Name: RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie die RNA-Seq-Analyse differentieller Genexpression in elektroporierten Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genexpressionsmustern im embryonalen Rückenmark.

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CYIY wird unterstützt von FAPESP (2012/14421-5) und FMV wird von einem Stipendium von FAPESP (2009/53695-0) unterstützt. Wir danken dem DNA Technologies Core an der University of California, Davis, für die Vorbereitung und Sequenzierung der RNA-Seq-Bibliotheken, die in dieser Arbeit verwendet werden, dem Galaxy-Team für die Bereitstellung einer hervorragenden und kostenlosen Schnittstelle für Tools zur Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten und Dr. Marianne Bronner für die Erlaubnis, in ihrem Laborraum zu filmen.

1. elektroporieren das Konstrukt von Interesse in der Neural Tuben HH12-13 Hühnerembryonen in ovo Verwenden Sie einen fluoreszierenden Reporter, vorzugsweise in einem bicistronischen Transkript oder mit einem interkalierenden viralen 2a Peptid 11 an das Protein von Interesse fusioniert, um eine schnelle Identifizierung von Personen mit zufriedenstellenden Niveaus der Transfektion zu ermöglichen. Anmerkung: Typische Inkubationszeit für diese Stufe ist etwa 48 Stunden bei 37,8 ° C. <ol><li> Öffnet sich ein kleines Fenster in der Eier nach dem Entfernen 3 ml Albumin mit einem zu einer 18 G x 1 1/2 Nadelspritze verbunden. Embryo Darstellung zu verbessern, zu injizieren eine kleine Menge Tusche 1:50 in steriler Ringerlösung unterhalb des Embryos 1-4. </li><li> Nach Abdecken der Embryo mit steriler Ringerlösung injizieren einen 10 mM Tris-HCl, pH 8,2, und 0,1% Lebensmittelfarbstoff (F, D &amp; C) Lösung, die 2,5 ug / ul DNA durch das hintere Ende des Neuralrohrs, bis es fülltbis zu dem Hinterhirn Region. Zu elektroporieren, die Position von Platinelektroden (0,5 mm Durchmesser) von 4 mm 1 getrennt entlang der Flankenbereich und liefern 5 Impulsen von 50 ms und 20 V mit einem Intervall von 100 msec zwischen ihnen 4. </li><li> Nach der Elektroporation inkubieren manipulierten Embryonen für 48 Stunden mehr, bis sie Stufe HH23 erreichen und identifizieren Personen präsentiert hohe Transfektion im Flankenbereich unter einem Fluoreszenzstereomikroskop. HINWEIS: Die Dauer der Inkubation nach der Elektroporation hängt vom Ziel des Versuchs. Die elektroporierten Plasmide können signifikante Expressionsniveaus nach 2 h 2 zu erzeugen. Wenn daher das Interesse liegt in frühen Beginn der Gene nach der Elektroporation Inkubationszeit kann reduziert werden. </li></ol> 2. Ernte erfolgreich transfizierter Embryonen und sezieren die elektroporiertem Spinal Cord Halbiert HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 2-3 Stunden für jeweils 10 Embryonen und Erträge 1-2 Ug Gesamt-RNA pro Embryo. Die Präparation der Neuralrohren erfordert feinen Bewegungen und einige Trainingseinheiten können, bevor sie auf experimentellen Proben notwendig sein. <ol><li> Dekontamination von metallischen Dissektionswerkzeuge mit RNase Dekontaminationslösung oder durch Einbrennen bei 150 ° C für 4 h 12 und bereiten DEPC behandeltem PBS. Verwenden Sie nur neue zertifizierte RNase-freie Kunststoffgeschirr. HINWEIS: Nach der Ernte ist es wichtig, eine Standardbehandlung folgen, um RNase Kontamination während Dissektion zu verhindern. </li><li> Ernten Sie die Embryonen mit einem Paar feine Präparierscheren und gesiebt Sammlung Löffel. Halten Sie die Embryonen in kaltem DEPC-behandeltem PBS in einer 100 mm Petrischale. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, schneiden Sie die gesamte Flankenbereich (zwischen der hinteren Grenze des vorderen Extremitätenknospe und die vordere Grenze des hinteren Gliedmaßenknospe) und übertragen Sie diesen Abschnitt, um eine neue Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS. </li><li> Verwenden Sie zwei feinen Glasnadeln an drei verschiedenen perforierenPunkte auf jeder dorsolateralen Seite des Embryos zwischen dem Neuralrohr und paraxiale Mesoderm. </li><li> Führen Sie die beiden Glas Nadeln in der zentralen Perforation und langsam bewegen einer von ihnen weg entlang der Neuralrohr anterior-posterioren Achse. Wiederholen Sie dies für die Perforationen, die nicht von den ersten Sätzen erreicht wurden. Entfernen Sie das freistehende paraxialen Mesoderm mit einer feinen Pinzette. </li><li> Drehen Sie den Embryo seitwärts, legen die Spitzen der Pinzette zwischen dem Neuralrohr und der Chorda und schieben Sie sie in entgegengesetzte Richtungen entlang der anterior-posterioren Achse, die beiden Strukturen zu trennen. HINWEIS: Dies sollte auch die Abschaffung der meisten der Mesoderm noch mit dem Neuralrohr angebracht. </li><li> Entfernen Sie gegebenenfalls gröberen mesodermic Gewebe, das durch Ziehen mit einer Pinzette unter leichtem Halten des Neuralrohr mit einer anderen Pinzette befestigt bleiben. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie leicht das Neuralrohr an eine andere Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS mit einemRNase-freie Glaspasteurpipette zu einer manuellen Pipette Pumpe gekoppelt und halten Sie auf Eis, bis alle Rohre werden seziert. </li><li> Teilen Sie die Neuralrohren in zwei Hälften. Dazu legen Sie die scharfe Spitze eines geschlossenen Pinzette in das Lumen und öffnen Sie die Dachplatte, indem Sie die Pinzette heraus durch sie. Danach trennen Sie die Hälften durch Schneiden der Bodenplatte mit der Pinzette Tipps. </li><li> Art, die aus nicht-elektroporiert Hälften unter einem Fluoreszenz Binokular und in ein 1,5-ml-Röhrchen mit eiskaltem DEPC-behandeltem PBS gefüllt elektroporiert. Falls nötig, schlagen Sie das Mikroröhrchen vorsichtig, um jedes Gewebe an den Kunststoffwänden befestigt zu lösen und Sedimentation der Rohre zu fördern. </li><li> Spin bei 100 × g für 3 sec und sehr langsam zu entfernen, so viel wie möglich PBS mit einer 1 ml Pipette. Tun Sie dies, während man eine Lichtquelle, die durch den Mikroröhrchen glänzt zu überwachen, wenn eine embryonale Material auf die Pipettenspitze gesaugt; Wenn dies geschieht, langsam entladen und wiederholen Sie den centrifugation. </li><li> In 70 ul Lyse-Lösung für die RNA-Extraktion pro Neuralrohr Hälfte und Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und kräftig vortexen. Wiederholen Sie den 5 min Inkubation und Vortexen zwei weitere Male. Bei -80 ° C. </li><li> Sammeln mindestens acht Neuralrohr Hälften pro Probe, um eine ausreichende Ausbeute für den nächsten Schritt zu gewährleisten. Pool kleinere Proben, wenn mehrere Elektroporation / Dissektion Sitzungen sind erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von neuronalen Rohre anzuhäufen. Bewahren ausreichende Proben für Duplikate oder dreifach für jede Bedingung. </li></ol> 3. Entschlacken RNA und Planen Bibliotheken für Illumina Sequenzierung <ol><li> Proben von -80 ° C Lagerung entfernen und auf Eis für 15-30 min. Wieder Auftauen bei Raumtemperatur bis zur Beendigung. </li><li> Vortex gut und bei Raumtemperatur lassen Sie für 5 min. Vortex wieder und Zentrifuge bei 15.000 g für 1 min, um unlösliches Material zu pelletieren. </li><li> Den Überstand in ein neues Röhrchenund RNA-Extraktion gehen nach der Gesamt-RNA Isolation Kit manuelle Anweisungen. Eluieren in der empfohlenen Mindestvolumen, um die Konzentration zu erhöhen. HINWEIS: DNase-Behandlung nach clean-up ist, um eine mögliche Kontamination von genomischer DNA-Sequenzen in RNA-Seq Datensätze zu vermeiden empfohlen. </li><li> Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen und zu entfernen 5 ul für die Qualitätskontrolle-Analyse. Bewahren Sie die restliche Probe bei -80 ° C bis Bibliothek Vorbereitung; Diese Proben sollten nur einmal aufgetaut werden, um RNA-Abbau zu vermeiden. </li><li> Führen gereinigte RNA in einem Bioanalyzer Instrument mit dem RNA 6000 Nano Kit; RIN-Wert muss mindestens über 7, um fortzufahren. </li><li> Generieren Sie Bibliotheken mit einem Illumina kompatiblen RNA-Seq-Bibliothek Vorbereitung Kit und multiplexen bis zu 4-Bibliotheken in einer Spur eines HiSeq Instrument auf 100 bp Einzel liest erzeugen. Wenn möglich, schließen Sie alle Proben im gleichen Lauf um mögliche technische Artefakte zu minimieren. HINWEIS: Diese sollte auf 50 Mio. r ergeben sichEADS pro Probe, die mehr als genug, um die Abdeckung für die meisten Gene 13 zu erhalten. </li></ol> 4. Vergleichen RNA-Seq Datasets in der Galaxy Public Server 10. ANMERKUNG: Server Speicherplatz ist begrenzt und Experimente zu vergleichen viele Proben eine vollständige Löschung des Zwischendateien in den Filterschritte generiert erfordern. <ol><li> Erstellen Sie ein Benutzerkonto in der Galaxy öffentlichen Server ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) und FTP-Upload der Illumina-Datasets in fastq Format. </li><li> Bereiten Sie hochgeladene Dateien mit dem FastqGroomer 14 Tool unter der NGS: QC und Manipulation Menü; wenn die Qualitätswerte sind bereits in Phred + 33 (Sanger) codiert, überspringen Sie diesen Schritt durch einfache Änderung der Dateityp unter den Attributen für jeden Datensatz fastqsanger. </li><li> Analysieren Sie die allgemeine Qualität der jeden Datensatz mit der FastQC Tool unter der NGS: QC und Manipulation michnu. HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit sollte der resultierenden Grafik für pro Basensequenz Qualität und pro Basensequenz Inhalt gegeben werden, da diese Schätzungen für die zum Beschneiden der Enden der liest verwendeten Parameter bereitzustellen. </li><li> Trim liest verwerfen 3&#39;-Enden mit Qualitätsdaten günstig mit der fastq Qualität Trimmer 14 unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um nur bearbeiten, 3&#39;-Enden für den Qualitätsfaktor unter 20. </li><li> Entfernen Adaptersequenzen aus liest mit Hilfe des Tools Clip ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um zu verwerfen liest mit weniger als 45 bp nach links, geben Sie die Sequenz der verwendeten Adapter und wählen Sie den Ausgang, beide abgeschnitten und nicht-begrenzten Sequenzen umfassen. Außerdem entscheiden nicht auf Sequenzen mit unbekannten Basen zu verwerfen, da die meisten geringer Qualität Basen wurden bereits im letzten Schritt entfernt. </li&gt; <li> Verwenden der Werkzeug Trim-Sequenzen ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü schneiden Sie die ersten Grundlagen der liest bis 5 &#39;von FastQC detektierten Sequenz Bias (typischerweise 10) zu entfernen. HINWEIS: An dieser Stelle ist es eine gute Idee, FastQC erneut ausführen und Vergleichen mit der vorherigen Analyse zu bestimmen, ob die Datenmenge Qualität wurde verbessert. </li><li> Laden und entpacken Sie die neuesten Hühnergenom Anordnung für die UCSC Genom-Browser von Illumina iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) und laden Sie das gesamte Genom fasta Formatdatei und die Gene Annotation GTF Formatdatei durch die Galaxis Geschichte mit der Upload File unter dem Get Data-Menü. </li><li> Karte liest für jede Probe, um das Huhn-Genom mit Hilfe der Ausrichter TopHat2 15 unterdie NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie, um ein Genom aus der Geschichte zu verwenden (wählen Sie die fasta Datei in Schritt 4.7 hochgeladen). </li><li> Baue eine vorhergesagte Transkriptom für jede Probe mit Manschettenknöpfe 16 unter den NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung als Richtlinie verwenden (wählen Sie die GTF-Datei in Schritt 4.7 hochgeladen) und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig. </li><li> Merge prognostiziert Transkriptomen für alle Proben mit Cuffmerge 16 unter der NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung (GTF-Datei aus Schritt 4.7) und die Sequenzdaten (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) zu verwenden. </li><li> Vergleichen BAM Dateien TopHat2 für jede Probe mit Cuffdiff 16 unter der NGS generiert: RNA-Analyse-Menü. Bei den Feld Transcripts wählen michrged Transkriptom von Cuffmerge generiert und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig. </li><li> Sortieren differentielle Expression Testen Tabellen numerisch aufsteigend in Spalte 13 (Q-Wert) mit dem Werkzeug Sortieren unter dem Filter und Menü sortieren. HINWEIS: Gene / Transkripte, die signifikante differentielle Expression zwischen experimentellen Bedingungen werden die niedrigsten q-Werte zu präsentieren. </li><li> Um die Ergebnisse visuell mit Abdeckung Graphen zu überprüfen, zuerst konvertieren BAM Dateien bedGraph Format mit dem Werkzeug erstellen BedGraph der Genomabdeckung 17 unter dem Menü bedtools. Deaktivieren Meldung von Regionen ohne Abdeckung, wählen zu verbindenden Einträge im Unterschied Abständen zu behandeln und zu skalieren die Deckung durch einen Faktor, der Sequenzierung Tiefe für alle Datensätze, die verglichen werden normalisiert. </li><li> Konvertieren Sie die resultierende bedGraph Datei an bigwig Format unter Verwendung derWerkzeug Perücke / BedGraph-to-Bonzen ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) unter dem Menü Formate konvertieren. Laden Sie die Dateien als individuelle bigwig Spuren im UCSC Genom-Browser ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) für die galGal4 Montage und suchen ein Gen von Interesse, um die Abdeckung in den Datensätzen zu visualisieren. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier bieten wir Richtlinien zur Analyse Wirkungen nach der Elektroporation des Huhns Rückenmark. Obwohl Elektroporation von DNA-Vektoren wird häufiger verwendet, um ein Gen von Interesse überexprimieren, kann man auch Konstrukte dominant Negativen quimeric Proteine ​​oder Vorstufen Codierung verwenden für siRNAs zur Genfunktion knock-down Bedingungen 19-21 erzeugen. In der Tat kann den Vergleich der Transkriptom Profile sowohl Verstärkungs- und Verlust der Funktionsanalyse resultierenden darauf hin Gene diffe...

Genetische Untersuchungen an lebenden Organismen verwenden häufig den Hühnerembryo als Modell, weil in ovo Elektroporation stellt eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um embryonale Strukturen teilweise Transfektion in vivo mit DNA-Konstrukte 1-5. Bicistronische Expressionsvektoren, die ein Transkript, das ein fluoreszierendes Reporter zusammen mit dem Gen von Interesse, wie pCIG 6 oder Pmes 7 kodieren, ermöglichen eine schnelle Überprüfung der Transfektion Qualität in der gewünschten Region unter einem Stereomikroskop vor der Verarbeitung Embryonen für Downstream-Analyse. Mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierung ist es nun möglich, digitale gesamte Transkriptom Expressionsprofile von RNA-Proben unter Verwendung von RNA-Seq 8,9 erhalten. Statt also zeitaufwendige Verfahren, die Analyse von nur wenigen Genprodukte parallel ermöglichen, wie in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und qPCR, Herstellung von cDNA-Bibliotheken fürHochdurchsatz-Sequenzierung kann Informationen des gesamten Transkriptoms. Beobachtung der experimentellen Effekte auf die Expression von jedem einzelnen Gens kann wiederum bieten leistungsstarke Einblicke in die Wege, durch das Konstrukt verwendet verändert. Dies ist besonders einfach, wenn eine genomische Anordnung für den verwendeten Organismus ist, wiederum ist damit der Hühnerembryo ein geeignetes Modell. Wenn der Benutzer Zugang zu einer zuverlässigen Genomsequenzierung Zentrum hat, ist das Hauptproblem hoher Qualität zu erhalten RNA-Proben. Diese Arbeit zeigt, ein Verfahren zur Gewinnung von RNA Proben transfiziert Neuralrohren für RNA-Seq sowie den nachgeschalteten Schritten zur in silico Analyse der resultierenden Datensätze. Nach Elektroporation bei HH12-13 gefolgt von 48 h Inkubation wurden die transfizierten Stamm Rückenmarkshälften in Ribonuklease freien Bedingungen seziert sofort lysiert und weiteren Abbau durch ultra-niedrigem Gefrierpunkt geschützt, bis RNA-Reinigung und Bibliotheks preparatIonen. Das Galaxy öffentlichen Server 10 bietet Zugriff auf kostenlose Ressourcen für die Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. Die Menge an Speicherplatz für registrierte Benutzer angeboten wird, genug für kleine Versuchs wodurch die Notwendigkeit für die lokalen Computerinfrastruktur. RNA-Seq Datenanalyse umfasst Filterung, Ausrichtung und Quantifizierung / Vergleich der Genexpression. Obwohl es allgemeine Richtlinien für die RNA-Seq Datenanalyse, werden Filterparameter hängen weitgehend von der Qualität der Sequenzierungs und sollte nach Qualitätskontrollanalyse der Ausgangsdaten bestimmt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um zu erhalten und vergleichen RNA-Seq Profile embryonalen Hühnerrückenmark in vivo transfiziert. Als repräsentative Ergebnis Vergleich der Datensätze von zwei unabhängigen Kontrollproben mit einem leeren Vektor transfiziert zeigte, daß das Verfahren ist reproduzierbar und sollten Identifizierung differentiell Expres ermöglichensed-Transkripte in experimentellen Proben. Daher Anwendung dieser Methode hat das Potential, die Anzahl von Entdeckungen nach einem einzigen Versuch stark erhöhen und somit eine große Menge von Daten für nachfolgende Untersuchungen.

<table><tbody><tr><td>Tusche</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 Nadel</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Blau 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Lebensmittelfarbstoff zur Visualisierung der DNA-Injektion</td></tr><tr><td>Ringer's Solution (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7,2 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,225 g CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,02 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O auf 800 ml und pH-Wert auf 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O bis 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Filter und Autoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 8 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1,15 g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O auf 800 ml und pH-Wert auf 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O bis 1 L und Filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Kräftig schütteln und über Nacht bei Raumtemperatur</td><td></td><td></td><td></td> stehen lassen</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Autoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieblöffel</td><td>Beliebiger Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm Petrischalen aus Polystyrol</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase-Dekontaminationslösung</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Feinspitzschere</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lieferant Gerade Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Beliebig Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gezogene Glasnadel aus 1,1 x 75 mm Glaskapillarröhrchen</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9'' Glas Pasteurpipette</td><td>Beliebiger Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manuelle Pipettenpumpe</td><td>Beliebiger Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchsichtige 1,5 ml Mikrozentrifuge Polypropylen-Röhrchen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Lösung für die RNA-Stabilisierung</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNAwässriges Gesamt-RNA-Isolierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologisches Ethanol</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Elektrophorese Bioanalysegerät</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Truseq RNA-Probenvorbereitungskit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analyse der differentiellen genexpression in elektroporiertem küken embryonale spinal cord

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Die In-Ovo-Elektroporation des Neuralrohrs des Kükens ist eine schnelle und kostengünstige Methode zur Identifizierung der Genfunktion während der neuronalen Entwicklung. Die genomweite Analyse differentiell exprimierter Transkripte nach einer solchen experimentellen Manipulation hat das Potenzial, ein nahezu vollständiges Bild der nachgelagerten Effekte zu erhalten, die durch das transfizierte Konstrukt verursacht werden. Diese Arbeit beschreibt eine einfache Methode zum Vergleich von Transkriptomen aus Proben transfizierter embryonaler Rückenmarks, die alle Schritte zwischen der Elektroporation und der Identifizierung differentiell exprimierter Transkripte umfasst. Die erste Stufe besteht aus Richtlinien für die Elektroporation und Anweisungen für die Dissektion von transfizierten Rückenmarkshälften von HH23-Embryonen in einer ribonukleasefreien Umgebung und die Extraktion hochwertiger RNA-Proben, die für die Transkriptomsequenzierung geeignet sind. Die nächste Stufe ist die bioinformatische Analyse mit allgemeinen Richtlinien für die Filterung und den Vergleich von RNA-Seq-Datensätzen auf dem öffentlichen Galaxy-Server, wodurch eine lokale Rechenstruktur für kleine bis mittelgroße Experimente überflüssig wird. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass mit den Dissektionsmethoden qualitativ hochwertige RNA-Proben erzeugt werden und dass die Transkriptome aus zwei Kontrollproben im Wesentlichen gleich sind, eine wichtige Voraussetzung für den Nachweis von differentiellen Expressionsgenen in experimentellen Proben. Darüber hinaus wird ein Beispiel angeführt, bei dem die experimentelle Überexpression eines DNA-Konstrukts nach dem Vergleich mit Kontrollproben visuell verifiziert werden kann. Die Anwendung dieser Methode kann ein mächtiges Werkzeug sein, um neue Entdeckungen über die Funktion neuronaler Faktoren zu ermöglichen, die an der frühen Entwicklung des Rückenmarks beteiligt sind.

Um die beschriebene Methode zu validieren, wurden zwei Kontrollproben aus Embryonen mit dem leeren Vektor Pmes 7 und eine Probe von Embryonen mit dem gleichen Vektor, der die Einlage zu konstruieren SCRT2-ZNF, die die Zinkfinger-Domänen von Hühner SCRT2 18 kodiert, transfiziert elektroporiert erzeugt. Proben ergab 11-22 ug Gesamt-RNA wurden jeweils aus Pools von 8 bis 12 Embryonen. Alle drei Proben erzielt eine optimale RIN-Wert von 10 in einer Qualitätsprüfung mit dem Bioanalyzer Gerät an ...

Dieses Video zeigt die grundlegenden Schritte zur Durchführung einer Gesamttranskriptomanalyse an präparierten embryonalen Rückenmarksproben von Küken nach der Transfektion mit In-Ovo-Elektroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expressionsniveaus aller Gene und Proben aus dem embryonalen Rückenmark von elektroporierten Küken zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zuerst in der Ovo die rechte Seite der frühen embryonalen Neuralrohre poriert und die Embryonen bis zum gewünschten Stadium rekubiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, erfolgreich transfizierte Neuralrohrhälften in einer RNA-freien Umgebung zu präparieren und so schnell wie möglich mit der Lyse fortzufahren.Der dritte Schritt besteht darin, RNA zu isolieren und die Proben einer Bibliotheksvorbereitung und Hochdurchsatzsequenzierung zu unterziehen. Der letzte Schritt besteht darin, die Datasets zu verarbeiten, um Sequenzierungsartefakte zu entfernen. Ordnen Sie Rassen dem Genom zu und weisen Sie jedem Gen Expressionsniveaus zu.Letztendlich können die Ergebnisse durch den Vergleich der Expressionsniveaus unter Kontroll- und Versuchsbedingungen differentiell exprimierte Gene zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist bei der Dissektion der Neuroröhre von entscheidender Bedeutung. Die Schritte sind schwer zu erlernen, da wir mit der Manipulation von Embryonen vertraut sein müssen.Für diese Demonstration wurden die Embryonen mit dem GFP-exprimierenden Konstrukt am Neuralrohr transformiert. Bereiten Sie sich darauf vor, zwei Stunden lang an bis zu 10 Embryonen zu arbeiten, um ein bis zwei Mikrogramm Gesamt-RNA pro Embryo zu sammeln. Unter RNAs, freien Bedingungen, entnehmen Sie die Embryonen mit einer feinen Präparierschere und einem SVE-Entnahmelöffel und übertragen Sie jeden Embryo in die Kälte.DEPC-behandelt. PBS verwendete eine Lösung für alle Schritte der Neuralrohrisolierung: Mit einer feinen Pinzette wurde die gesamte Flankenregion eines Embryos zwischen den Knospen der Gliedmaßen entfernt. Schieben Sie diesen Abschnitt mit der Rückenseite des Gewebes nach oben in eine frische, kalte Lösung.Verwenden Sie zwei feine Glasnadeln, um drei Punkte auf jeder dorsalen lateralen Seite des Embryos zwischen dem Neuralrohr und dem parialen Mesoderm zu perforieren. Führen Sie nun die beiden Glasnadeln in die Mittelperforation ein und bewegen Sie sie entlang der AP-Achse auseinander. Tun Sie dies bei Bedarf durch jede Perforation, um das parale Mesoderm endgültig zu lösen, dieses Gewebe zu entfernen und zu entsorgen.Drehen Sie dann den Embryo zur Seite und führen Sie die Spitzen von zwei Pinzetten zwischen das Neuralrohr und den Knotenstrang ein. Schieben Sie sie entlang der AP-Achse auseinander, um die Strukturen zu unterteilen. Entfernen Sie zum Schluss größere Stücke von Medgewebe aus dem Neuralrohr, indem Sie es vorsichtig mit einer Pinzette sichern, während Sie das überschüssige Mesoderm abzupfen.Übertragen Sie dann das Neuralrohr vorsichtig in eine frische, kalte Lösung. Sammeln Sie mit einer Glaspipette und einer Handpumpe alle benötigten Neuralrohre und legen Sie sie auf Eis, bevor Sie fortfahren. Teilen Sie nun jedes der Neuralrohre in zwei Hälften.Führen Sie eine scharfe Pinzette in das Lumen ein und reißen Sie die Dachplatte durch. Schneide dann mit der Pinzette die Bodenplatte durch und teile das Taschentuch in zwei Hälften. Sortieren Sie mit einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop die elektroporierten von den nicht elektroporierten Hälften.Übertragen Sie die sortierten Neuralrohrhälften in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit frischer Lösung. Schnippen Sie mit diesen Röhren, um das gesamte Gewebe nach unten zu bringen. Als nächstes drehst du die Röhren für ein paar Sekunden bei 100 GS nach unten.Saugen Sie dann sehr vorsichtig bei hellem Licht den Snat an. Wenn Gewebe nach oben gezogen wird, werfen Sie es langsam aus und wiederholen Sie die Drehung. Sobald die Neuralrohrhälften von der Lösung befreit sind, fügen Sie 70 Mikroliter pro Neuralrohr hinzu, die Hälfte des Lysepuffers in das Rohr.Schnippen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie es alle fünf Minuten 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, wirbeln Sie das Röhrchen kräftig vor und fahren Sie mit dem Sammeln der RNA fort, um die RNA zu reinigen. Für die Sequenzierung sollten Sie mindestens acht Neuralrohrhälften pro Probe haben. Andere Ansammlungen von Lyce-Neuralrohren, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, können in die Sammlung eingebracht werden. Beginnen Sie damit, sie 15 bis 30 Minuten lang auf Eis aufzutauen, und beenden Sie dann das Auftauen bei Raumtemperatur.Nach dem Auftauen alle Proben kräftig vorziehen und fünf Minuten ruhen lassen. Anschließend werden die Proben erneut vortext und bei 15.000 GS eine Minute lang zentrifugiert. Um unlösliches Material loszuwerden, übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und fahren Sie mit der Extraktion fort.Schließen Sie den Prozess mit einem RNA-Isolationskit ab, indem Sie die RNA in der größtmöglichen Konzentration ausweichen. Für dieses Protokoll ist ein Galaxy-Website-Konto erforderlich, um das erforderliche Speicherkontingent sicherzustellen. Zuerst laden Sie die FASTQ-Dateien per FTP auf die Site hoch, es sei denn, die Qualitätsmerkmale sind bereits in Shred plus 33 codiert.Bereiten Sie zunächst die hochgeladenen Datensätze mit dem FASTQ-Groomer-Tool im Menü NGS QC and Manipulation vor. Andernfalls ändern Sie unter Attribute den Dateityp in FASTQ sender. Verwenden Sie anschließend im Menü NGS QC and Manipulation das FAST QC-Tool, um die allgemeine Qualität der Datensätze zu analysieren.Wählen Sie im selben Menü den FASTQ-Qualitätstrimmer aus, um die drei Prime-Enden mit geringer Qualität zu verwerfen. Es sollte ein Qualitätsfaktor von 20 oder höher verarbeitet werden. Gehen Sie nun im selben Menü zum Clip-Tool.Legen Sie dieses Werkzeug so fest, dass Lesevorgänge mit weniger als 45 Basispaaren verworfen werden. Geben Sie die Adaptersequenz ein. Deaktivieren Sie die Option zum Verwerfen von Lesevorgängen mit unbekannten Basen, und wählen Sie die Ausgabe so aus, dass sie beschnittene und nicht beschnittene Sequenzen enthält.Fahren Sie mit dem Werkzeug für Trimmsequenzen fort. Verwenden Sie diese Option, um die ersten Basen des Lesevorgangs zu kürzen, um die Verzerrung der fünf Primsequenzen zu entfernen, die von FAST qc erkannt wird. Der nächste Schritt besteht darin, die neueste Hühnergenom-Assemblierung von der Illumina I-Genom-Site herunterzuladen und zu entpacken.Laden Sie dann die Datei mit dem schnelleren Format des gesamten Genoms und die Annotationsdatei im GTF-Format des Gens in die Galaxiengeschichte hoch. Ordnen Sie nun die Reads für jede Probe dem Genom zu, indem Sie das Analysemenü N-G-S-R-N-A aufrufen und das Top-Hat-Two-Tool auswählen. Wählen Sie die hochgeladene Fasta-Datei aus der Galaxie-Historie als Referenzgenom aus.Wählen Sie als Nächstes im selben Menü das Manschettenknopf-Werkzeug, um ein vorhergesagtes Transkriptom zu erstellen. Wählen Sie für jedes Beispiel die GTF-Datei aus, die als Referenzanmerkungshilfe verwendet werden soll. Wählen Sie Bias-Korrektur mit der FASTA-Datei für die Sequenzdaten durchführen und aktivieren Sie die Option Multi-Read-Korrektur verwenden.Führen Sie dann alle assemblierten Transkriptome mit dem Werkzeug zum Zusammenführen der Manschette zusammen. Wählen Sie mit diesem Werkzeug die GTF-Datei für die Referenzanmerkung und die FASTA-Datei für die Sequenzdaten aus. Vergleichen Sie nun die BAM-Dateien, die von Top Hat Two für jede Probe generiert wurden, indem Sie das TIFF-Tool für die Manschette verwenden, das sich immer noch im RNA-Analysemenü befindet.Wählen Sie im Feld Transkripte das durch cuff merge generierte Merge-Transkriptom aus und aktivieren Sie die Optionen. Verwenden Sie die Multi-Read-Korrektur und führen Sie die Bias-Korrektur mit der FASTA-Datei für die Sequenzdaten durch. Der nächste Schritt besteht darin, die Differenztabellen zu sortieren. Wählen Sie in der Spalte Q-Wert das Sortierwerkzeug aus dem Filter- und Sortiermenü aus.Die Sequenzen mit signifikanten Unterschieden zwischen den experimentellen Bedingungen haben die niedrigsten Q-Werte in Spalte 13. Werfen Sie nun einen Blick auf die Abdeckungsdiagramme. Konvertieren Sie zunächst die BAM-Dateien mit dem Konvertierungstool im Menü "Bettwerkzeuge" unter den Optionen in Bettdiagrammdateien, deaktivieren Sie die Berichterstellung für Regionen ohne Abdeckung und behandeln Sie gespleißte Einträge als unterschiedliche Intervalle.Skalieren Sie die Abdeckung auch um einen Faktor, der alle Deckungen im Experiment normalisiert. Konvertieren Sie dann die resultierende Bettdiagrammdatei mit dem Tool im Menü "Formate konvertieren" in das Big-Wig-Format und laden Sie die Big-Wig-Datei als benutzerdefinierte Spur auf den UCSE-Server hoch. Verwenden Sie auf der USCS-Genombrowser-Seite die GAL-Vier-Assemblierungs- und Gensuche für die visuelle Abdeckung der Datensätze mit den beschriebenen Methoden: Neuralröhren, die leere PS-Vektoren exprimieren, wurden für ihre RNA geerntet.Dies geschah in doppelter Ausführung und die resultierende RNA war von sehr hoher Qualität mit einem optimalen RIN-Wert von 10 wie erwartet. Der globale Vergleich der Transkriptome der duplizierten leeren Vektorkontrollen zeigte keinen eindeutigen Unterschied und der Pearson-Korrelationskoeffizient lag bei Punkt 99. Außerdem gab es einen deutlichen Anstieg der Anzahl der Reads, die der Scratch-Two-Gensequenz in einer experimentellen Probe zugeordnet wurden, die die Scratch-Two-Zinkfingerdomänen exprimierte.Somit waren die Methoden empfindlich genug, um die vorhergesagte Anreicherung zu detektieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, den embryonalen Neurotubus zu isolieren und ein gutes Verständnis dafür zu haben, wie Sie IC-Datensätze verarbeiten und vergleichen, um differentiell exprimierte Gene zu finden, indem Sie die Schritte zur Siliziumanalyse in Abschnitt vier des Protokolls befolgen.

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

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