Method Article

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke, Aedes albopictus

DOI:

10.3791/51961

⸱

November 30th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

In This Article

Summary

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RNA-Seq-Analysen werden immer wichtiger, um die molekularen Grundlagen adaptiver Merkmale in Nicht-Modellorganismen zu identifizieren. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene zwischen Diapause- und Nicht-Diapause-Aedes albopictus-Mücken beschrieben, von der Mückenaufzucht über die RNA-Sequenzierung bis hin zu bioinformatischen Analysen von RNA-Seq-Daten.

Abstract

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Photoperiodische Diapause ist eine wichtige Anpassung, die es Individuen ermöglicht, rauen saisonalen Umgebungen durch eine Reihe von physiologischen Veränderungen zu entkommen, vor allem durch Entwicklungsstillstand und reduzierten Stoffwechsel. Die Erstellung von globalen Genexpressionsprofilen mittels RNA-Seq kann wichtige Einblicke in die transkriptionellen Mechanismen der photoperiodischen Diapause liefern. Die Asiatische Tigermücke, Aedes albopictus, ist aufgrund ihrer einfachen Aufzucht, der leicht induzierten Diapause und der verfügbaren genomischen Ressourcen ein hervorragender Organismus für die Untersuchung der transkriptionellen Grundlagen der Diapause. Dieses Manuskript stellt einen allgemeinen experimentellen Arbeitsablauf zur Identifizierung diapause-induzierter transkriptioneller Unterschiede in A. albopictus vor. Aufzuchttechniken, Bedingungen, die für die Induktion der Diapause und Nicht-Diapause erforderlich sind, Methoden zur Schätzung des prozentualen Diapausenanteils in einer Population sowie RNA-Extraktion und Integritätsbewertung für Mücken sind dokumentiert. Ein Arbeitsablauf zur Verarbeitung von RNA-Seq-Daten von Illumina-Sequenzierern mündet in eine Liste differentiell exprimierter Gene. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll zur effektiven Identifizierung von Genen verwendet werden kann, die in A. albopictus aufgrund photoperiodischer Unterschiede auf transkriptioneller Ebene unterschiedlich reguliert sind. Mit bescheidenen Anpassungen kann dieser Arbeitsablauf leicht angepasst werden, um die transkriptionellen Grundlagen der Diapause oder andere wichtige Merkmale der Lebensgeschichte bei anderen Mücken zu untersuchen.

Introduction

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Schnelle Fortschritte in der Next-Generation-Sequencing-Technologie (NGS) bieten aufregende Möglichkeiten, die molekularen Grundlagen einer Vielzahl von genetisch komplexen ökologischen Anpassungen in einer breiten Vielfalt von Nicht-Modellorganismen1–3 zu untersuchen. Dieser Ansatz ist äußerst leistungsfähig, da er eine Grundlage für populations- und funktionelle genomische Studien von Organismen mit einer besonders interessanten und/oder gut beschriebenen Ökologie oder Evolutionsgeschichte sowie von Organismen von praktischem Interesse wie landwirtschaftlichen Schädlingen und Krankheitsüberträgern schafft. Daher führen NGS-Technologien zu raschen Fortschritten in den Bereichen der Ökologie und haben das Potenzial, Probleme wie das Verständnis der mechanistischen Grundlagen biologischer Reaktionen auf den schnellen aktuellen Klimawandel4, die Ausbreitung invasiver Arten5 und Wirt-Pathogen-Interaktionen6,7 zu lösen.

Das außergewöhnliche Potenzial von NGS-Technologien zur Beantwortung grundlegender und angewandter Fragen in der Ökologie und Evolutionsbiologie beruht zum Teil auf der Tatsache, dass diese Ansätze auf jeden Organismus angewendet werden können, und zwar zu einem moderaten Preis, der für die meisten Forschungslaboratorien machbar ist. Darüber hinaus liefern diese Ansätze genomweite Informationen, ohne dass a priori genetische Ressourcen wie ein Microarray-Chip oder eine vollständige Genomsequenz erforderlich sind. Um die Produktivität von NGS-Experimenten zu maximieren, ist jedoch eine sorgfältige Berücksichtigung des Versuchsdesigns erforderlich, einschließlich Fragen wie dem Entwicklungszeitpunkt und der Gewebespezifität der RNA-Probenahme. Darüber hinaus waren die technischen Fähigkeiten, die erforderlich sind, um die riesigen Datenmengen zu analysieren, die durch diese Experimente produziert werden, oft bis zu mehreren hundert Millionen DNA-Sequenz-Reads, eine besondere Herausforderung und haben die weit verbreitete Implementierung von NGS-Ansätzen eingeschränkt.

Neuere RNA-Seq-Studien zu den transkriptionellen Grundlagen der Diapause in der invasiven und medizinisch wichtigen Mücke Aedes albopictus liefern ein nützliches Beispiel für einige der experimentellen Protokolle, die zur erfolgreichen Anwendung der NGS-Technologie zur Untersuchung der molekularen Grundlagen einer komplexen ökologischen Anpassung in einem Nicht-Modellorganismus eingesetzt werdenkönnen 8–10. A. albopictus ist eine hochgradig invasive Art, die in Asien beheimatet ist, aber kürzlich in Nordamerika, Südamerika, Europa und Afrika eingedrungen ist11,12. Wie viele Insekten der gemäßigten Klimazonen überleben auch die gemäßigten Populationen von A. albopictus den Winter, indem sie in eine Art Ruhephase eintreten, die als photoperiodische Diapause bezeichnet wird. Bei A. albopictus führt die Exposition von Puppen und erwachsenen Weibchen gegenüber kurzen (herbstlichen) Tageslängen zur Produktion von Diapause-Eiern, in denen die embryologische Entwicklung abgeschlossen ist, aber die pharate Larve im Chorion des Eies in einen Entwicklungsstillstand eintritt, der das Ei refraktär gegenüber Schlupfreizen macht15–17. Diapause-Eier sind austrocknungsresistenter5,18 und enthalten mehr Gesamtlipide19 als Nicht-Diapause-Eier. Die photoperiodische Diapause bei A. albopictus ist daher eine maternal kontrollierte, adaptive phänotypische Plastizität, die für das Überleben unter den rauen Bedingungen des Winters in gemäßigten Klimazonen unerlässlich ist. Trotz der gut verstandenen ökologischen Bedeutung der photoperiodischen Diapause bei einer Vielzahl von Insekten20,21 ist die molekulare Basis dieser entscheidenden Anpassung bei keinem Insekt gut charakterisiert22. Bei Organismen wie A. albopictus, die im Stadium der Pharatlarve eine embryonale Diapause durchlaufen, bleibt es eine besonders zwingende Herausforderung zu verstehen, wie das von der Mutter empfangene photoperiodische Signal an die Nachkommen weitergegeben wird und im Verlauf der Embryonalentwicklung bestehen bleibt, um einen Stillstand im Pharatlarvenstadium zu verursachen.

Dieses Protokoll beschreibt die Aufzucht von Mücken, das Versuchsdesign und bioinformatische Analysen für NGS-Experimente (Transkriptom-Sequenzierung), die durchgeführt wurden, um die transkriptionellen Komponenten der photoperiodischen Diapause in A. albopictus aufzuklären. Dieses Protokoll kann für zusätzliche Studien der Diapause bei A. albopictus verwendet werden, kann angepasst werden, um die Diapause bei anderen eng verwandten Spezies zu untersuchen, wie z. B. bei anderen Aedine-Mücken, die eine Ei-Diapause durchlaufen23, und ist auch allgemeiner relevant für die Anwendung von NGS-Ansätzen zur Untersuchung der Transkriptionsgrundlagen einer komplexen Anpassung bei jedem Insekt.

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Protocol

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1. Larvenaufzucht von zwei A. albopictus Gruppen zum Erwachsenwerden

  1. Stellen Sie zwei Photoperiode Schränke mit programmierbaren Beleuchtung bei 21 ° C für eine optimale Diapause Ausdruck 16 und ca. 80% relativer Luftfeuchtigkeit.
    1. Programmieren Sie einen Schrank für einen 16L: 8D-Licht: Dunkel-Zyklus (ein nicht-Diapause induziert LD Photoperiode). Stellen Sie das zweite Gehäuse für eine 8L: 16D Licht: Dunkel-Zyklus (Diapause induziert) 13.
    2. "Licht an" Programm zur gleichen Zeit in beiden Schränke auf circadiane Zeit zwischen Photoperioden zu synchronisieren.
  2. Berechnen Sie die Menge der Eier erforderlich sind, um das Experiment durchzuführen. Ziel für 300 bis 500 Eier pro Käfig. Mindestens drei replizieren Diapause Käfige und drei replizieren nicht Diapause Käfige für die RNA-Generation benötigt. Dieser beläuft sich auf 1,800-3,000 Eier pro Experiment ca..
    1. Hatch die Eier durch Eintauchen Ei Papiere in ca. 500 ml VE H 2 O
    2. Hinzufügen ca. wie zuvor 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Grundfutter und Artemia beschrieben 24. Decken Sie Behälter mit Mesh, und halten Sie die Masche an Ort und Stelle mit einem Gummiband.
    3. Platzieren Sie in der Photoperiode LD Schrank für ca. 24 Std.
  3. Übertragungs geschlüpften Larven zu 10 x 10 x 2 cm Petrischalen mit ca. 90 ml gefüllt entionisiertem H 2 O.
    1. Halten Sie ca. 30 Larven pro Schale. Übertragen Larven zu reinigen Gerichte jeden 48-72 Stunden, zum Beispiel jeden Montag, Mittwoch und Freitag (MWF) 24.
    2. Feed ca. 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Boden Hundefutter und Artemia in VE-Wasser jeden MWF wie zuvor beschrieben 24.
  4. Bis drei Minuten vor vier Erwachsenen Käfige diese Einstellung für jedes Photoperiode Behandlung, wobei jeder Käfig einen biologischen Replikation.
    1. Von gegenüberliegenden Seiten des 9,5 l Eimer, schneiden Sie ein 10-für-14 cm Loch, und ein weiteres Loch mit 15 cm Durchmesser. Cover das erste mit Mesh. Geschnitten etwa eine Fußlänge eines orthopädischen Strumpf und kleben einem Ende um die Innenseite der anderen Bohrung.
    2. Schneiden Sie das Fußende der Strumpf aus und Knoten geschlossen - offen nur bei Zugriff auf das Innere des Käfigs erforderlich. Für den Käfig Deckel, schneiden Sie den gesamten Innenraum, so dass nur die Felge, und ersetzen Sie den Innenraum Kunststoff mit Mesh-24.
    3. Achten Sie auf die Photoperiode, replizieren Zahl, Käfig Startdatum und andere Informationen, die für das Experiment mit wasserfesten Stift auf der Seite des Käfigs.
  5. Den Boden der Erwachsenen Käfige mit feuchtem Filterpapier. Befeuchten des Filterpapiers mit ausreichend entionisiertem H 2 O, lokale Luftfeuchtigkeit im Käfigs zu erhöhen, aber vermeiden stehendes Wasser, das Eiablage auf dem Filterpapier 24 stimulieren kann. Überprüfen Sie das Filterpapier täglich zum Trocknen, wieder nass, wenn notwendig.
  6. Um eine ausreichende Eier für eine RNA-Bibliothek zu erstellen, mindestens 100 Frauen / 9,5 L cage, mit nicht mehr als 500 Mücken pro Käfig.
  7. Sammeln Puppen MWF und in eine kleine Tasse sauber H 2 O bei einer Dichte von nicht mehr als 50 Puppen pro 25 ml H 2 O Übertragen Sie die Puppen cup einem Erwachsenen Käfig. Platz Käfige in der jeweiligen Photoperiode Schrank - A. albopictus Puppen sind lichtempfindlich 15.
  8. Stellen Sie sicher, dass täglich H 2 O in Tassen ist sauber und klar, und entfernen abgestorbene Puppen, weil Aufbau von toten Puppen können Massensterben verursachen. Entfernen H 2 O Tassen, nachdem alle Puppen entstehen.
  9. Platzieren organische Rosinen auf dem oberen Gitter des Käfigs Zucker zur taucht Erwachsenen bereitzustellen. Überwachen Sie Rosinen, und ändern Sie sie alle 3-5 Tage, um Schimmel Ansammlung zu verhindern.

2. Wartung der Erwachsene zu Paarung und Eierproduktion zulassen

  1. Pflegen Käfigen bei hoher Feuchtigkeit (ca. 80%) durch Auskleiden der Käfigunterteil mit einem feuchten Filterpapier, und den Zugriff auf Nicht-schimmelig Rosinen, wie oben beschrieben (Abschnitons 1.5 und 1.9).

3. Blut-Fütterung

  1. Bereiten Sie sich darauf Blutzufuhr Weibchen zwischen zwei bis sechs Tage nach dem Schlüpfen, um sicherzustellen, dass Frauen haben mindestens acht eindeutige kurze Tage ausgesetzt worden, bevor der Eiablage beginnt für nahezu 100% Diapause Eier 14.
  2. Bereiten Sie die Hemotek Membran Zuführsystem. Stecken Sie die Zuführungseinheiten in die Stromversorgung. Die Temperatur einer jeden Einheit auf 37 ° C mit der Stellschraube. Mit einem elektronischen Thermometer und Sonde, um die Temperatur der Zuführungseinheit während der Kalibrierung zu messen.
  3. Bereiten Sie die Mahlzeit Reservoir. Dehnen Sie ein Quadrat von Kollagen Fütterung Membran über der Öffnung der Mahlzeit Behälter und sichern Sie sie mit einem O-Ring. Die Ecken, um Falten zu entfernen Ziehen; schneiden Sie die überschüssige Membran mit einer Schere.
    HINWEIS: Collagen Membran kann nicht gut für alle Mückenarten zu arbeiten, und es kann notwendig sein, verschiedene Arten versucht, die optimale Membran zu finden, wenn die Arbeit mit einemaußer A. Arten albopictus. Parafilm funktioniert gut mit Culex pipiens.
    1. Wenn Blut wird bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung gefroren gelagert, Tauwetter.
    2. Halten Sie den Behälter, so dass die Membran nach unten zeigt, werden nicht unterstützt, und die Einfüllöffnungen nach oben zeigt. Verwenden einer Transferpipette oder Spritze, um das Reservoir mit etwa 3 ml Vollblut von Hühnern, Natriumcitrat als Antikoagulans einfüllen. Siegel Einfüllöffnungen mit Kunststoffstopfen.
  4. Befestigen Sie das vorbereitet Reservoir zur Zuführung durch Aufschrauben auf das Gestüt auf der Wärmeübertragungsplatte auf der Unterseite des Förderers. Kehren Sie die Zuführung und setzen Sie ihn auf dem Käfig, Membranseite nach unten, so dass Mücken können durch die Maschen des Käfigs zu ernähren. Halten Sie die Zuführung auf den Käfig ca. 45 min zu Fütterung zu maximieren.

4. Anregung Eiablage

  1. Vier bis fünf Tage nach der Blutmahlzeit, rüsten jeden Käfig mit einem dunkel gefärbten 50 ml cmit rohen Samenkeimung Papier (Ei Papier) oder strukturierte nicht-gebleichten Papiertuch ausgekleidet und füllen auf halbem Weg mit VE-Wasser 9. Wenn mehr als 250 Mücken sind in einem Käfig, verwenden Sie zwei Tassen.
    HINWEIS: Bei kleinen Käfigen oder Einzel weibliche Fläschchen kann "Heu-Infusion" in Eiablagebehälter Eiablage durch den Geruch der mikrobiellen Flora 25 zu erhöhen.

5. sammeln und speichern Eggs

  1. Beginnen Eiersammlung innerhalb von 4-5 Tagen von blutsaugenden, weil die Eierproduktion Spitzen typischerweise etwa fünf Tage nach Blut Fütterung und dann nachlässt in der nächsten Woche.
  2. Vary Eiersammlung Frequenz auf Notwendigkeiten des Experiments. Für allgemeine Zwecke, sammeln Eier Papiere auf einer MWF Zeitplan. Entfernen Ei Papiere aus jedem Käfig und ersetzen mit frischem Papier. Zeigen kürzlich entfernt Papiere in Petrischalen und lagern in SD Photoperiode Schrank auf verwirrende Auswirkungen ei der Lagerung zu vermeiden.
  3. Lassen Sie Eier Papieren neu Haupt nass für 2 Tage nach der Eiablage an serösen Nagelhautbildung, die Ei Austrocknung Widerstand 26 erhöht ermöglichen.
  4. Etwa 48 Stunden nach der Sammlung, trockene Eier im Freien. Trocknen Sie das Papier, so dass es schlaff und leicht feucht anfühlen, aber nicht so feucht, dass das Papier dunkel von H 2 O oder stimuliert Schlüpfen der Eier.
    HINWEIS: Ein 6.5 "x 4" Papier kann etwa 3,5 Stunden dauern, um zu trocknen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu über-trocken Ei Papiere, da dies in Ei Austrocknung 27 führen.
  5. Reserve zusätzliche Eier sowohl von LD und SD-Photoperioden zu Diapause Häufigkeit zu beurteilen und interpretieren die photoperiodische Effekt (siehe Mess Diapause, Abschnitt 6).
  6. Für langfristige Lagerung, halten Ei Papiere bei 21 ° C und ca. 80% Luftfeuchtigkeit in Petrischalen. Halten Sie Petrischalen in einer Tupperware Vorratsbehälter mit einer Flasche Wasser auf lokale Feuchtigkeit zu halten, wie der Embryonalentwicklung dauert vier bis fünf Tage bei 21 ° C.
ove_title "> 6. Messen Sie Diapause Inzidenz

  1. Verwenden Sie zusätzliche vorbehalten Embryonen (siehe Stimulieren Eiablage, Abschnitt 4), die 7 bis 20 Tage alt, um die Diapause Antwort zu quantifizieren sind.
  2. Notieren Sie sich die Anzahl der auf jedem Ei papier Eier.
  3. Stimulieren Sie Eier, die von Notlaufeigenschaften einzelnen Ei Papiere in einem 90 ml Petrischale mit ca. 80 ml ​​VE H 2 O schlüpfen In etwa 0,25 ml Lebensmittel Gülle.
  4. Nach 24 Stunden tally die Anzahl der schraffierten ersten Larvenstadium. Legen Sie die Petrischale auf eine schwarze Oberfläche zu Larven zu visualisieren und legen Sie eine Lichtquelle auf einer Seite der Schale. Die Larven werden von der Lichtquelle weg bewegen, was eine klare Bilanz von einzelnen Larven. Entfernen Sie einzelne Larven mit einer Pipette beim Zählen erzählt einzelnen Larven zu verhindern.
  5. Platz Ei Papiere in eine neue Petrischale und wieder trocken. Re-Eier brüten nach ca. 1 Woche wieder übereinstimmen Eiern geschlüpft Verwendung des vorstehenden Verfahrens.
  6. Platz Ei Papiere mit dem restlichen u n-geschlüpften Eier in neue 90 ml Petrischalen mit ca. 80 ml ​​Bleichlösung 28. Sicherzustellen, dass die Eier Papiere vollständig in der Bleichlösung eingetaucht und lassen im Abzug über Nacht, um den Geruch der Bleich vermeiden.
    HINWEIS: Bleichlösung kann für ~ 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden, sollte aber ansonsten frisch hergestellt werden.
  7. Überprüfen Sie Eier mit einem Lichtmikroskop als Bleich das Chorion zu löschen und Visualisierung von embryonierten, un-geschlüpften Eiern. Wenn das Ei embryonierten, wird das Ei eine cremefarbene, mit den Augen als zwei kleine schwarze Punkte gegenübereinander auf der Rückenseite erscheinen. Tally die Anzahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern 13.
  8. Bestimmen Diapause Einfall mit der folgenden Formel:% Diapause = keine. embryonierte un-Eier ausgebrütet / (Nr. geschlüpften Eier + Nr. embryonierte un-Eier ausgebrütet) x 100 13.

7. RNA-Extraktion aus Eier / Larven pharate

NHALT "> Hinweis: Verwenden Trizol in einer Sterilbank.

  1. Pinsel Mücke Eier enthalten entwickelnden Embryonen oder pharate Larven an bestimmten Entwicklungszeitpunkten vom Ei Papiere Glasschleifer mit einer Kamelhaarbürste. Schleifen Sie die Eier in Trizol (1 ml pro 50 bis 100 mg Gewebe), bis sie vollständig pulverisiert. Verwenden Sie mindestens 400 Eier pro Bibliothek, um eine ausreichende RNA ergeben.
    1. Alternativ Snap freeze Eier in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C in Mikrozentrifugenröhrchen für bis zu einem Monat vor dem Mahlen in Trizol gespeichert.
  2. Führen RNA-Extraktion in Trizol gefolgt von Isopropanolfällung nach Herstelleranweisungen.
  3. Behandeln Sie die Bank mit RNase Dekontaminationslösung oder andere Mittel, um alle restlichen Nukleasen zu entfernen, um RNA-Abbau zu vermeiden.
    1. Behandeln Sie die extrahierte RNA mit DNase. Nach den Anweisungen des Herstellers, Inkubation der RNA-Proben mit DNase für 30 min bei 37 ° C. Verwenden Sie 1 und #181; l DNase für bis zu 10 & mgr; g RNA in einer 50 ul Reaktion. Erhöhung der Menge an DNase, wenn es mehr als 10 & mgr; g RNA in einer Reaktion.
    2. Inaktivierung von DNase durch Zugabe von 5 ul suspendiert DNase-Inaktivierung Reagenz. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur, dreimal während der Inkubationsperiode (leichter Verwirbelung).
    3. Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1,5 min. Die überstehende, die die behandelten RNA Proben in frische Röhrchen zur anschließenden Schritten.
  4. Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA-Proben mittels Fluorometrie. Senden Sie die Proben auf eine Spezialanlage mit geeignete Instrument für diese Aufgabe. Die Anlage wird auf dem Chip-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Größe der RNA-Spezies in der Probe durch Fluoreszenzfarbstoff in der Chip instilliert visualisiert bestimmen. Die Ergebnisse werden als ein Elektropherogramm zurückgegeben.
    1. Bestimmung der Integrität der Gesamt-RNA-Proben durch das Vorhandensein oder Fehlen von Abbauprodukten, wie durch das Vorhandensein o belegenf Peaks zwischen 18S und 5S rRNA Peaks auf der resultierenden Elektropherogramm (1B).

8. RNA Sequenzierung

  1. Senden der Gesamt-RNA-Proben mit einer ausreichend hohen Qualität (1A) und Menge (in der Regel> 3 ug pro Bibliothek) an eine kommerzielle Ordnungszentrum für den Bau von angereichertem Paired-End mRNA-Bibliotheken und mRNA-Sequenzierung nach Standardprotokollen.
  2. Wenn mehr als eine Spur wird für die Sequenzierung eines einzigen Experiment verwendet wird, aufgeteilt einzelnen Bibliotheken in zwei Fahrspuren für die Sequenzierung für technische Unterschiede zwischen den Fahrspuren während der Sequenzierung zu berücksichtigen.

9. Illumina lesen Reinigung

ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Bioinformatik Teil dieses Protokolls. Für eine vollständige Liste aller Programme und Ressourcen in der Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll verwendet, auf die Tabelle 1 verwiesen. InAußerdem STADT Datei 1 enthält Befehlszeilenbeispiele für jede der folgenden Bioinformatik Protokollschritte.

  1. Verwenden ssaha2 29 (Tabelle 1), um Gruppen aus 95% Identität oder höher, um der NCBI UniVec Core-Datenbank identifiziert (Tabelle 1), A. albopictus rRNA-Sequenz (GenBank # L22060.1) und Sequenzierung Adaptern (detaillierte Befehlszeilenbeispiele in STADT Datei-1 zur Verfügung gestellt). Entfernen Lesepaare mit Streichhölzern mit Perl oder eine ähnliche Scripting-Tool, beispielsweise durch Anpassung der bereitgestellten Perl-Skript (Supplemental Datei 2).
  2. Reinigen Sie verbleibende liest mit dem SolexaQA Paket 30 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1): schneiden Regionen mit phred Punktzahl Äquivalent von weniger als 20 mit den Standardeinstellungen des DynamicTrim.pl.
    1. Entfernen Sie liest die kürzer als 25 bp mit LengthSort.pl auf Vorwärts- und Rückwärts liest gleichzeitig. Bewerten Sie die Qualität der fastq gereinigt Dateien mit FastQC (Tabelle 1 ) - insbesondere, ob die pro-Basensequenz Qualität und die pro-Sequenz, Qualitätswerte sind über 20.

10. Digitale Normalisierung

  1. Führen Sie eine Runde von digitalen Normalisierung auf dem gereinigten liest mit Hilfe des Khmer-Werkzeug 31 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1), insbesondere normalize-by-median.py (mit k-mer Größe 20, eine Abdeckung Cut-off von 20, und x = 1e10).
  2. Alternativ, wenn eine Maschine mit hoher RAM zur Verfügung steht (Hunderte von GB), verwenden Sie Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl Skript (Tabelle 1).

11. De Novo Transkriptom Assembly

  1. Beim Zugang zu einem Computer oder einem Computer-Cluster mit bis zu 256 GB RAM und 24 CPUs, abhängig von der Größe der Anordnung.
  2. Verwenden Trinity 32 (Tabelle 1; Supplemental Datei-1), um die digital normalisierte Lese in Contigs gesetzt zu montieren. So verkleinernSpeichernutzung, verwenden --min_kmer_cov 2.

12. Montage Bewertung

  1. Führen assemblathon_stats.pl vom Assemblathon2 Projekt 33 auf der Fläche zu Trinity-Ausgang. Dieses Skript führt Grundrechenarten relevant Auswertung Montagequalität, wie die Anzahl der Gerüste, N50, Montage Zusammensetzung und (Tabelle 1; Supplemental Datei 1).

13. Markieren des Assembled Transkriptom

  1. Führen BLASTX (Tabelle 1) der Anordnung gegenüber einem Referenzprotein-Set; für Moskitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens und Aedes aegypti eignen Referenzen. Genauer gesagt, formatieren Sie das Referenzprotein fasta Datei für Explosion, gefolgt von blastx (Supplemental Datei 1).

14. Karte Liest der Versammlung Mit RSEM 34 (Tabelle 1)

  1. Erstellen Sie eine Datei "transcript-to-Gen-Karte", in dem dererste Spalte enthält die Referenz-Gen-IDs und die zweite Spalte die Fläche zu IDs. In einem Spreadsheet-Editor, tauschen die ersten und zweiten Spalte von der BLASTX Ausgang, und schreiben Sie diese Spalten in eine TXT-Datei. Verwenden Sie die Linebreak-Programm um Zeilenumbrüche in der resultierenden Textformat an den Unix-Format zu konvertieren.
  2. Erstellen Sie eine Referenzdatensatz aus der Transkriptom fasta Datei mit dem RSEM-Vorbereitung Verweis Skript, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.
  3. Berechnen Sie die Expressionswerte für jede Bibliothek mit dem Befehl RSEM-calculate-Ausdruck, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. Wie liest, verwenden Sie die gepaart fastq Dateien aus dem Lesereinigungsschritt (Schritt 9.2) ergibt.
    1. Wenn RNA aus einer biologischen Replikation wurde für die Sequenzierung in zwei Bahnen aufgeteilt, umfassen sowohl fastq Dateien im Ausdruck Berechnung, um eine einzelne Datei zu generieren.
  4. Konvertieren Sie die Ausdruck ergibt sich aus jeder Bibliothek zu einer Matrix leicht von anderen p verarbeitetROGRAMME mit dem mitgelieferten Skript RSEM-generate-Data-Matrix, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.

15. Differential Expressionsanalyse

  1. Installieren R und Kantenschneider (Tabelle 1).
  2. Verwenden read.delim die RSEM Ergebnisse aus Schritt 14.3 (Supplemental Datei-1) zu laden. Falls erforderlich, ergänzen die Zähler auf die nächste ganze Zahl.
    HINWEIS: Der Kantenschneider Leitfaden empfiehlt die Begrenzung der Datenmenge, um Gene mit hoch genug zum Ausdruck Bedeutung zu erkennen.
  3. Um die Daten für Edger zu formatieren, erzeugen eine DGEList Objekt aus der geladenen Datei (Supplemental Datei 1). Dann normalisieren die Daten mit TMM Normalisierung (Supplemental Datei 1). Schätzen Sie die gemeinsame und tagwise Dispersionen der Daten (Supplemental Datei 1).
  4. Identifizieren differentiell exprimierte Gene mit einem Benjamini-Hochberg korrigierten p-Wert <0,05 (Supplemental Datei 1). Zeichnen Sie die Verteilung der log-fach Wechsel vs. Fülle (Supplemental Datei 1).

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Results

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Fluorometrie zweier repräsentativer RNA Proben zeigten zwei Banden bei ca. 2000 nt (1A, B). Das Insekt 28S ribosomale RNA aus zwei Polynucleotidketten durch Wasserstoffbrücken, die sich leicht durch kurzes Erhitzen oder Agenten, die Wasserstoffbrückenbindungen 35 stören gestört zusammengehalten zusammen. Die resultierenden beiden Komponenten ungefähr die gleiche Größe wie der ribosomalen RNA 18S. Die zweite RNA-Probe zeigte eine hohe Abbauwerte (1B).

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Discussion

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Dieses Protokoll stellt Methoden, um differentiell exprimierte Gene aufgrund entdecken induzierte Diapause in A. photoperiodisch albopictus. Das Protokoll ist, dass es auf einzigartige Weise Moskito Aufzucht und Bioinformatik-Techniken, um alle experimentelle Aspekte eines molekularen Physiologie Programm zugänglich Anfänger machen signifikante - insbesondere für diejenigen, die sich auf die photoperiodische Diapause Antwort. Bestehende Verfahren, nach unserer Kenntnis nicht bieten so viele Details bei...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institutes of Health Stipendium 5R21AI081041-02 und die Georgetown University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inkubator - Modell 818Thermo-Scientific3751120 V
Raum mit kontrollierter UmgebungThermax ScientificN/ABegehbarer Raum mit kontrollierter Umgebung, der nach kundenspezifischen Spezifikationen von Thermax Scientific Products gebaut wurde. Eine größere Alternative zu einem Inkubator. http://thermmax.com/
Cool LeuchtstofflampePhilips3921834 W
Petrischale 100 mm x 20 mmFisher08-772-E
Filterpapier 20,5 cmFisher09-803-6J
9,5 l EimerPlasticanBway Produktehttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Dienstprogramm Stoff-Moskitonetz WeißJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopädische StrümpfeAlbahealth23650-040Artikel-Nr.: 081420
Bio RosinenNewman's OwnUPC: 884284040255
Eiablagebecher (braun)Fisher Scientific03-007-52Das Produkt ist eigentlich eine bernsteinfarbene 125-ml-Flasche, von der wir den Deckel abgesehen haben.
Recycelte PapierhandtücherSiebte Generation30BPT120
Modular Mates Square Tupperware SetTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass GrinderCorning Incorporated7727-2Diese Tenbroeck Tissue-Grinder brechen die Eier und setzen RNA in das TRI-Reagenz frei.
TRI ReagenzSigma AldrichT94241 ml TRI Reagenz pro 50-100 mg Gewebe auftragen. Achtung — Dieses Reagenz ist giftig.
TURBO DNA-freiAmbion/Life TechnologiesAM1907Dieses Kit erzielt eine höhere Ausbeute als die herkömmliche DNase-Behandlung mit anschließender Phenol-/Chloroform-Reinigung und ist einfacher in der Anwendung.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Großzügig auf die Tischoberflächen und alle Geräte auftragen, die mit den RNA-Proben in Kontakt kommen könnten. Die Lösung ist leicht alkalisch/ätzend, kann Reizungen verursachen und ist schädlich beim Verschlucken.
2100 BioanalysatorAgilent TechnologiesG2939AAPlatzieren Sie bis zu 12 RNA-Proben auf einem Chip.
Hemotek Membran-FeederHemotek 5W1Dieses System verfügt über 5 Fütterungsstationen, die gleichzeitig verwendet werden können. Inklusive PS5-Netzteil und Netzkabel; 5 FUI-Dosierer + Mehlbehälter und O-Ringe; Kunststoffstopfen, Hemotek Kollagen-Fütterungsmembran; Werkzeug zur Temperatureinstellung; und Werkzeug zum Ausziehen von Steckern. Die Postanschrift des Unternehmens lautet: Hemotek Ltd; Einheit 5 Unionsgericht; Alan Ramsbottom Weg; Großer Harwood; Lancashire, Großbritannien; BB6 7FD; Tel.: +44 1254 889 307.
Digitales Thermometer und SondeHemotek MT3KFUMicroT3 Thermometer und KFU Sonde. Dies wird verwendet, um die Temperatur jeder FUI-Fütterungseinheit einzustellen.
Hühnervollblut, unsteril mit NatriumcitratPel-Freez Biologicals33130-1Die 500 ml Blut wurden eingefroren und in 20 ml Aliquoten bei -80 ° gelagert; C für bis zu 1 Jahr. Tauen Sie das Blut vor der Anwendung mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur auf.

References

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