RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expressionsniveaus aller Gene und Proben aus dem embryonalen Rückenmark von elektroporierten Küken zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zuerst in der Ovo die rechte Seite der frühen embryonalen Neuralrohre poriert und die Embryonen bis zum gewünschten Stadium rekubiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, erfolgreich transfizierte Neuralrohrhälften in einer RNA-freien Umgebung zu präparieren und so schnell wie möglich mit der Lyse fortzufahren.

Der dritte Schritt besteht darin, RNA zu isolieren und die Proben einer Bibliotheksvorbereitung und Hochdurchsatzsequenzierung zu unterziehen. Der letzte Schritt besteht darin, die Datasets zu verarbeiten, um Sequenzierungsartefakte zu entfernen. Ordnen Sie Rassen dem Genom zu und weisen Sie jedem Gen Expressionsniveaus zu.

Letztendlich können die Ergebnisse durch den Vergleich der Expressionsniveaus unter Kontroll- und Versuchsbedingungen differentiell exprimierte Gene zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist bei der Dissektion der Neuroröhre von entscheidender Bedeutung. Die Schritte sind schwer zu erlernen, da wir mit der Manipulation von Embryonen vertraut sein müssen.

Für diese Demonstration wurden die Embryonen mit dem GFP-exprimierenden Konstrukt am Neuralrohr transformiert. Bereiten Sie sich darauf vor, zwei Stunden lang an bis zu 10 Embryonen zu arbeiten, um ein bis zwei Mikrogramm Gesamt-RNA pro Embryo zu sammeln. Unter RNAs, freien Bedingungen, entnehmen Sie die Embryonen mit einer feinen Präparierschere und einem SVE-Entnahmelöffel und übertragen Sie jeden Embryo in die Kälte

DEPC-behandelt. PBS verwendete eine Lösung für alle Schritte der Neuralrohrisolierung: Mit einer feinen Pinzette wurde die gesamte Flankenregion eines Embryos zwischen den Knospen der Gliedmaßen entfernt. Schieben Sie diesen Abschnitt mit der Rückenseite des Gewebes nach oben in eine frische, kalte Lösung.

Verwenden Sie zwei feine Glasnadeln, um drei Punkte auf jeder dorsalen lateralen Seite des Embryos zwischen dem Neuralrohr und dem parialen Mesoderm zu perforieren. Führen Sie nun die beiden Glasnadeln in die Mittelperforation ein und bewegen Sie sie entlang der AP-Achse auseinander. Tun Sie dies bei Bedarf durch jede Perforation, um das parale Mesoderm endgültig zu lösen, dieses Gewebe zu entfernen und zu entsorgen.

Drehen Sie dann den Embryo zur Seite und führen Sie die Spitzen von zwei Pinzetten zwischen das Neuralrohr und den Knotenstrang ein. Schieben Sie sie entlang der AP-Achse auseinander, um die Strukturen zu unterteilen. Entfernen Sie zum Schluss größere Stücke von Medgewebe aus dem Neuralrohr, indem Sie es vorsichtig mit einer Pinzette sichern, während Sie das überschüssige Mesoderm abzupfen.

Übertragen Sie dann das Neuralrohr vorsichtig in eine frische, kalte Lösung. Sammeln Sie mit einer Glaspipette und einer Handpumpe alle benötigten Neuralrohre und legen Sie sie auf Eis, bevor Sie fortfahren. Teilen Sie nun jedes der Neuralrohre in zwei Hälften.

Führen Sie eine scharfe Pinzette in das Lumen ein und reißen Sie die Dachplatte durch. Schneide dann mit der Pinzette die Bodenplatte durch und teile das Taschentuch in zwei Hälften. Sortieren Sie mit einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop die elektroporierten von den nicht elektroporierten Hälften.

Übertragen Sie die sortierten Neuralrohrhälften in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit frischer Lösung. Schnippen Sie mit diesen Röhren, um das gesamte Gewebe nach unten zu bringen. Als nächstes drehst du die Röhren für ein paar Sekunden bei 100 GS nach unten.

Saugen Sie dann sehr vorsichtig bei hellem Licht den Snat an. Wenn Gewebe nach oben gezogen wird, werfen Sie es langsam aus und wiederholen Sie die Drehung. Sobald die Neuralrohrhälften von der Lösung befreit sind, fügen Sie 70 Mikroliter pro Neuralrohr hinzu, die Hälfte des Lysepuffers in das Rohr.

Schnippen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie es alle fünf Minuten 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, wirbeln Sie das Röhrchen kräftig vor und fahren Sie mit dem Sammeln der RNA fort, um die RNA zu reinigen. Für die Sequenzierung sollten Sie mindestens acht Neuralrohrhälften pro Probe haben. Andere Ansammlungen von Lyce-Neuralrohren, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, können in die Sammlung eingebracht werden. Beginnen Sie damit, sie 15 bis 30 Minuten lang auf Eis aufzutauen, und beenden Sie dann das Auftauen bei Raumtemperatur.

Nach dem Auftauen alle Proben kräftig vorziehen und fünf Minuten ruhen lassen. Anschließend werden die Proben erneut vortext und bei 15.000 GS eine Minute lang zentrifugiert. Um unlösliches Material loszuwerden, übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und fahren Sie mit der Extraktion fort.

Schließen Sie den Prozess mit einem RNA-Isolationskit ab, indem Sie die RNA in der größtmöglichen Konzentration ausweichen. Für dieses Protokoll ist ein Galaxy-Website-Konto erforderlich, um das erforderliche Speicherkontingent sicherzustellen. Zuerst laden Sie die FASTQ-Dateien per FTP auf die Site hoch, es sei denn, die Qualitätsmerkmale sind bereits in Shred plus 33 codiert.

Bereiten Sie zunächst die hochgeladenen Datensätze mit dem FASTQ-Groomer-Tool im Menü NGS QC and Manipulation vor. Andernfalls ändern Sie unter Attribute den Dateityp in FASTQ sender. Verwenden Sie anschließend im Menü NGS QC and Manipulation das FAST QC-Tool, um die allgemeine Qualität der Datensätze zu analysieren.

Wählen Sie im selben Menü den FASTQ-Qualitätstrimmer aus, um die drei Prime-Enden mit geringer Qualität zu verwerfen. Es sollte ein Qualitätsfaktor von 20 oder höher verarbeitet werden. Gehen Sie nun im selben Menü zum Clip-Tool.

Legen Sie dieses Werkzeug so fest, dass Lesevorgänge mit weniger als 45 Basispaaren verworfen werden. Geben Sie die Adaptersequenz ein. Deaktivieren Sie die Option zum Verwerfen von Lesevorgängen mit unbekannten Basen, und wählen Sie die Ausgabe so aus, dass sie beschnittene und nicht beschnittene Sequenzen enthält.

Fahren Sie mit dem Werkzeug für Trimmsequenzen fort. Verwenden Sie diese Option, um die ersten Basen des Lesevorgangs zu kürzen, um die Verzerrung der fünf Primsequenzen zu entfernen, die von FAST qc erkannt wird. Der nächste Schritt besteht darin, die neueste Hühnergenom-Assemblierung von der Illumina I-Genom-Site herunterzuladen und zu entpacken.

Laden Sie dann die Datei mit dem schnelleren Format des gesamten Genoms und die Annotationsdatei im GTF-Format des Gens in die Galaxiengeschichte hoch. Ordnen Sie nun die Reads für jede Probe dem Genom zu, indem Sie das Analysemenü N-G-S-R-N-A aufrufen und das Top-Hat-Two-Tool auswählen. Wählen Sie die hochgeladene Fasta-Datei aus der Galaxie-Historie als Referenzgenom aus.

Wählen Sie als Nächstes im selben Menü das Manschettenknopf-Werkzeug, um ein vorhergesagtes Transkriptom zu erstellen. Wählen Sie für jedes Beispiel die GTF-Datei aus, die als Referenzanmerkungshilfe verwendet werden soll. Wählen Sie Bias-Korrektur mit der FASTA-Datei für die Sequenzdaten durchführen und aktivieren Sie die Option Multi-Read-Korrektur verwenden.

Sie dann alle assemblierten Transkriptome mit dem Werkzeug zum Zusammenführen der Manschette zusammen. Wählen Sie mit diesem Werkzeug die GTF-Datei für die Referenzanmerkung und die FASTA-Datei für die Sequenzdaten aus. Vergleichen Sie nun die BAM-Dateien, die von Top Hat Two für jede Probe generiert wurden, indem Sie das TIFF-Tool für die Manschette verwenden, das sich immer noch im RNA-Analysemenü befindet.

Wählen Sie im Feld Transkripte das durch cuff merge generierte Merge-Transkriptom aus und aktivieren Sie die Optionen. Verwenden Sie die Multi-Read-Korrektur und führen Sie die Bias-Korrektur mit der FASTA-Datei für die Sequenzdaten durch. Der nächste Schritt besteht darin, die Differenztabellen zu sortieren. Wählen Sie in der Spalte Q-Wert das Sortierwerkzeug aus dem Filter- und Sortiermenü aus.

Die Sequenzen mit signifikanten Unterschieden zwischen den experimentellen Bedingungen haben die niedrigsten Q-Werte in Spalte 13. Werfen Sie nun einen Blick auf die Abdeckungsdiagramme. Konvertieren Sie zunächst die BAM-Dateien mit dem Konvertierungstool im Menü "Bettwerkzeuge" unter den Optionen in Bettdiagrammdateien, deaktivieren Sie die Berichterstellung für Regionen ohne Abdeckung und behandeln Sie gespleißte Einträge als unterschiedliche Intervalle.

Skalieren Sie die Abdeckung auch um einen Faktor, der alle Deckungen im Experiment normalisiert. Konvertieren Sie dann die resultierende Bettdiagrammdatei mit dem Tool im Menü "Formate konvertieren" in das Big-Wig-Format und laden Sie die Big-Wig-Datei als benutzerdefinierte Spur auf den UCSE-Server hoch. Verwenden Sie auf der USCS-Genombrowser-Seite die GAL-Vier-Assemblierungs- und Gensuche für die visuelle Abdeckung der Datensätze mit den beschriebenen Methoden: Neuralröhren, die leere PS-Vektoren exprimieren, wurden für ihre RNA geerntet.

Dies geschah in doppelter Ausführung und die resultierende RNA war von sehr hoher Qualität mit einem optimalen RIN-Wert von 10 wie erwartet. Der globale Vergleich der Transkriptome der duplizierten leeren Vektorkontrollen zeigte keinen eindeutigen Unterschied und der Pearson-Korrelationskoeffizient lag bei Punkt 99. Außerdem gab es einen deutlichen Anstieg der Anzahl der Reads, die der Scratch-Two-Gensequenz in einer experimentellen Probe zugeordnet wurden, die die Scratch-Two-Zinkfingerdomänen exprimierte.

Somit waren die Methoden empfindlich genug, um die vorhergesagte Anreicherung zu detektieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, den embryonalen Neurotubus zu isolieren und ein gutes Verständnis dafür zu haben, wie Sie IC-Datensätze verarbeiten und vergleichen, um differentiell exprimierte Gene zu finden, indem Sie die Schritte zur Siliziumanalyse in Abschnitt vier des Protokolls befolgen.