Methodenartikel

Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten

DOI:

10.3791/52019

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1. April 2015

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1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Manuskript werden experimentelle Techniken, einschließlich Blutaufbereitung, konfokale Mikroskopie und Analyse der Lyserate, vorgestellt, um die morphologischen Unterschiede zwischen normalen und abnormalen Gerinnselstrukturen aufgrund von Krankheitszuständen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Fibrin ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität von Blutgerinnseln verantwortlich ist. In den letzten Jahren wurde viel über Fibrin geforscht, einschließlich der Untersuchung der Synthese, Struktur-Funktion und Lyse von Blutgerinnseln. Es gibt jedoch noch viel Unbekanntes über die morphologischen und strukturellen Merkmale von Blutgerinnseln, die bei Patienten mit einer Krankheit auftreten. In dieser Forschungsarbeit werden experimentelle Techniken vorgestellt, die es ermöglichen, morphologische Unterschiede von krankhaften Gerinnselstrukturen aufgrund von Krankheitszuständen wie Diabetes und Sichelzellenanämie zu untersuchen. Unsere Studie konzentriert sich auf die Präparation und Auswertung von Fibringerinnseln, um morphologische Unterschiede mit verschiedenen experimentellen Assays und konfokaler Mikroskopie zu beurteilen. Darüber hinaus wird eine Methode beschrieben, die eine kontinuierliche Echtzeitberechnung der Lyseraten in Fibringerinnseln ermöglicht. Die hier beschriebenen Techniken sind wichtig für Forscher und Kliniker, die komorbide thrombotische Pathologien wie Myokardinfarkte, ischämische Herzkrankheiten und Schlaganfälle bei Patienten mit Diabetes oder Sichelzellanämie aufklären wollen.

Einleitung

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Schädigung eines Blutgefäßes Endothelauskleidung durch die hämostatische Reaktion oder die Bildung eines Blutgerinnsels repariert. Wenn Blut dringt in die extrazelluläre Matrix, Gewebefaktoren aktiviert Blutplättchen in den Blutstrom, die Einleitung der Gerinnungskaskade zu erleichtern. Der Schlüssel mechanische Komponente dieser Heilungsprozess ist die Fibrinmatrix, von Fibrin Fasern, die hochelastisch sind zusammengesetzt und kann große Kräfte 1-4 zu erhalten. Viele Forscher haben die Bildung Struktur und Funktion von Fibrin ausführlich in den vergangenen Jahrzehnten 5-13 untersucht.

Patienten mit Krankheiten, wie ....

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Protokoll

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HINWEIS: Das folgende Protokoll befolgt die vom Institutional Review Board (IRB) an der Georgia Tech Richtlinien.

1. Blutentnahme und Rotes Blutkörperchen Isolierungsverfahren

  1. Sammeln Sie 40 bis 120 ml Blut von Spendern in 10 ml Heparin-Vacutainer-Röhrchen. Starten PBMC (periphere Blut mononukleären Zellen) Isolierung innerhalb von 4 Stunden der Sammlung. Während dieser Zeit halten Blut bei RT.
    HINWEIS: O / N Lagerung von Blut in RT oder bei 4 ° C wird nicht empfohlen, da dies zu niedrigeren PBMC Ausbeute führen.
  2. Verdünnen Sie Vollblut 1: 1 in eiskaltem (4 ° C) sterile PBS.
  3. Je 10 ml eis....

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Ergebnisse

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Konfokale Mikroskopie Analyse der Glykiertes Fibringerinnsel Strukturen

Konfokales Mikroskopiebilder von normalen und glykiertem Blutgerinnsel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die konfokale Mikroskopie-Analyse der normalen und glykiertem Blutgerinnsel zeigt, dass glykiertes Blutgerinnsel sind dichter mit kleineren Poren als die normalen Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Zusatz von FXIIIa während der Gerinnsel Polymerisation. In 3A und 3B ist

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Diskussion

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Um aussagekräftige Daten über die Struktur des Gerinnungsmechanismen bei Krankheitszuständen zu erhalten, ist es wichtig, die Faktoren der Blutgerinnung beteiligt sind, um die Effekte der Proteine ​​und Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen, zu isolieren. Dieses Protokoll wurde zum Zweck der Untersuchung der Struktur des Fibringerinnsels bei diabetischen und SCD Zustände in vitro entwickelt.

Es ist notwendig, um die Mechanismen in der Fibrinbildung und Fibrinolyse bei Krankhe.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Lam Lab an der Georgia Tech für viele hilfreiche Diskussionen bei der Entwicklung der experimentellen Assays. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer K01HL115486 und durch den New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 des Office of the Director, National Institutes of Health, unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrophiles Polysaccharid)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparinisierte Vacutainer-RöhrchenBD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 humanes Fibrinogen-KonjugatMolekulare SondenF13191
0,5 ml graduiertes MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific05-408-120
GlukosepulverLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Konfokales MikroskopZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD-Lösung zur ZellmarkierungLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme ResearchLaboratories N/A
Natriumchlorid (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Statistische ModellierungssoftwareIBMSPSS Statistics 22

Referenzen

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  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.

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Schlagwörter

KonfokalmikroskopieFibrinolyseratenglykierte GerinnselSichelzellan mieDiabetes mellitusThromboseH mostaseEchtzeit BildgebungGerinnselpolymerisationPlasmin induzierte Lyse

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