Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.
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Methodenartikel
High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es ist dringend notwendig, um Ansätze für die Reparatur der geschädigten Herz, die Entdeckung neuer therapeutischer Medikamente, die nicht über toxische Wirkungen auf das Herz, und die Verbesserung der Strategien, um genau zu modellieren Herzkrankheit zu entwickeln. Das Potenzial der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Technik zur Nutzung zu Herzmuskel "in einer Schale" für diese Anwendungen zu generieren weiterhin hohe Begeisterung zu erzeugen. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) effizient zu erzeugen stark verbessert, bietet uns neue Möglichkeiten sehr frühen Stadien der menschlichen Herzentwicklung modelliert nicht zugänglich. Im Gegensatz zu vielen früheren Verfahren, die hier beschrieben Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll keine Zellaggregation oder die Zugabe von Activin A oder BMP4 erfordern und robust erzeugt Kulturen von Zellen, die stark positiv für Herz-Troponin I und T (TNNI3, TNNT2) iroquois- Klasse homeodomain ProteinIRX-4 (IRX4), Myosin regulatorische leichte Kette 2, ventrikuläre / Herzmuskel-Isoform (MLC2v) und Myosin regulatorische leichte Kette 2, Vorhof Isoform (MLC2a) am Tag 10 in allen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) und hiPSC Linien getestet Datum. Zellen können agiert und für mehr als 90 Tage in Kultur gehalten werden. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren und kostengünstig. Charakterisierung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Zellen abgeleitet sind oft die Analyse von Referenz-Markierungen sowohl auf der mRNA-und Proteinebene. Zur Proteinanalyse, Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges analytisches Werkzeug für die Beurteilung der Qualität der Zellen in Kultur und Bestimmen Subpopulation Homogenität. Allerdings können technische Variation in der Probenvorbereitung erheblich beeinträchtigen die Qualität der Durchflusszytometrie Daten. So sollte die Standardisierung von Färbeprotokollen Vergleiche zwischen verschiedenen Differenzierungsstrategien erleichtern. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 und TNNT2 durch Durchflusszytometrie beschrieben.
Einleitung
Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs, einschließlich hESC und hiPSC, kann als ein in vitro-Modell der sehr frühen menschlichen Entwicklungsprozesse Herz funktionieren, die einen Einblick in Stadien nicht anders für mechanistische Studien zugänglich. Dieses Modellsystem bietet einzigartige Möglichkeiten, um die molekularen Signalwege, die Herzlinie Engagement und das Schicksal der Zelle steuern Spezifikation zu studieren. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen effizient zu erzeugen aus hPSCs stark verbessert 1-15. Jedoch unter Protokolle gibt es Zellinie Variation in Bezug auf den Wirkungsgrad bei der Erzeugung von Her....
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Protokoll
1. Lösung und Medienvorbereitung
- hESC Qualifizierte Matrixbeschichtung Stammlösung
- Langsam tauen hESC qualifizierte Matrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Verzichten Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C lagern.
HINWEIS: Das Volumen des aliquoten auf viel variieren und liegt typischerweise im Bereich von 270 bis 350 ul. Hersteller liefert Details über Volumen von aliquoten erforderlich, um eine Konzentration auf 1x Verdünnung in 25 ml zu erreichen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Langsam tauen hESC qualifizierte Matrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Verzichten Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C lagern.
- HPSC Medienstammlösungen
- Verwenden von ultrareinem Wasser als Verdünnungsmittel,....
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Ergebnisse
Am Tag 0 wurden die Zellen zu 100% konfluent mit kompakten Morphologie und minimalen Zelltrümmer. An den Tagen 1-2, ist es üblich, den Zelltod signifikant (40-50%) zu beobachten, aber anhaftenden Zellen werden kompakte Morphologie (1A) zu erhalten. Während dieser Zeit ist die Medien orange und trüb. Rosa Medien zeigt übermäßigen Zelltod, und in diesem Fall, bestätigen Sie mit Trypanblau und einzustellen, wenn Zelltod übersteigt 70%. Zellen während der Tage 3-4 erholen und Dichte zu erhöhen. Während der .......
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Diskussion
Kritisch für den Erfolg der Differenzierungsprotokoll ist die Verwendung von hochwertigen Kulturen hPSCs das auf Einzelzellebene für mindestens fünf Passagen vor Beginn der Differenzierung agiert wurden. Ähnliche Differenzierung Effizienzen werden routinemäßig unter verschiedenen HPSC Linien beobachtet, wenn sie 100% konfluent zu Beginn der Differenzierung, unabhängig von Zelllinie. Suboptimalen Leistungsfähigkeit beobachtet, wenn die Konfluenz der Zellen zu Beginn der Differenzierung ≤95% oder> 100%. Daher sollte Au.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch die NIH 4R00HL094708-03 unterstützt, MCW Forschungsausschuss New Faculty Award, und der Kern-Stiftung (Startfonds) an der Medizinischen Hochschule von Wisconsin (RLG); Research Grants Council of Hong Kong Theme-Based Research Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 und AHA Gegründet Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Wir danken Hoffnung Campbell an der Durchflusszytometrie Kern des Blut Research Institute of Wisconsin für die Unterstützung bei der Datenerhebung und die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts.
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Materialien
Flow Cytometry ReagenzienMaterials
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualifizierte Matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase Zellablösungslösung | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Calcium, kein Magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO, Hybri-Max, sterilfiltriert) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Zitronensäure | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 Dihydrochlorid selektiver p160ROCK-Inhibitor | R& D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbinsäure-2-phosphat Sesquimagnesiumsalzhydrat | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Natriumselenit | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Definiert, tierversuchsfrei, rekombinant human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) | R& D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transformation des Wachstumsfaktors beta 1 (TGFβ 1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 mit L-Glutamin und 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 mit L-Glutamin | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (mit Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 10437< | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's ausgewogene Salzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow Dauerwellenpuffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyd | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Aceton | Mallenckrodt Chemikalien | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Ziegenserum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypanblaue Lösung, 0,4% | Life Technologies | 15250-061< | |
| 5 ml Polystyrol-Tube mit rundem Boden (ohne Kappe) | Corning | 352008 | Zur Zubereitung von Zellen für die Durchflusszytometrie |
| 5 ml Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden (mit 35 &; Mikro; M Zellsieb Schnappkappe) | Corning | 352235 | Zur Vorbereitung von Zellen für die Durchflusszytometrie |
| 2 ml Gummiknollen | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" Borosilikatglas unplugged Glas Pasteur Pipetten | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen, graduiert, grün | GeneMate | C-3259-G | |
| 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, graduiert, rot | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automatisierter Zellzähler | BioRad | 145-0102 | |
| Zählobjektträger für TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6-Well-Platte mit flachem Boden mit Gewebekultur behandelt | Corning | 353046 | |
| 20 ml Spritzen | BD Plastipak | 300613 | Für die Filtersterilisation von Aliquoten |
| Sterile Spritzenvorsatzfilter, 0,2 & Mikro; m Polyethersulfon | VWR | 28145-501 | Zur Filtersterilisation von Aliquoten |
| 250 ml Filtersystem, 0,22 & Mikro; m Polyethersulfon, sterilisierend, mit geringer Bindung | Corning | 431096 | Für die Filtersterilisation von Schüttgütern |
| 500 ml Filtersystem, 0,22 &Mikro; m Polyethersulfon, sterilisierend, niedrig | bindend Corning | 431097 | Für die Filtersterilisation von Schüttmedien |
| Antikörper und Isotypkontrollen | |||
| Anti-TNNI3 (Klon: 284 (19C7))Abcam | ab19615 | Primärer Antikörper | |
| Anti-TNNT2 (Klon: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primärer Antikörper |
| Anti-MYL2 (MLC2v, Klon: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primärer Antikörper |
| Anti-MYL7 (MLC2a, Klon: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primärer Antikörper |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primärer Antikörper |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG1 | Life Technologies | A21121 | Sekundärantikörper |
| Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Maus IgG2a | Life Technologies | A21241 | Sekundärantikörper |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG2b | Life Technologies | A21141 | Sekundärer Antikörper |
| Phycoerythrin (PE) Ziege Anti-Kaninchen IgG | R& D Systems | F0110 | Sekundärantikörper-Maus |
| IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotyp-Kontrollmaus |
| IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotyp-Kontrolle |
| Kaninchen IgG-PE | R& D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Sondensets für qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | HS01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | HS00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | HS01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | HS04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Referenzen
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
