Die Haut von erwachsenen C. elegans ist ein handhabbares Modell für Studien zu epithelialen Wundreaktionen, einschließlich Wundverschluss, Narbenbildung und angeborener Immunität.
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Methodenartikel
Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in C. elegans
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die C. elegans Epidermis und Cuticula bilden eine einfache, aber anspruchsvolle Hautschicht, die lokalisierte Schäden durch Verwundung was zu reparieren. Untersuchungen der Wunde Antworten und Reparatur in diesem Modell haben unser Verständnis des Zytoskeletts und genomische Reaktionen auf Gewebeschäden beleuchtet. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die C gewickelt elegans erwachsenen Haut sticht mit Mikroinjektionsnadeln und lokale Laserbestrahlung. Nadel lokal Verwundung stört die Kutikula, Epidermis und der extrazellulären Matrix assoziiert und können auch innere Gewebe beschädigen. Laserbestrahlung führt zu mehr lokalisiert Schaden. Verwundung löst eine Reihe von leicht getestet Antworten einschließlich erhöhter epidermaler Ca 2+ (Sekunden-min), die Bildung und die Sperrung eines aktinhaltigen Ring an der Wundstelle (1-2 h), erhöhte Transkription des antimikrobiellen Peptids Gene (2-24 h) und die Narbenbildung. Im Wesentlichen alle erwachsenen Tiere Wildtyp überleben Verwundung, woMutanten in der Wundheilung oder andere Reaktionen defekt zeigen verringerte Überleben. Detaillierte Protokolle für die Nadel und Laser Verwundung und Assays zur Quantifizierung und Visualisierung von Wundantworten und Reparaturprozesse (Ca Dynamik Aktindynamik, antimikrobielles Peptid Induktion und Überlebensrate) dargestellt.
Einleitung
Wundheilung der Haut Mechanismen der biologischen Grundlagen Interesse und relevant für die menschliche Gesundheit. Wundheilung in Wirbeltieren und Säugetieren umfaßt eine komplexe Reihe von koordinierten Antworten von mehreren Geweben und Signalisierungs 1. Viele einfache genetische Modellorganismen sind auch fähig, Heilung von Hautwunden 2. Es ist daher von Interesse, genetisch manipulierbaren Modelle der Haut die Wundheilung zu untersuchen. Wir und andere haben damit begonnen, Caenorhabditis elegans Verwendung als neues Modell für die Haut Wundheilung 3,4. Ziel dieses Protokolls ist es, eine breitere Gruppe von Forschern, ....
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Protokoll
Die folgenden Protokolle beschreiben die detaillierte Prozedur für C. elegans Haut zu verletzen und zum Testen von Wundreaktionen.
1. Nadel Verwundung 3,4
- Wachsen gesunde unstarved Würmer auf Standard NGM (Nematoden Wachstumsmedium) Platten mit E. coli OP50 Bakterien als Nahrung, in einem 20 ° C Inkubator gehalten.
HINWEIS: Methoden für die NGM-Agar-Platten und Routine Anbau von C. elegans kann www.wormbook.org 6. - Wählen Sie 25 L4-Stadium Würmer zu einer frisch ausgesät Platte 1 Tag vor Verwundung und Kultur bei 20 ° CO / N.
- Vor der Verwundung, ziehen N....
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Ergebnisse
Laser oder Nadel Verwundung wird eine schnelle und anhaltende Erhöhung der epidermalen Ca Ebenen auslösen wie bei Ca Sensoren wie GCaMPs (Abbildung 1) visualisiert. Das Ca Höhen tritt innerhalb von Sekunden und erhöht bleibt für zehn Minuten. Nadel Verwundung reproduzierbar resultiert in der Bildung von F-Actin-Ringe an Wundstellen (Figur 2); erscheinen diese innerhalb von Minuten, und nach und nach in der Nähe über 1-2 Stunden nach der Verwundung. Aktin-Ringe weniger oft nach genauer L.......
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Diskussion
Die Nadel und Laser Verwundung hier dargestellten Verfahren stellen komplementäre Ansätze, um die Fähigkeit des Epidermisepithel um Schäden zu reparieren. Laser Verwundung relativ lokalisierte und (je nach Laserkonfiguration) kann auf die Epidermis beschränkt werden, wobei nadel Verwundung stört die Epidermis, Kutikula und wahrscheinlich interne Basalmembranen. Needle Verwundung kann genauer ähneln Wunden, die durch Krankheitserreger oder mechanische Schäden in der natürlichen Umwelt zugefügt hat. In der Regel erfordert.......
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Offenlegungen
Den Autoren sind keine konkurrierenden Interessen bekannt.
Danksagungen
Nadelverwundungsmethoden für C. elegans wurden zuerst von Nathalie Pujol und Jonathan Ewbank entwickelt; wir danken Nathalie Pujol für ihre Kommentare zum Manuskript. Die Arbeit in unserem Labor zur epidermalen Wundreparatur von C. elegans wird durch ein Stipendium des NIH an A.D.C. unterstützt (R01 GM054657).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Petriplatte aus Kunststoff | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisol | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Kapillare aus Borosilikatglas | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Nadelabzieher | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Schneckenpickel (Platindraht) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 Lösung | Hausgemacht | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O bis 1 Liter. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren | |
| von Trizol | Invitrogen | 15596026 | Verwenden Sie 500 ml für 50 Würmer |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR-Gerät | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-Well-PCR-Röhrchen | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Bildanalysesoftware | Molekulare Bauelemente | Metamorph |
Referenzen
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
