Methodenartikel

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

DOI:

10.3791/51995

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14. September 2014

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1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Zusammenfassung

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HIV-1-Hüllglykoproteine (Env) vermitteln den Eintritt von Viren in Zielzellen und sind essentiell für den infektiösen Zyklus. Das Verständnis, wie diese Glykoproteine in der Lage sind, den Fusionsprozess durch ihre Konformationsänderungen anzukurbeln, könnte zur Entwicklung besserer, wirksamerer Immunogene für Impfstoffstrategien führen. In dieser Arbeit wird ein zellbasierter ELISA-Assay beschrieben, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerischem HIV-1 Env durch monoklonale Antikörper zu untersuchen. Nach der Expression von HIV-1-trimerem Env an der Oberfläche der transfizierten Zellen werden konformationsspezifische Anti-Env-Antikörper mit den Zellen inkubiert. Ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Sekundärantikörper und eine einfache Chemilumineszenzreaktion werden dann verwendet, um gebundene Antikörper nachzuweisen. Dieses System ist hochflexibel und kann Env-Konformationsänderungen nachweisen, die durch lösliches CD4 oder zelluläre Proteine induziert werden. Es erfordert nur eine minimale Menge an Material und keine hochspezialisierte Ausrüstung oder Know-how. Somit kann diese Technik für das Screening von Antigenen und Antikörpern mit mittlerem bis hohem Durchsatz, wie z. B. neu isolierten Antikörpern, etabliert werden.

Einleitung

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Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1)-Eintrag, der trimeren viralen Hüll-Glykoproteine ​​(env) vermittelten ist der erste Schritt des Infektionszyklus. Die einzige Virusantigen exponiert an der Oberfläche des Virions präsentiert, löst das Env-Trimer neutralisierende und nichtneutralisierenden Antikörpern. Als solches stellt es einen interessanten Kandidaten für Impfstoff-Immunogen-Design. Allerdings Impfung Studien mit Env in löslicher oder rekombinanten Formen hervorgerufen Antworten mit nur minimaler Wirkung gegen die meisten primären HIV-1-Isolate 1-3. Dennoch Teil Wirksamkeit bei der RV144-Impfstoff-Studie 4 erneutes Interesse an HIV-1 Env als Immunogen Kandidaten beobachtet. Dies wurde durch eine neuere Studie beschreibt die Impfung ausgelöste Anti Env-Antikörpern waren ausreichend, um einen gewissen Schutz gegen SIV und HIV erzeugen Herausforderungen 5 bestätigt.

Nachdem sie im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert, das Env glycoprotein Vorläufers gp160, läuft verschiedene post-translationale Modifikationen, die entscheidend für seine Fähigkeit, das virale Fusionsprozess Brennstoff. Die Env-Vorläufer muss ordnungsgemäß und Associate in Trimeren falten, bevor er in seine extra-zytoplasmatische gp120 und gp41 Transmembranuntereinheiten 6-10 gespalten, mit nicht-kovalente Wechselwirkungen Aufrechterhaltung des gp120-gp41 Liaison. Die infizierten Zellmaschinerie ist auch für stark Glykosylierung Env, umfassend etwa 50% seiner Gesamtmasse 11,12 verantwortlich. Die daraus resultierende komplexe Struktur ermöglicht Env zu konformativ flexible 13,14 sein, während eine Metastabilität, die gedacht wird, damit Env, sich anzupassen und bestimmte hoch immunogene Epitope, die sonst ausgesetzt wäre 15-19 verstecken, was die Bedeutung, die verschiedenen Konformationen besser zu verstehen von der einheimischen Env Trimer abgetastet.

Bisher wurden verschiedene Techniken entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um Env Konformationsänderung CH studierenanges. Allerdings unterscheiden sie sich in ihren Grenzen, wobei oft auf spezifische Kontexte Env beschränkt. Zum Beispiel, Oberflächenplasmonresonanz oder Immunpräzipitationstests Verwendung Konformation spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb), beruhen entweder auf monomeren löslichen oder gelösten Moleküle Env, die bekannt sind immungene anders als ihre trimeren Formen 20,21 sein. Neuere Studien legen nahe, dass die Spaltung auch beeinflusst Env Konformationen was die Exposition von Epitopen hauptsächlich von nichtneutralisierenden Antikörpern erkannt 14,22,23.

Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die für schnelle und einfache Bestimmung der Konformation von zellulär-Env-Trimere 18,24-26 ausgedrückt ermöglicht. Nach transienter Transfektion von Env in einem menschlichen adhärenten Zelllinie die Bindung von Env-spezifische Antikörper wird mit einem einfachen Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um die bevorzugte Konformation des charakterisieren konformationsabhängiger DEPENdent Antikörper. Somit stellt dieser Test ein robustes und hoch flexibel Nachweisverfahren.

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Protokoll

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1. Tag 1 - Cell Culture

  1. Platte 2 × 10 4 menschliche Osteosarkom (HOS)-Zellen pro Vertiefung in einer lichtundurchlässigen, 96-Well-Zellkulturplatte für Lumineszenz Lesen. Verwenden Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt. Inkubieren bis zum nächsten Tag bei 37 ° C, 5% CO 2.

2. Tag 2 - Polyethylenimin (PEI) Transfektion

  1. Vorbereitung Transfektionsgemisch nach den nachfolgenden Schritten. Einzustellen Reagenzien und DNA-Mengen entsprechend der Anzahl von Vertiefungen, die mit dem gleichen Env transfiziert werden.
  2. Rohr A: In 10 ng Tat-kodierenden Plasmid (wie PTAT--III 27) und 150 ng Env-kodierenden Plasmid bis 5 ul DMEM mit 25 mM HEPES.
  3. Die Tat-kodierenden Plasmid ist nur bei Verwendung Tat-abhängigen Env-kodierenden Plasmide wie pSVIII erforderlich.
  4. Rohr B: In 450 ng PEI (von A 1ug / ul-Lösung) und 5 ul DMEM.
  5. Inhalte hinzufügen von Rohr zu Rohr B A. Mix gründlich durch Vortexen für 10 sec und Inkubation Transfektionsmischung 10 min bei Raumtemperatur (22 ° C).
  6. Werden 10 ul der Transfektionsgemisch pro Well der 96-Well-Platte. Inkubation für 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2.

3. Tag 4 - ELISA

  1. Führen Sie alle Experimente bei Raumtemperatur, um mögliche Endozytose von Env / Antikörper-Komplexe zu minimieren.
  2. Bereiten Sie 250 ml Waschpuffer pro Platte zur gleichen Zeit eingesetzt. Waschpuffer ist 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) mit 1 mM MgCl 2 und 1,8 mM CaCl 2 ergänzt.
  3. Bereiten Sie 125 ml Blockierungspuffer pro Platte durch Zugabe von 1% fettfreie Trockenmilch und 5 mM Tris pH 8,0 bis Waschpuffer.
  4. Entfernen von Zellkulturmedien und Transfektionsgemisch (Überstand) von 96-Well-Platte.
  5. Mit 100 μ; L Blockierungspuffer pro Well und Inkubation 20 min bei RT.
  6. Überstand entfernen und 50 ul Antikörper (oder Serum) pro Vertiefung, auf eine geeignete Konzentration in Blocking-Puffer verdünnt. Typischerweise verwenden eine Konzentration von 1 pg / ml. Inkubiere 1 h bei RT.
  7. Wasch 3x mit 100 ul Blocking Buffer und wiederholen Waschprozess 3x mit 100 ul Waschpuffer.
  8. Überstand entfernen, 100 l Blocking Buffer, und Inkubation 5 min bei RT.
  9. Überstand entfernen und 50 ul sekundären Antikörper, verdünnt 1/3000 in Blocking-Puffer. Variieren optimale Antikörper Verdünnung nach Hersteller Unterschiede. Inkubieren 40 min bei RT.
  10. Wasch 3x mit 100 ul Blocking Buffer und wiederholen Waschprozess 3x mit 100 ul Waschpuffer.

4. Datenerfassung

  1. Überstand entfernen von der Platte, und fügen Sie 30 ul 1x verstärkte Chemilumineszenz (ECL)-Substrat pro Vertiefung.
  2. Chem erwerbeniluminescence Signal für 1 sec / gut auf eine geeignete Platte-Leser nach den Anweisungen des Herstellers. Lesezeit kann je nach Hardware-Unterschiede abweichen.

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Ergebnisse

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Unter Verwendung der oben beschriebenen allgemeinen Verfahren, passen wir das Protokoll, um die Auswirkungen von löslichen CD4 (sCD4) und coexprimierten zellulären CD4 über die Exposition der CD4i Epitope auf entweder Wildtyp (wt) oder mutierten Env zu testen, wie zuvor beschrieben, 18,24, 25,28. Abbildung 1 Die allgemeine Verfahren und die Exposition von CD4i Epitope nach der Behandlung mit sCD4 oder durch Co-Expression von zellulären CD4 18 schematisch. In 2 sCD4...

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Diskussion

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Dieser Assay ist optimiert, um die Wechselwirkung von spezifischen mAbs mit HIV-1 Env trimere exprimiert auf der Zelloberfläche erkennen. Sobald das Protokoll festgelegt wurde, kann es bei mittleren bis hohen Durchsatz bei geringen Gesamtmaterialkosten und geringe Mengen von Antikörpern verwendet werden. Da dieser Test ist Transfektion basiert, kann es leicht zur Koexpression der zellulären Proteine ​​wie CD4, um ihre Auswirkungen auf die Konformation Env studieren angepasst werden.

Jedoch d...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Herrn Dr. James Robinson für seine großzügige Geschenk der A32, 17b, 48d und C11 mAb. PGT 121 wurde durch die NIH AIDS Reagenz-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343) erhalten. Diese Arbeit wurde von einer Kanada-Stiftung für Innovation Programmleiter # 29866, die von einem Betriebs CIHR # 257792, von einem FRQS Gründung der Young Scientist gewähren # 24639 auf AF und von einem Kontinuum CRCHUM Zuschuss sowie durch einen Katalysator CIHR Grant # 126630 AF und MR. AF ist der Empfänger einer FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 Stipendium # 24639. MV wurde von einer CIHR Doctoral Research Award # 291485 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HOS-ZellenATCCCRL-1543
Weiße undurchsichtige Gewebekulturplatte, 96-Well, flacher BodenBD353296
Polyethylenimin, linear, 25.000 MWPolysciences23966Hergestellt in 1 mg/ml Lösung
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen11995
Ziege Anti-Human-IgG, Peroxidase konjugiertPierce31413
Erweitertes Chemilumineszenz-SubstratPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, PlattenleserBerthold Technologies

Referenzen

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  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

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HIV 1 Envelope GlycoproteinsConformational ChangesMonoclonal AntibodiesChemiluminescence DetectionSoluble CD4Transfected CellsHorseradish PeroxidaseEpitope ExposureHigh Throughput Screening

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