Methodenartikel

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/52011

⸱

13. Dezember 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Vermeidung von gestressten Personen. Dieses Paradigma ist leistungsfähig und dennoch benutzerfreundlich und kann verwendet werden, um den Einfluss von Genen und Umwelt auf eine Art von sozialer Interaktion bei Drosophila melanogaster zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster ist ein aufstrebendes Modell zur Untersuchung verschiedener Aspekte sozialer Interaktionen. Zum Beispiel meiden Fliegen Bereiche, die zuvor von gestressten Artgenossen besetzt waren, da ein Geruchsstoff bei Stress freigesetzt wird, der als Drosophila-Stressodorant (dSO) bekannt ist. Durch die Verwendung des T-Maze-Geräts kann man die Vermeidung des dSO durch Responder-Fliegen in einem sehr erschwinglichen und robusten Assay quantifizieren. Hier werden die Bedingungen dargestellt, die notwendig sind, um eine starke Leistung zu erzielen. Eine stressige Erfahrung ist notwendig, damit die Fliegen dSO ausstoßen, sowie genügend Emitterfliegen, um eine robuste Vermeidungsreaktion auf das Vorhandensein von dSO zu bewirken. Der genetische Hintergrund, aber nicht die Gruppengröße, veränderte die Vermeidung des dSO durch die Responder-Fliegen stark. Canton-S und Elwood zeigen eine höhere Leistung bei der Vermeidung des dSO als die Stämme aus Oregon und Samarkand. Dieser Verhaltensassay wird es ermöglichen, die Mechanismen zu identifizieren, die diesem Sozialverhalten zugrunde liegen, und den Einfluss von Genen und Umweltbedingungen auf die Emission und Vermeidung von dSO zu bewerten. Ein solcher Assay kann in Batterien einfacher diagnostischer Tests aufgenommen werden, die zur Identifizierung sozialer Mängel von Mutanten oder Umweltbedingungen von Interesse verwendet werden.

Einleitung

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Das Ziel dieser Methode ist es, einfach zu quantifizieren einen neuen Aspekt des einfachen Sozialverhalten in Drosophila melanogaster, von Balz und Aggression unabhängig.

Soziale Interaktionen sind entscheidend für die richtige Entwicklung und Gesundheit von Personen innerhalb der Gesellschaft, sowie die Funktionalität einer sozialen Gruppe als Ganzes. Die hohe Komplexität dieser Wechselwirkungen erfordert große Probengrößen und ein System zur Vereinfachung des Verhaltens ermöglicht, da die genetischen und neuronalen Basen des Sozialverhaltens sind noch weitgehend unverstanden. Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige genetischen Modells, das verwendet werden kann, die genetisch zu identifizieren und Neuronale Grundlagen der sozialen Interaktionen. In der Tat, D. melanogaster hat ein Repertoire von komplexen sozialen Verhaltensweisen und einige direkte Messungen der Sozialisation bereits getan 1-7. Allerdings sind die meisten dieser Bemühungen sind auf relativ komplexe soziale Verhaltensweisen wie aggres fokussiertsive Wechselwirkungen 3,6, verschiedene Aspekte der Balz 3,8-12 und wie soziale Erfahrung wirkt sich auf andere Verhaltensweisen wie Lernen oder zirkadianen Rhythmus 13-17. Darüber hinaus sind viele dieser Tests beruhen auf der Analyse komplexer Wechselwirkung Muster Gruppen entfernt, unter Verwendung von Videoverfolgung und Computersoftware, um die resultierende Datenfülle analysieren. Solche Analysen sind von unschätzbarem Wert, und führen zu wichtigen neuen Erkenntnissen, wie die Dynamik der Fly-Fly-Interaktionen in der Gruppe 7. Eine Einschränkung, jedoch ist die Unzugänglichkeit dieser Tests in die Gemeinschaft zu groß, und die begrenzte Kenntnis der Mechanismen Anerkennung der anderen zugrunde liegen. In anderen Worten ist die Basis der Emission eines Signals von einem Individuum und seiner Erkennung durch eine andere noch schlecht verstanden 18.

Die D.: Im Gegensatz dazu fliegt auch eine einfache Verhalten, soziale Vermeidung, in denen Menschen weg von einem Signal, das durch betonte Fliegen emittiert zeigen Melanogaster Belastungsriechstoff oder DSO-19. In einem Assay mit hohem Durchsatz, kann dieses Verhalten, wie die Vermeidung eines durch andere entfernt oder soziale Vermeidungs ​​19 emittiert Spannungssignals quantifiziert werden. Fliegen werden in einem T-Labyrinth-Vorrichtung platziert und die Wahl haben, eine Ampulle, die DSO vermeiden. Unter Verwendung dieses Assays, CO 2 wurde gezeigt, dass ein Bestandteil des DSO, und ein Teil der neuronalen Schaltkreise erforderlich, reagieren zu CO 2 wurde 19 zerlegt werden.

Die soziale Vermeidung Test hier dargestellten ähnelt vom Konzept her an die einfachen Verhaltenstests in Seymour Benzer Labor entwickelt, die Generationen von Forschern ermöglicht, komplexe Verhaltensweisen 20 sezieren. Analyse sozialer Vermeidung kann kostengünstig unter Verwendung des T-Labyrinth-Test, so dass für mehr verbreitet Studie des Sozialverhaltens durchgeführt werden. Zum Beispiel mit diesem Test haben wir vor kurzem gezeigt, dass verschiedene genetische Risiken für Autismus gegenläufigen Effekten in sozialen behavior Assays. Mutanten für ein Kandidatengen für Autismus - Neurobeachin 21,22 - heute Mängel sowohl im sozialen Raum (an anderer Stelle 23 beschrieben) und soziale Vermeidung 24. Abnormal dopaminergen Signal wird auch vorgeschlagen, eine Rolle bei der Entstehung von Autismus bei Menschen 25,26 zu spielen. Im Gegensatz zu den mit Neurobeachin erzielten Ergebnisse haben wir festgestellt, dass soziale Vermeidung Leistung war unberührt erhöht oder gesenkt Ebenen der Drosophila Vesicular Monoamin-Transporter (VMAT) in dopaminergen Zellen, wenn auch sozialen Raum wurde direkt mit diesen Ebenen VMAT 27 korreliert. Die mit Neurobeachin und VMAT erhalten kontras Ergebnisse unterstreichen die Möglichkeit zur Identifizierung verschiedener Formen von asoziales Verhalten und damit die verschiedenen zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise Modulation der Reaktion auf andere.

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Protokoll

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1. Geräte und Reagenzien Erstellt Inhouse (Siehe Liste der Materialien für andere)

  1. Bereiten Sie eine Drosophila kalten Narkosegerät zu fly Arbeit zu verrichten.
    1. Schneiden Sie einen porösen Polyethylenfolie, eine kleine Plastikdose (12,7 cm lang, 10,2 cm breit), in der Regel die obere Abdeckung des Pipettenspitzen-Box (12,7 cm lang, 10,2 cm breit, 3,8 cm tief) zu decken.
    2. Füllen Sie das Feld mit Crushed Ice, decken mit der porösen Polyethylenfolie.
  2. Bereiten Sie einen T-Labyrinth Apparate; Anpassung der zuvor im Detail 28-31 beschriebenen Vorrichtung.
  3. Bereiten Sie eine Fliege Aspirator wie beschrieben 32.
  4. Bereiten Sie eine Phototaxis Antwortgerät um Fliegen in und aus dem Teströhrchen ohne Stress zu versetzen:
    1. Verwenden Sie einen Gegenstromapparat, wie von 29,33 beschrieben.

HINWEIS: Der T-Labyrinth kann auch für andere Zwecke verwendet werden, wie von 28 beschrieben.

  1. Stellen Sie sicher, homogeneous Lichtbedingungen: führen Sie das Experiment auf einer Bank mit einer weißen Bank Deckel abgedeckt und vor einem weißen Brett.
    HINWEIS: Für diese Experimente waren die Fliegenstämme verwendet Drosophila melanogaster Wildarten: Canton-S, Oregon und Samarkand fliegt von unserem Labor-Aktien 34; Elwood Fliegen wurden im Herbst 2011 in der Nähe von Elwood Huntington auf Long Island, New York, USA gesammelt.

2. Vorbereitung der Fliegen vor dem Experiment

1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments:

  1. Pflegen Fliegen auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei 25 ° C auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus.
  2. Sammeln Sie die Antwort Fliegen unter kaltem Anästhesie 1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments
    1. Übertragen die entfernt von den Flaschen, in denen sie in 50 ml-Falcon-Röhrchen aufgewachsen, mit einem Trichter.
    2. Legen Sie die Falcon-Röhrchen mit den Fliegen unter Eis Ebene, in einisolierten Eiskübel.
    3. Setzen Sie den kalten Narkosegerät mit zerstoßenem Eis bei -4 ° C zu kühlen.
    4. Warten Sie 5 Minuten für die Fliegen eine Chill Koma zu gelangen.
    5. Übertragen Sie die Fliegen auf den porösen Polyethylenfolie des kalten Narkosegerät.
    6. Sammeln Sie die Responder-Fliegen auf dem kalten Narkosegerät. Bei RT unter einem Stereomikroskop, trennen 3-7 Tage alten männlichen von den weiblichen Fliegen und pflegen diese Fliegen in Gruppen von 40.
  3. Sammle die Emitter entfernt 1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments.
    1. Vorsichtig sammeln Canton-S gemischtgeschlechtlichen fliegt aus ihren Flaschen, mit einem Mund Sauger, Controlling für ihre Zahl.
    2. Halten Sie diese Fliegen in Gruppe von 60 bis 100, da sie die Emitter sein.
    3. Als Datenpunkte benötigt Bereiten so viele Proben von Emittern.
  4. Lassen Sie mindestens eine Nacht der Erholung nach Sammlung der Responder und Strahler, um jede Verwechslung Wirkung der kalten Anästhesie minimierenund Mund Sauger Sammlung auf das Verhalten.
  5. Öffnen Sie den Beutel von Test-Fläschchen, um die veraltete Plastik riechende Luft in der Tasche zu ermöglichen, durch die frische Luft mindestens 1 Tag vor dem Experiment ersetzt werden.

2 Stunden vor der Durchführung des Experiments:

  1. Sicherzustellen, dass die Temperatur in dem Raum, in dem der Versuch durchgeführt wird, liegt bei etwa 23-25 ​​° C, mit noch Licht und Luftfeuchtigkeit über 30%.
  2. Übertragen Sie die Responder und Emittern Fruchtfliegen in die frische Lebensmittel Fläschchen um sicherzustellen, dass diese Fliegen nicht verhungert.
  3. Lassen Sie die Fruchtfliegen der Anpassung an die Umgebung für 2 Stunden, auf die Bank, auf der das Experiment durchgeführt werden.

3. Die Durchführung der Sozial Vermeidung Experiment

  1. Führen Sie jeden Versuch zur gleichen Zeit des Tages, in einem Bereich von 3-4 Stunden am Nachmittag zwischen den Zeitgeber Zeit ZT5 und ZT9.
  2. Legen Sie das T-Labyrinth auf dem Pochen-Pad, und ziehen Sie die Schraube Clip so tEr Aufzug ist stabil.
  3. Übertragen Sie die Responder-Fliegen in ein frisches Probenröhrchen. Snap dieses Fläschchen mit der Responder Fliegen auf den oberen Teil des T-Labyrinth.
  4. Neigen die T-Labyrinth Gerät und tippen Sie auf die Matte hämmerte so dass die Fruchtfliegen in den Aufzug zu fallen.
  5. Bewegen Sie den oberen Teil der Aufzug nach unten, so dass die Fliegen sind zwischen dem oberen und unteren Teil des T-Labyrinth, aber achten Sie auf den Aufzug über der Wahl Punkt halten - um die Fliegen an der Flucht zu verhindern.
  6. Erhalten Fläschchen mit DSO (siehe Abschnitt 5, um DSO freien Phiolen, die zuvor von Fliegen besetzt waren zu generieren).
    1. Während die Responder-Fliegen sind an dieses neue Umfeld Anpassen, legen Sie die Sender Fliegen in einem Testfläschchen.
    2. Legen Sie ein Stück Baumwolle, das Fläschchen zu schließen, damit die Fruchtfliegen nicht entkommen.
    3. Mechanisch agitieren diese Phiole auf einer Mini-Wirbel wie folgt: Vortex für 15 Sekunden, entfernen Sie das Röhrchen aus dem Vortex für 5 Sekunden. Wiederholen 3 mal für insgesamt 55 sec.
    4. Remove die Emitter-Fliegen aus der frischen Flasche - durch die Übertragung in einem Lebensmittel Flasche - und schnell platzieren dieses DSO gefüllten Fläschchen in einer der beiden Seiten des T-Labyrinth Gerät.
    5. Wechseln auf die Seite der Platzierung für die DSO-gefüllten Flasche in jedem neuen Durchlauf.
  7. Legen Sie einen neuen Testfläschchen auf der anderen Seite des T-Labyrinth.
  8. Bringen Sie mit dem Aufzug ganz nach unten, so dass die Fruchtfliegen können zwischen der neuen Testfläschchen und der Testflasche mit DSO gewählt haben, und starten Sie den Timer.
  9. Lassen Sie die Fliegen zwischen der frischen Ampulle und dem DSO Fläschchen wählen, für 1 min, sofern nicht anders angegeben.
  10. Nach 1 min, bewegen Sie den Aufzug nach oben, um die Fliegen an der frischen Ampulle, DSO Fläschchen, und die im Aufzug stecken zu trennen.
  11. Zähle die Anzahl der Fliegen in jedem Fläschchen und in den Aufzug.
  12. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Genotyp / Zustand.

4. Analyse der Social Vermeidung Daten

  1. Die Anzahl der Fruchtfliegen in jedem Fläschchen für jeden genotyp, und die Daten in eine Tabellenkalkulation.
  2. Mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, berechnen Sie die Performance Index (PI) für jeden Genotyp durch Subtraktion der Anzahl der Fliegen in der DSO-Fläschchen aus der Anzahl der Fliegen in der DSO-freie Fläschchen und dann dividiert durch die Gesamtzahl von Fliegen.
  3. Vergleichen Sie die PiS "bedeutet unter Verwendung statistischer Analysesoftware für die Analyse der Ergebnisse.
    1. Im Idealfall vorbereiten 2-3 internen Wiederholungen für jedes Experiment, und 3 unabhängige Wiederholungen, durchgeführt an verschiedenen Tagen mit verschiedenen Flaschen oder überschreitet 30.
    2. Verwenden Gauß-Verteilung statistische Tests, da die Daten einer Normalverteilung folgen.
    3. Bei der Prüfung von einem Effekt (dh Dichte - Abbildung 2), mit einem Einweg-ANOVA mit Post-Test für Mehrfachvergleich (spaltenweise) oder einem einfachen t-Test, um jedes Ergebnis einer Kontrolle zu vergleichen.
    4. Als Gruppe Experimente durchgeführt werden, beide Bedingungen zu testen und Geschlechter (leer Fläschchen, betonte eind unbelasteten Fliegen; und Gender-Effekt - Abbildung 1), mit einem Zwei-Wege-ANOVA.

5. Generieren Vials Zuvor von Unbetonte Fliegen besetzt - Führen statt 3,5-3,6

  1. Verwenden Sie Phototaxis zu Fläschchen von Fliegen, die nicht hervorgehoben wurden, belegt vorzubereiten, als Kontrolle.
  2. Übertragen Sie die Fliegen in einem Probenröhrchen, und lassen Sie sie in die Gegenstromapparatur, mit frischen leeren Ampullen in die entgegengesetzte Position.
  3. Legen Sie das Gerät waagerecht mit dem distalen Fläschchen unmittelbar vor einer 15 W Leuchtstoff kühl-weißes Licht, und mit einem schwarzen Tuch.
  4. Lassen Sie die Fliegen leicht an der frischen Röhrchen zu bewegen. Dies kann einige Minuten dauern. Nachdem die meisten der Fliegen in Richtung auf das Licht in dem distalen Fläschchen Fuß, den Zeitmesser für 1 min.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die schwarzen Tuch, schalten Sie den Ort des Licht, gewinnen mit der schwarzen Tuch, und lassen Sie die Fliegen um den Test Fläschchen zu verlassen.
  6. Zu diesem Zeitpunkt initiate die Wahl Experiment wie in 3.2 bis 3.5. Zum 3.6 und 3.7.
  7. Schieben Sie den Regler des Geräts, um die Fliegen, die den Test Fläschchen von der anderen Seite verlassen zu trennen.
  8. Verwenden Sie die frei gewordenen Testfläschchen in der T-Labyrinth sofort für die Wahl Experiment, wie in 3.7.

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Ergebnisse

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Die soziale Vermeidung Assay ist eine robuste Test Quantifizierung der Fähigkeit von Drosophila melanogaster, um eine Belastungssignal zu erkennen (DSO) von anderen Fliegen emittiert und damit die Beurteilung ein Aspekt der sozialen Interaktionen. Der Test wird durchgeführt unter Verwendung einer Vorrichtung üblicherweise in verschiedenen Verhaltenstests, wie einem T-Labyrinth, das die Fliegen mit einer Wahl zwischen zwei verschiedenen Optionen zu präsentieren bekannt verwendet - links oder rechts 19,28-31...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die soziale Vermeidungstest. Canton-S nur ein Fläschchen zu vermeiden, in denen fliegt zuvor mechanisch belastet gewesen, und dass das Geschlecht und Anzahl der Responder hat keinen Einfluss auf die soziale Vermeidung Leistung. Allerdings hat der genetische Hintergrund der Responder einen großen Einfluss.

Im Folgenden sind einige wichtige Schritte zur Durchführung dieses Experiment erfolgreich: 1) immer vor dem Experiment über die F...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir danken Rachelle Kanippayoor für ihre Hilfe bei der Identifizierung des neuen Wildtyp-Stammes als zur Melanogaster-Spezies gehörend. R.W.F., O.F. und A.F.S. waren für das Forschungsdesign verantwortlich; R.W.F., M.N. und O.F. führten die Experimente durch. R.W.F., M.N., O.F. und A.F.S. analysierten die Daten; R.W.F., I.S.M. und A.F.S. schrieben das Manuskript.

Diese Arbeit wurde durch PSC-CUNY-Forschungspreise unterstützt, die gemeinsam vom Professional Staff Congress und der City University of New York an A.F.S. finanziert wurden; durch interne Finanzierung von der Western University an A.F.S. und I.S.M.; durch eine Ausbildungsunterstützung durch das Alliance/Merck Ciencia (Science) Hispanic Scholars Program der National Alliance for Hispanic Health und ein Universitätsstipendium der Yale Graduate School of Arts and Sciences an R.W.F.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Stereo-Zoom-Mikroskop Nikon   SMZ-645Jedes andere Standard-Zielfernrohr für die Handhabung von Fliegen würde funktionieren
Kleine Pinsel zum Schieben von Fliegen
Poröses Polyethylen, 12" x 12" Sheet Flystuff- Genesee46-100http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Poröse Kunststofffolie für die Kälteanästhesiebox
Mini-Wecker/Stoppuhr
Sharpie Stifte
Klebeband
Mini VortexFisher14-955-151 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
Für mechanisches Bewegen der Fliegen - jeder Wirbel würde funktionieren.
Corning Life Sciences DL Nr.:352017, Falcon Reagenzglas; runder Boden; Einweg; ohne Verschluss, 14 ml; 17 x 100 mmFisher14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
Diese rasten in dem hauseigenen T-Labyrinth ein und die Gegenstromapparatur (siehe Text)
Wattebällchenum die Fläschchen nach dem Experiment zu verschließen.
Dreifach gefaltetes Brett und weiße Bankabdeckung, um einen weißen Hintergrund und ein homogenes Licht zu schaffen.
Weiße Bankabdeckung
Pounding PadJedes Mauspad funktioniert.
Großes schwarzes Tuchzum Abdecken des Gegenstromapparates bei Phototaxis-Reaktion.
kaltweißes Licht Home Depot1000516563http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
jede ähnliche lineare Leuchte mit Leuchtstofflampe kaltweiß bei 13-15 W würde funktionieren
,

Referenzen

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Drosophila melanogasterSocial Avoidance AssayT maze ApparatusDrosophila Stress OdorantEmitter FliesResponder FliesGenetic BackgroundBehavioral AssayCold AnesthesiaFly Aspirator

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