Summary
Et modul til enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som let tilpasses til en omvendt bredt synsfelt mikroskop og optimeret til 3-dimensionelle cellekulturer. Prøven er placeret inden for en rektangulær kapillar og via en mikrofluide system, fluorescerende farvestoffer, kan farmaceutiske midler eller lægemidler skal anvendes i små mængder.
Abstract
Et modul til lyspladen eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som let tilpasses til en omvendt bredt synsfelt mikroskop og optimeret til 3-dimensionelle cellekulturer, f.eks flercellede tumor sfæroider (MCT). De SPIM excitation modul former og afbøjer lyset sådan at prøven belyses af en lys plade vinkelret på påvisning af mikroskopet. Systemet er kendetegnet ved anvendelse af en rektangulær kapillær til at holde (og i en avanceret udgave også af en mikro-kapillær fremgangsmåde for roterende) prøverne ved synkron justering af belysningen plader og objektivlinsen anvendes til fluorescens detektion samt ved tilpasning af en mikrofluid system til anvendelse af fluorescerende farvestoffer, farmaceutiske midler eller lægemidler i små mængder. En protokol til at arbejde med dette system er givet, og nogle tekniske detaljer er rapporteret. Repræsentative resultater omfatter (1) måling af optage et cytostatisk lægemiddel (doxorubicin) og en delvis omdannelse til et nedbrydningsprodukt, (2) redox målinger ved anvendelse af en genetisk kodet glutathion sensoren ved tilsætning af et oxidationsmiddel, og (3) initiering og mærkning af cellenekrose ved inhibering af mitokondrie respiratoriske kæde. Forskelle og fordele ved den foreliggende SPIM modul i sammenligning med de eksisterende systemer er diskuteret.
Introduction
Ud over at veletablerede metoder (konfokal eller multi-foton laser scanning mikroskopi 1-4, struktureret belysning mikroskopi 5,6) lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) har vist sig at være en værdifuld metode til 3D billedbehandling 7,8, 9. Af særlig interesse er anvendelsen til 3-dimensionelle cellekulturer, f.eks flercellede tumor sfæroider (MCT), der anvendes i stigende grad til lægemiddelforskning forskning 10,11. Desuden SPIM er en privilegeret metode, når selv efter langvarig eksponering eller gentagne målinger lave doser lys er forpligtet til at opretholde prøven levedygtighed, da der for måling af hvert plan af prøven kun dette plan udsættes for lys. Dette er i modsætning til andre mikroskopi teknikker, hvor til påvisning af hver brændplanet hele prøven er belyst, således at der ved registrering af adskillige planer lysdosis opsummerer og kan skade prøven 12. Lys ark mikroskopi eller SPIM er baseret på belysning af prøven i retning vinkelret på observation vej, enten ved brug af en cylindrisk linse eller ved at scanne spændende laserstråle (for en gennemgang se ref. 8). Dette kræver ofte særlige prøvekamre 13,14 eller matricer, fx agarose 7,15, implementeret i særlige høje omkostninger mikroskoper. Som et alternativ til disse systemer et sammenligneligt enkelt belysningsindretning til SPIM er blevet udviklet og tilpasset til en konventionel inverteret mikroskop 16 (se figur 1). Den består af en laserstråle udvidet til en diameter på 8 mm og fokuseret af en cylindrisk linse (brændvidde 50 mm, numerisk åbning: 0,08) til en lys ark på 6-10 um tykkelse over en dybdeskarphed på omkring 100 um . Prøver er placeret i et rektangulært kapillær 600-900 um indvendig diameter placeret foran mikroskopet mål lens for fluorescensdetektion. Disse hovedtræk er i øjeblikket udfyldt og optimeres ved brug af avancerede mikro-kapillære tilgange til at holde og til at rotere prøverne, den synkrone justering af den lysende lys ark (i aksial retning) og objektiv, der anvendes til fluorescens detektion (identisk optisk vej længder af forskydning kræver en korrektion af det mekaniske foder), og tilpasning af et mikrofluidisk system til anvendelse af fluorescerende farvestoffer, farmaceutiske midler eller lægemidler, og dermed minimere de krævede mængder og udgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celle Sfæroide voksende og inkubation
- Eksperiment 1: Cell sphæroider inkuberet med et kemoterapeutisk lægemiddel
- Forbered agarose 1,5% i dyrkningsmediet ved tilsætning af 0,45 g agarose til 30 ml dyrkningsmedium (tilstrækkeligt til 6 plader).
- Blandingen opvarmes fra trin 1.1.1 til mindst 80 ° C under omrøring fra tid til anden.
- Fyld 50 pi af den opvarmede blanding fra trin 1.1.2 i hver brønd af en 96-brønds plade og lade det størkne inden for 1-2 timer. Opbevar pladerne lukket og dækket i køleskab ved 5 ° C indtil brug.
- Frø omkring 150 MCF-7-brystcancerceller i hver brønd i den forberedte plade med 96 brønde i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med Hams F-12-kulturmedium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin / streptomycin .
- Grow sfæroider i 5-7 dage op til en diameter på omkring 200-300 um i en inkubator ved 5% CO2 og 3776; C.
- Inkubér celle sfæroider med anthracyclinantibiotikum doxorubicinhydrochlorid i 6 timer i en koncentration på mellem 2 um og 8 uM (i dyrkningsmedium) i en inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Vask celle sfæroider med kulturmediet eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS) før mikroskopi.
- Eksperiment 2: Oxidation proces sfæroider udtrykker et redox-sensor
- Frø omkring 400 U251-MG-L106 glioblastomceller permanent transficeret med glutathion følsomme grønt fluorescerende redox sensor Grx1-roGFP2 i agarose-gel-coatede brønde (fremgangsmåden beskrevet i trin 1.1.1-1.1.3) i en 96-brønds plade i DMEM dyrkningsmedium suppleret med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og hygromycin B (150 ug / ml).
- Grow sfæroider i 5-7 dage op til en diameter på omkring 200-300 um i en inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Tilsæt 10 & #181 og l hydrogenperoxidopløsning (purum pa ≥ 30%) til 990 pi bi-destilleret vand for at skabe en 100 mM stamopløsning, der skal anvendes inden for 12 timer.
- Denne stamopløsning skal fortyndes fra trin 1.2.3 til 50 um i EBSS lige før forsøget.
- Inkubér celle sfæroider via mikrofluid systemet under måling med hydrogenperoxid 50 uM i EBSS til oxidation af redox sensoren.
- Eksperiment 3: Indledning og mærkning af cellenekrose inden sphæroider
- Seed omkring 400 celler (fx U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastomceller) i agarose-gel-coatede brønde (procedure beskrevet i trin 1.1.1-1.1.3) i en 96-brønds plade i DMEM dyrkningsmedium suppleret med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og hygromycin B (150 mg / ml).
- Grow sfæroider i 5-7 dage op til en diameter på omkring 200-300 um i en inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Inkubér cellensfæroider med mitokondrielle elektrontransport inhibitor rotenon i 3 timer ved en koncentration på 1 uM i dyrkningsmediet for at inducere cellulær nekrose. Derudover co-inkuberes med en grøn cytotoksicitet farvestof i 3 timer ved en koncentration på 1 ul i 1 ml dyrkningsmedium at mærke nekrotiske celler.
- Vask celle sfæroiderne med dyrkningsmedium eller EBSS før mikroskopi.
2. Lys ark Justering
BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater skal det sikres, at strålen talje lyspladen er i fokusplan objektivlinsen. Positionen af stråleindsnævring kun kan tilpasses ved at observere lyspladen i lodret position i forhold til det kapillære (se trin 2,5-2,8).
- Brug en omvendt mikroskop og montere SPIM excitation modul, som beskrevet i ref. 16 på bundpladen i positionering tabel (se figur 1A).
- Udstyre mikroskop med en 10X / 0,3 eller 20X / 0,5 mikroskop objektiv og en passende langpasfilter (f.eks λ ≥ 515 nm) i stien påvisning af mikroskopet.
- Monter en integrerende kameraet til detektering af mikroskopet.
- Brug en parallel kollimeret stråle af en laser eller en laserdiode med en excitationsbølgelængde på fortrinsvis 470 nm og anvende den til SPIM modulet.
- Drej cylindrisk linse 90 grader, som overfører lys ark i en lodret stilling til en aksial justering af stråleindsnævring af lyspladen.
- Placer en kapillar indeholder en væske med et fluorescerende farvestof i prøveholderen.
- Fastgør prøveholderen med kapillarrøret positionering tabel af mikroskopet og justere positionen af kapillarrøret, således at det er centreret og bjælken taljen af lyspladen er i fokus.
- Juster stråleindsnævring ved variation af den aksiale stilling af den cylindriske linse selv. Vend tilbage linsen efter annoncenstering.
3. Cell Sfæroide Ansøgning og Mikroskop Feed Synkronisering
- Placer celle sfæroiderne separat eller i grupper inden rektangulære borosilicat kapillærer 16 med en indre tværsnit på 600 um x 600 um og en vægtykkelse på 120 um. To teknikker til anvendelse af en celle sfæroid har vist sig at være vellykket.
- Tag den tomme kapillær oprejst med tommel-og langfinger, og forsegle den øvre åbning med pegefingeren. Bring nedre åbning tæt til cellen sfæroid i dens omgivende væske (EBSS eller dyrkningsmedium). Slip pegefinger fra den øvre åbning. Væske med cellen klumpformet i det vil blive gennemblødt med det samme ved kapillarkræfter. Justér sfæroidet inden den fyldte kapillarrør ved gravitation i respektive opretstående stilling af kapillarrøret.
- Alternativt anvende cellen klumpformet kapillarrøret via pipettering. Pas that åbningen af spidsen af pipetten er, på den ene side store nok til sfæroid størrelse og på den anden side mindre end eller lig i størrelse til den indre diameter af kapillarrøret.
- Placer kapillar med sfæroid i det i en speciel holder prøve til mikroskopi.
- Fastgør prøveholderen med kapillarrøret positionering tabel af mikroskopet og justere positionen af cellen sfæroid, således at den er centreret og fokuseret.
- Indstil matchning mellem lyspladen og brændplan mikroskopet objektiv i detekteringsbanen ved at justere positionen af refleksion spejl og den cylindriske linse (se skruen i figur 1B).
- Juster mikrometer skrue (se figur 1B) i overensstemmelse med brydning indeks og den numeriske apertur af objektivlinsen til at kompensere af akvariet virkning.
BEMÆRK: Forskellige brydning indekser af prøven og medierne omkring than objektiv føre til en forskel mellem skift af objektiv og skiftet af brændplanet. Da lyset plade bevæges af objektive tårn, er misforholdet mellem skift af lyset ark (svarende til forskydning af objektiv linse) og skift af fokalplanet kompenseret af en løftearm (se figur 1B). Den mikrometer skrue anvendes til at tilpasse afstanden mellem den øvre og den nedre stift at justere forskydning af lys linseplade ifølge den numeriske åbning objektivlinsen og refraktion indeks.
Figur 1. (A) Billede af den fælles plan belysningsmodul monteret på bundpladen af positioneringen tabellen som et omvendt mikroskop (B) opsætning af enkelt plan belysningmodul og synkroniseringen mikroskop-feed til at kompensere lifting-mismatch (fishtank effekt) mellem fokalplan og belysning fly. Az o angiver skift af objektiv og Az f skiftet i fokalplanet og lyset ark. Indlægget viser tværsnit af kugleformede indeholdende kapillærer. Venstre: rektangulær kapillarrør med indre diameter på 600 um (væg 120 um). Til højre: Opsætning bruges til drejning. En indre runde kapillær (indvendig diameter 400 um, ydre diameter 550 um) drejes i den ydre rektangulære kapillær. Mellemrummet mellem de to kapillarer er fyldt med en nedsænkning væske.
4. Måling i Dynamic Flydende Miljø
BEMÆRK: Den tidligere protokol bruges til statisk inkubation før en måling, hvor cellen klumpformet er tidligere blevet inkuberet og derefter holdes på plads i kapillarrøret ved simpel gravitation. Der er ikke behov for yderligere fixatipå. Men til målinger i strømmende medier, hvor en dynamisk inkubation, og derfor et dynamisk miljø er ønskeligt at måle uptake kinetik, kan man opnå dette sub-protokol. Trin 4,5-4,9 er afgørende for at undgå luftbobler nå prøven.
- Fyld kapillar med FCS i 30 minutter for at støtte senere cellulær adhæsion af en celle sfæroid til den indre glasoverflade.
- Lad de resterende FCS belægning i den udtømte kapillær tørre i mindst 12 timer.
- Indførelse cellen klumpformet til FCS overtrukket kapillarrør som beskrevet i trin 3.2.
- Lad kapillarrøret i inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C i yderligere 2-4 timer for at forårsage cellulær adhæsion af sfæroide.
- Opsætning af afflux del af mikrofluid-systemet (se figur 2). Brug en peristaltisk pumpe til at fylde afflux af slangen (indvendig diameter: 0,89 mm) med dyrkningsmedium indeholdende det fluorescerende farvestof, lægemiddel eller middel.
- ConneCT afflux del af mikrofluid system til et boblerør (se figur 2).
- Første klemme kapillarrøret boblefri til afflux slanger og derefter spænde den anden side af kapillarrøret til afløb slangen.
- Tune væsketemperaturen i vandbad til den ønskede værdi (fx 37 ° C).
- Juster peristaltisk pumpe til den ønskede pumpe hastighed (f.eks, gennemstrømningshastighed: 9 gl / min; pumpe hastighed i kapillarrøret: 25 mm / min).
- Saml den pumpede væske enten i en modtager (åben sløjfe opsætning), fodre den tilbage til sin kilde (lukket-sløjfe opsætning) eller foder det direkte i slangen peristaltikpumpen (stram lukket kredsløb setup).
Figur 2. Mikrofluid opsætningen (åben sløjfe og stram lukket kredsløb); indlæg: Belysning af en SPHeroid i en mikro-kapillar ved hjælp af lys ark baseret fluorescensmikroskopi koblet til et omvendt mikroskop.
5. Dataindsamling og analyse
- Indstil laser magt og integration tid til erhvervelse af billedet.
- Pas på, at de parametre, der er defineret i trin 5.1 ikke overstiger lysdosis værdier omkring 50-100 J / cm 2 for medfødte celler eller 10-20 J / cm 2 for celler inkuberet med et fluorescerende farvestof eller transficeret med et fluorescerende protein kodning plasmid undgå fototoxicitet (for detaljer se ref. 12).
- Indstil intervallet for z-stak til Az = 5-10 um, som er at foretrække til 3-dimensionel dataanalyse som lyset pladetykkelse er omkring 10 um.
- Udføre målinger af enkelte billeder eller z-stakke af variation af den fokale plan inden i cellen sfæroide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperiment 1: Cell sphæroider inkuberet med et kemoterapeutisk lægemiddel
En z-stak scanning af en tidligere inkuberet MCF-7-celle sfæroide (8 uM doxorubicin, 6 timer) er afbildet i figur 3. Det giver detaljeret information om den cellulære optagelse og fordeling af doxorubicin 17 og dets nedbrydningsprodukt 18,19. Inden for den ydre cellelag sfæroidet rødt fluorescerende doxorubicin hovedsageligt lokaliseret i kernen, mens grøn fluorescens, der udsendes af et nedbrydningsprodukt i den indre kugleformede områder bliver dominerende i den cellulære membran 19.
Figur 3. Fluorescensbilleder fra forskellige lag (Az = 10 um) af en MCF-7-brystcarcinoma celle SPHeroid inkuberet med doxorubicin (8 uM, 6 timer), som registreres ved en enkelt plan belysning mikroskopi; 3-dimensionel rekonstruktion ved hjælp af z-projektion (excitation: λ = 470 nm; fluorescensdetektion: λ ≥ 515 nm, mikroskop objektiv: 10X / 0.30 Plan Neofluar).
Optagelsen af det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin i native MCF-7 humane brystcancercellelinjer sfæroider er afbildet i figur 4 for en enkelt celle lag udvalgt af SPIM. Ved anvendelse af 2 uM i dyrkningsmedium i flowsystemet rød og grøn fluorescens af doxorubicin og dets nedbrydningsprodukt stigning kontinuerligt (billeder og frekvenser afbildet).
Figur 4. Tidsforløb for cellulære optagelse af 2 uM doxorubicini dyrkningsmedium via mikrofluid system. Fluorescens billeder af et enkelt lag af en MCF-7-brystcarcinoma celle sfæroide optaget af enkelt plan belysning mikroskopi i en afstand af 80 um fra kanten med ekstra fluorescensemissionsspektrum (excitation λ = 470 nm; fluorescenspåvisning: λ ≥ 515 nm ; mikroskop objektiv: 10X / 0,3 Plan Neofluar).
Eksperiment 2: Oxidation proces sfæroider udtrykker et redox-sensor
Spim målinger af intracellulære redox stater kan give nogle oplysninger om reaktive ilt arter, fx i tumorer. Til dette formål en sfæroid af U251MG-L106 glioblastomceller permanent transficeret med glutathion følsomme grønt fluorescerende redox sensor Grx1-roGFP2 blev anvendt. Oxidation af glutathion blev induceret ved eksponering til 50 uM hydrogenperoxid (H2O 2) i salt solut ion (EBSS) via mikrofluid systemet og overvejende forekom i de ydre cellelag sfæroidet.
Som tidligere rapporteret 20 optagelse af H2O 2 resulterer i et fald i fluorescensintensitet exciteret ved 470 nm, svarende til den reducerede form af redox sensoren. Ved begyndelsen af inkubation H2O 2 kraftigt påvirker de ydre cellelag (tykkelse: 50 um) i sfæroid og derefter trænger dybere ind i det indre område (diameter: 150 um) af sfæroide med stigende inkubationstid resulterer i en langsommere nedbrydning af fluorescensintensitet. Tidsforløbet af dette fald er afbildet i figur 5, der viser muligheden for hurtig lægemiddeltilførsel kombineret med hurtig påvisning af SPIM systemet 20.
993fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Tidsforløb af fluorescens fald på 50 uM H2O 2 inkubation af U251MG-L106-glioblastom celle sfæroide permanent transficeret med glutathion følsomme grønt fluorescerende redox sensor Grx1-roGFP2. De intracellulære redox state kinetik for de ydre lag og det indre område af en celle sfæroide blev opnået ved middelværdier intensitetsværdier fluorescensbilleder optaget af enkelt plan belysning mikroskopi (enkelt lag af cellen sfæroid under strømning).
Eksperiment 3: Indledning og mærkning af cellenekrose inden sphæroider
Sådan startes cellenekrose en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastom celle klumpformet blev inkuberet med 1 uM rotenon i 3 timer. Den neurotoksiske middel rotenon er en hæmmer af mitokondrie elektron transportkæden og fører til et tab af cellemembran integritet. Til VisuaLize det nekrotiske retning sfæroid blev co-inkuberet med det grønt fluorescerende cytotoksicitet mærkning farvestof (1 ml i 1 ml dyrkningsmedium, 3 timer), som trænger ind i det beskadigede celle og binder til DNA i cellekernen (se figur 6A, C). For reference, er en lys feltbelysning billede af hele klumpformet vist i figur 6B.
Figur 6. (A) Fluorescensbilleder fra forskellige lag (Az = 5 um) af en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastom celle sfæroid co-inkuberet med rotenon (1 pM, 3 timer) og grøn cytotoksicitet farvestof (1 gl i 1 ml dyrkningsmedium, 3 timer) indspillet af enkelt plan belysning mikroskopi (skala bar 100 um), (B) lyse field belysning af hele sfæroide og (C) rekonstrueret 3-dimensionel fluorescensbillede (excitation: λ = 470 nm; fluorescenspåvisning: λ ≥ 515 nm, mikroskop objektiv: 20X / 0,5 Plan Neofluar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende manuskript beskriver en lys plade eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) anordning, som er optimeret til 3-dimensionelle celle systemer, fx flercellede tumor sphæroider (MCT). Tre eksempler på applikationer omfatter (1) optagelse af et cytostatisk lægemiddel og dets delvis konvertering til et nedbrydningsprodukt (hvis bidrag til kemoterapeutisk effekt mangler stadig at blive evalueret), (2) målinger af redox stat, ved hjælp af en genetisk kodet glutathion-sensor på tilsætning af et oxidationsmiddel, og (3) initiering og mærkning af cellenekrose ved inhibering af mitokondrie respiratoriske kæde.
Vigtigste fordele ved denne SPIM modul sammenlignet med eksisterende systemer (fx dem, der rapporteres i Refs. 7, 8, 9, 14, 15) er, at det let kan tilpasses enhver omvendt bredt felt mikroskop, og at prøver er placeret i små måleinstrumenter kamre (mikro-kapillærer), der har brug kun små mængder of fluorescerende farvestoffer, farmaceutiske midler eller lægemidler, der skal anvendes til forskellige former for eksperimenter, og dermed minimere omkostningerne, fx til farmaceutiske tests. Dette gælder også, hvis en mikro-fluidisk systemet, som rapporteret i dette manuskript, der anvendes. Dog skal det nævnes, at selv om en åben sløjfe setup lave strømningshastigheder er fordelagtige for omkostningseffektiv lægemiddel-screening, på op til 1.440 ul / min (svarende til hastigheder på op til 4.000 mm / min) viste sig at være mulig under de foreliggende eksperimentelle betingelser uden frigørelse af sfæroider fra kapillarrøret. For en stram lukket kredsløb setup en samlet flydende volumen på 200-300 ul minimum er påkrævet, uafhængigt af pumpens hastighed.
Enhver lyskilde, der kan fokuseres på en diffraktion begrænset stedet, fx en laser eller laser diode, kan bruges til belysning. Anvendelse af forskellige lyskilder, kræver imidlertid kromatisk korrektion, enten ved yderligere Telesklare systemer placeret foran de enkelte lyskilder 20 eller ved at designe en akromatisk belysningssystem. Et yderligere problem skyldes udtalt fremad spredning, som kan være inhomogen over prøven, hvilket forårsager artefakter som striber eller skygger. Variation af indfaldsvinklen i et slingrende tilstand 21 eller specifikke softwarealgoritmer 22, kan dog reducere disse artefakter.
Den foreliggende belysningssystem består af en telecentrisk stråle ekspansion og fokusering af en cylindrisk linse 50 mm brændvidde og en numerisk blænde N = 0,08. Ifølge formlen d = λ / A N til Fraunhofer diffraktion resulterer dette i en tykkelse på omkring 6 um lyspladen (afhængigt af excitationsbølgelængden λ), som stort set svarer til tykkelsen af et cellelag og synes at være ideelle til observation af de enkelte lag. Hvis en højere aksial opløsning Is ønskes, kan den numeriske åbning forøges ved insertion af en yderligere mikroskop objektiv af moderat eller høj numerisk apertur i belysningen stråle med lyspladen være fokuseret i sin aperturplanet. Dette resulterer i en anden lyspladen i planet af prøven, som imidlertid er drejet 90 ° (en rotation af den cylindriske linse 90 ° kan kompensere for denne rotation). Da langdistance mikroskop linser har numeriske åbninger på op til omkring 0,60, kan tykkelsen af lyspladen reduceres til 1 m eller endnu mindre, således nærmer den aksiale opløsning opnået i konfokal laser-scanning-mikroskopi. Samtidig dybdeskarpheden der er proportional med A N -2 reduceres fra omkring 100 um til mindre end 2 um.
Et brændpunkt skift korrektion bruges til at kompensere den såkaldte fishtank virkning på grund af et brydningsindeks mismatch. Skiftet af mikroskopet mål lens langs den optiske akse afviger fra fokusforskydning inde i prøven. Afhængig af forholdet brydningsindekserne mellem luft og mediet omkring prøven objektet højde vises clinched med en faktor på ca 1,35 og fører til et løft misforhold med samme faktor mellem fokalplanet og belysning flyet i SPIM til optagelse z -stacks (for reference se figur 1B).
Flercellede tumor sfæroider (MCT) er temmelig symmetriske prøver, som kan belyses fra enhver retning. Men for mindre symmetriske prøver eller små organismer belysning fra forskellige sider kan være ønskelig. Derfor har vi for nylig udviklet en opsætning 23, hvor prøverne er placeret i en mikro-kapillær cylindrisk form (indvendig diameter 400 um, ydre diameter 550 um), der kan roteres inden for rektangulære kapillar (indvendig diameter 600 um, vægtykkelse 120 um), som afbildet i the indlæg i figur 1B. Grundet næsten perfekt optisk kobling af to kapillærer lys ark baseret mikroskopi kan kombineres med rotation af prøven uden nogen begrænsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af delstaten Baden-Württemberg samt af Den Europæiske Union, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Forfatterne takker Rainer Wittig (ILM Ulm) varetagelse af U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellelinje og Claudia Hintze til dygtige teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H.
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K.
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. Lippert, H., Wald, M., Radt, B. , 7,787,179 B2 (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. , EP 13 184 931.7 (2013).
