gerät an .......

Diskussion

Hier bieten wir Richtlinien zur Analyse Wirkungen nach der Elektroporation des Huhns Rückenmark. Obwohl Elektroporation von DNA-Vektoren wird häufiger verwendet, um ein Gen von Interesse überexprimieren, kann man auch Konstrukte dominant Negativen quimeric Proteine ​​oder Vorstufen Codierung verwenden für siRNAs zur Genfunktion knock-down Bedingungen ^19-21 erzeugen. In der Tat kann den Vergleich der Transkriptom Profile sowohl Verstärkungs- und Verlust der Funktionsanalyse resultierenden darauf hin Gene diffe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tusche	Jeder Lieferant
18G x 1 1/2 Nadel	BD	305196
3 ml Spritze	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blau 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Lebensmittelfarbstoff zur Visualisierung der DNA-Injektion
Ringer's Solution (1 L)
- 7,2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0,225 g CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0,217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O auf 800 ml und pH-Wert auf 7,4
nbsp;       - ddH2O bis 1 L
- Filter und Autoklav
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1,15 g Na2HPO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O auf 800 ml und pH-Wert auf 7,2
nbsp;       - ddH2O bis 1 L und Filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonat)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Kräftig schütteln und über Nacht bei Raumtemperatur
- Autoklav
Sieblöffel	Beliebiger Lieferant
Sterile 60 x 15 mm Petrischalen aus Polystyrol	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase-Dekontaminationslösung	Life Technologies	AM9780
Chirurgische Feinspitzschere	Beliebig
Lieferant Gerade Pinzette mit feiner Spitze	Beliebig Lieferant
Gezogene Glasnadel aus 1,1 x 75 mm Glaskapillarröhrchen	Kimble Chase	40A502
9'' Glas Pasteurpipette	Beliebiger Lieferant
Manuelle Pipettenpumpe	Beliebiger Lieferant
Durchsichtige 1,5 ml Mikrozentrifuge Polypropylen-Röhrchen	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Mikrozentrifuge	Jeder Lieferant
RNAlater Lösung für die RNA-Stabilisierung	Life Technologies	AM7020
RNAwässriges Gesamt-RNA-Isolierungskit	Life Technologies	AM1912
Molekularbiologisches Ethanol	Jeder Lieferant
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Elektrophorese Bioanalysegerät	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA-Probenvorbereitungskit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002

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