Name: Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie die morphologischen Unterschiede glykierter Fibringerinnsel bei Diabetes und Sichelzellanämie mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen der Fibrinolyseraten und liefert wertvolle Erkenntnisse für die Thromboseforschung.

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Die Autoren danken dem Lam Lab an der Georgia Tech für viele hilfreiche Diskussionen bei der Entwicklung der experimentellen Assays. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer K01HL115486 und durch den New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 des Office of the Director, National Institutes of Health, unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

HINWEIS: Das folgende Protokoll befolgt die vom Institutional Review Board (IRB) an der Georgia Tech Richtlinien. 1. Blutentnahme und Rotes Blutkörperchen Isolierungsverfahren <ol><li> Sammeln Sie 40 bis 120 ml Blut von Spendern in 10 ml Heparin-Vacutainer-Röhrchen. Starten PBMC (periphere Blut mononukleären Zellen) Isolierung innerhalb von 4 Stunden der Sammlung. Während dieser Zeit halten Blut bei RT. HINWEIS: O / N Lagerung von Blut in RT oder bei 4 ° C wird nicht empfohlen, da dies zu niedrigeren PBMC Ausbeute führen. </li><li> Verdünnen Sie Vollblut 1: 1 in eiskaltem (4 ° C) sterile PBS. </li><li> Je 10 ml eiskaltem hydrophile Polysaccharid in eine leere, sterile 50 ml konischen Röhrchen. Verdünntem Vollblut übertragen Sie leicht über der hydrophilen Polysaccharid. </li><li> Verwenden Sie eine 25 ml Pipette in Zeiteinstellung und Pipetten Blut an der Seite des Rohres sehr langsam. Sicherzustellen, dass das Blut nicht mit der Saccharid vor Centri vermischtfugation weil das hydrophile Polysaccharid Zellen toxisch, und ansonsten wird die PBMC Ausbeute niedriger sein. </li><li> Zentrifuge Blutproben für 30 min bei 400 × g bei 4 ° C. Falls verfügbar, verringern die Bremsgeschwindigkeit der Zentrifuge auf die Hälfte der maximalen zur besseren Trennung nach der Zentrifugation. </li><li> Absaugen des Plasmas / Thrombozytenfraktion der zentrifugierten Blutprobe. Sorgfältig absaugen die hydrophile Polysaccharid Schicht direkt über der RBC-Schicht verpackt. </li><li> Sammeln Sie 8-10 ml gepacktes Erythrozyten und verdünnt 1: 1 mit unsterilen 0,9% NaCl Kochsalzlösung. </li></ol> 2. konfokale Mikroskopie Bewertung der Glykiertes Clot Strukturen (Simulated Diabetische Blutgerinnsel) <ol><li> Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C. </li><li> Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Für die gesunde, normale Fibrinogen gerinnt, mischen, Fibrinogen mit 10% fluoreszenzmarkierten FibrinogenKonjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml. </li><li> Künstlich glykiertes Fibrinogen (diabetische Gerinnsel zu simulieren), Inkubation Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einer 5 mM Lösung von Glucose in 50 mM Tris / 100 mM NaCl bei einer resultierenden Konzentration von 6,8 mg / ml. </li></ol></li><li> Umfassen die Mikrozentrifugenröhrchen mit einem undurchsichtigen Material, um Belichtung zu vermeiden. Die Röhrchen in ein 37 ° C Wasserbad für 48 Stunden inkubieren. </li><li> Machen Sie eine Kammer auf einen Glasobjektträger durch Aufbringen eines dünnen Klebe auf 2 Seiten des Schlittens. </li><li> Nach 48 Stunden Inkubationszeit vorzubereiten Reagenzien für die Fibrinbildung durch Auftauen FXIIIa und Menschen alpha Thrombin bei RT. </li><li> Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer. </li><li> Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer. <ol><li> Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul. </li><li> Für die glykierte gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 3,4 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul. </li></ol></li><li> Unmittelbar Je 30 ul der Fibrin-Lösung in die durch den Kleber gebildete Kammer. </li><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,15 mm auf der Oberseite der zwei Klebstoffschichten. Verschließen Sie die offenen Seiten mit klaren Klebstoff, um das Fibringerinnsel austrocknet. Sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht mit dem Fibringerinnsel interagieren. </li><li> Lassen Sie die Fibringerinnsel zu 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren. </li><li> Nehmen Sie die konfokale Mikroskopie Bilder der Gerinnsel mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Oil M27 Objektiv mit einem 488 nm Argon-Laser. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie Bewertung von Fibringerinnseln haltigen Erythrozyten von Sichelzellanämie Patienten <ol><li> Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C. </li><li> Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Für den gesunden, normal Fibringerinnsels mischen menschlichem Fibrinogen mit 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml. </li><li> Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs mischen Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl, daß die resultierende Konzentration der Fibrinogen 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Beschriften Sie die isolierten Erythrozyten (sowohl normale als auch jene von Sichelzellpatienten von der RBC-Isolierungsprotokoll erhalten wird) mit einem Zell-Markierungslösung. <ol><li> Suspend-Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 pro ml in jeder gewählten serumfreien Kulturmedium. </li><li> Mit 5 ul / ml der Zellsuspension in Zellmarkierungslösung. Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren vorsichtig. </li><li inkubieren f min bei c.><li> Zentrifugieren der markierten Suspension Röhrchen bei 1.500 UpM für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und sanft wieder die Zellen in 37 ° C Medium. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang (3.3.4 und 3.3.5) zwei weitere Male. </li></ol></li><li> Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer. </li><li> Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer. <ol><li> Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul. </li><li> Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin werden 5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul. </li></ol></li><li> Je 10 ul der markierten roten Blutkörperchen in das Fibrin-Lösung. Pipette 30 ul des Fibrin mit Erythrozyten auf das Mikroskop Glas (siehe Vorbereitung gl schiebenycated Blutgerinnsel). </li><li> Ermöglichen das Fibrin auf 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren. </li><li> Nehmen konfokale Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop, und nutzen Anregungslaser mit Wellenlängen von 488 nm und 633 nm, um die Fluoreszenz-markierten Fibrin und Erythrozyten anregen. </li></ol> 4. konfokale Mikroskopie Bewertung der Fibrinolyse Preise in Glykiertes Clot Strukturen <ol><li> Wiederholen der Konfokalmikroskopie Protokoll von glykiertem Blutgerinnsel (Protocol Schritt 2) für die Fibrinolyse Rate Auswertung in glykierten Gerinnsel. </li><li> Verschließen Sie nicht die Enden der Kammer mit klaren Klebstoff. Lassen Sie die Fibringerinnsel für 1,5 h bei 21-23 ° C in einem geschlossenen Gehäuse, das 250 ml Wasser, um Austrocknung zu verhindern polymerisieren. </li><li> Nach der Polymerisation erhalten Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop. </li><li> Pipette Plasmin in das offene Ende der Kammer und verteilen das Plasmin durch das Gerinnsel durch Kapillarwirkung. <ol><li> Fürder normale und der glykierten Fibrinolyse Experimente mit normalen Konzentrationen, Pipetten 25 ul mit 200 ug / ml Plasmin in die Öffnung der Kammer. </li><li> Für die glykierte Gerinnseln mit reduzierten Konzentrationen Pipette 25 ul bei 50 ug / ml in die Öffnung der Kammer. </li></ol></li><li> Verwenden Sie den Zeitreihen-Funktion (siehe Abbildung 1) in der konfokalen Mikroskop-Software, um Echtzeit-Videoaufnahmen von der Plasmin Lyse des Gerinnsels zu erfassen. <ol><li> Klicken Erfassungsmodus und wählen Sie "Time Series". Wählen Sie die Anzahl der Zyklen und die Aufnahmezeitintervall. </li></ol></li></ol> 5. Berechnung Fibrinolyse Preise <ol><li> Bestimmen Sie die Lyse Rate, indem Sie einen Bereich (2500 &amp; mgr; m 2) und der Berechnung der verstrichenen Zeit erforderlich ist, um einen festen Bereich der Gerinnsel aufzulösen. Errechnen Lyserate Verwendung der folgenden Gleichung (2): <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" files ftp_upload></li></ol> 6. Statistische Analyse der Fibrinolyse Preise <ol><li> Analysieren Sie die Lyse-Daten mit Hilfe statistischer Analyse-Software. Führen Sie eine one-way ANOVA und post hoc Tukey-Kramer-Test 44,45. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um aussagekräftige Daten über die Struktur des Gerinnungsmechanismen bei Krankheitszuständen zu erhalten, ist es wichtig, die Faktoren der Blutgerinnung beteiligt sind, um die Effekte der Proteine ​​und Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen, zu isolieren. Dieses Protokoll wurde zum Zweck der Untersuchung der Struktur des Fibringerinnsels bei diabetischen und SCD Zustände in vitro entwickelt. Es ist notwendig, um die Mechanismen in der Fibrinbildung und Fibrinolyse bei Krankhe...

Schädigung eines Blutgefäßes Endothelauskleidung durch die hämostatische Reaktion oder die Bildung eines Blutgerinnsels repariert. Wenn Blut dringt in die extrazelluläre Matrix, Gewebefaktoren aktiviert Blutplättchen in den Blutstrom, die Einleitung der Gerinnungskaskade zu erleichtern. Der Schlüssel mechanische Komponente dieser Heilungsprozess ist die Fibrinmatrix, von Fibrin Fasern, die hochelastisch sind zusammengesetzt und kann große Kräfte 1-4 zu erhalten. Viele Forscher haben die Bildung Struktur und Funktion von Fibrin ausführlich in den vergangenen Jahrzehnten 5-13 untersucht. Patienten mit Krankheiten, wie Diabetes mellitus und Sichelzellen ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von thrombotischen Komplikationen wie Herzinfarkte, ischämische Herzerkrankungen und Schlaganfälle 14-19. Über 2 Millionen Menschen neu mit Diabetes mellitus diagnostiziert jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. Es gibt zwei Arten von Diabetes: Typ I, wo dieKörper nicht ausreichende Mengen an Insulin und Typ II, wo der Körper wird resistent gegen Insulin zu produzieren. Unter Diabetikern, kardiovaskulärer Erkrankung (CVD) ist die Ursache für die 80% der Morbidität und Mortalität, die mit der Krankheit assoziiert 20,21. Sichelzellanämie (SCD) ist eine genetisch bedingte Blutgerinnungsstörung, die mehr als 100.000 Menschen in den Vereinigten Staaten 22 wirkt. SCD ist eine Punkt-Mutation Krankheit, die roten Blutkörperchen bewirkt, halbmondförmige geworden, dass es schwierig für die Zellen durch die Blutgefäßsystem 23 übergeben. Beide Krankheitszuständen erhöht die Chancen der Entwicklung atherothrombotischer Bedingungen im Körper. Einer der Gründe dafür ist, auf einer veränderten Fibrin Struktur und Funktion in erkrankten Zuständen 14,24-26. In beiden Diabetes und Sichelzellanämie, gibt es Hyperkoagulation und Hypofibrinolyse Aktivität, die Atherothrombose und kardiovaskulären Erkrankungen induziert (CVD) im Vergleich zu gesunden Patienten 17,27,28. Es ist bekannt, dass Hypofibrinolyse fördert Atherosklerose Progression und erzeugt rezidivierende ischämische Ereignisse bei Patienten mit vorzeitigem Koronararterienerkrankung 29. In der aktuellen Manuskript untersuchten wir die Rolle von Fibrin physikalischen Eigenschaften in diesem besonderen Ambiente. Fibringerinnsel Strukturen in nicht erkrankten Patienten werden von dünnen Fasern, größere Poren, und in der Regel weniger dicht 14,24 zusammen. Die erhöhte Porosität und weniger dicht Fibringerinnseln in gesunden Patienten wurde gefunden, dass die Fibrinolyse 16 erleichtern. In hyperthrombotischen Bedingungen wie diabetische und Sichelzellanämie, gibt es eine Erhöhung in der Produktion von Fibrinogen, wodurch der Fibrinogenkonzentration um vom Normalniveau von 2,5 mg / ml in gesunden Patienten 30-33 erhöhen. Fibringerinnseln in diabetischen Patienten gebildet haben sich als weniger porös, steifer, mehr Verzweigungspunkte, und dichter im Vergleich zu gesunden, nicht-diaBetic Patienten 14,24,33-35. Die veränderte Fibrinstruktur ist ein Ergebnis der Glykierung Mechanismen, die in den Proteinen der Gerinnselbildung beteiligt auftreten. Nichtenzymatische (irreversibel) Glykosylierung tritt auf, wenn Glukose-Moleküle binden an Lysinresten auf der Fibrinogen-Molekül, das die menschliche Faktor XIIIa (FXIIIa) ordnungsgemäß Vernetzungs Glutamin und Lysin-Reste 33,36,37 hemmt. Die Strukturanalyse von Fibrin-Netzwerken wurde ausgiebig vor kurzem untersucht. Insbesondere haben Forscher Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion von Fibrin-Netzwerken 38, untersucht, wie auch intravaskuläre (endotheliale Zellen) und extravaskuläre (Fibroblasten und glatte Muskelzellen) Zellen beeinflussen Fibrinstruktur 39, verwendet viskoelastischen und Spektralanalyse zu Fibrin Strukturen 40 analysiert und verwendet entwickelten Korrelationen zwischen Fibrin Struktur und mechanischen Eigenschaften mit experimentellen und theoretischen Ansätze 41 </sup&gt;. Der Fokus der vorliegenden Studie war es Gerinnsel Strukturen unter simulierten diabetischen und Sichelzellen Thrombose Bedingungen formulieren und konfokale Mikroskopie zur Untersuchung der Struktur und Funktion der Blutgerinnsel in Krankheitszuständen verwendet werden. Fibringerinnsel wurden aus menschlichem Fibrinogen, humanes Thrombin und FXIIIa gebildet. Die Gerinnsel wurden mit Plasmin lysiert. Diabetischer Bedingungen zu simulieren, wurde erhöhte Konzentration an Fibrinogen in der Glukoselösung inkubiert, um eine in vitro Glykierung Fibrinogen induzieren. Um Sichelzellanämie Gerinnungsbedingungen zu simulieren, wurden erhöhte Fibrinogenkonzentrationen mit Sichelzellen Hämatokrit von Patienten gesammelt, wie zuvor von unserer Gruppe 42 getan gemischt. Diese Verfahren wurden verwendet, um die Struktur und die Funktionen in Fibringerinnselbildung und Fibrinolyse bei Krankheitszuständen beteiligt sind, sowie die Mechanismen, die CVD induzieren zu untersuchen. Basierend auf den aktuellen Informationen über diese Krankheiten waren die glykosylierten Fibringerinnsel Strukturen dichter mit weniger einnd kleineren Poren. Die Fibringerinnsel mit roten Blutzellen von Sichelzellpatienten (RBCs) wurden ebenfalls dichter und angezeigt Aggregation der Erythrozyten und agglomeriert Fibrin Clustern. Dies ist ein gut etabliertes Phänomen, das zuvor 43 festgestellt hat. Es wurde auch vermutet, dass die Fibrinolyse Quote wäre in glykosylierten Fibringerinnsel mit und ohne reduzierte Plasmin im Vergleich zu gesunden, normalen Fibrin deutlich geringer. Die Ergebnisse zeigten, dass für glykosyliertes Fibringerinnseln, signifikant Lyserate Ergebnisse wurden nur unter den Bedingungen einer reduzierten Plasminkonzentration beobachtet. Dieses experimentelle Technik der Verwendung der konfokalen Mikroskopie bietet signifikante Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, weil die Zellen und Proteine ​​in ihrem nativen Zustand, der die Erfassung von Echtzeitvideo der Gerinnungsaktivität ermöglicht bleibt. Diese Methode synthetisch induzierenden Blutgerinnung ist auch billiger und zeiteffizienter als Erhalt von Patientenproben und Ausfiltern einzelneProteine ​​und Enzyme. Ferner ergeben sich mit getrennten Proteine ​​und Enzyme, um Gerinnsel zu synthetisieren, die Gerinnsel wurden standardisiert, so dass es nicht die Variabilität zwischen den Proben als Folge von anderen Proteinen im Plasma.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (hydrophiles Polysaccharid)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml heparinisierte Vacutainer-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 humanes Fibrinogen-Konjugat</td><td>Molekulare Sonden</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml graduiertes Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glukosepulver</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2</td><td>)Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD-Lösung zur Zellmarkierung</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plasmin</td><td>Enzyme Research</td><td>Laboratories N/A</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Statistische Modellierungssoftware</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentelle und bildgebende verfahren für die prüfung fibringerinnsel strukturen in normalen und erkrankten staaten

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibrin ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität von Blutgerinnseln verantwortlich ist. In den letzten Jahren wurde viel über Fibrin geforscht, einschließlich der Untersuchung der Synthese, Struktur-Funktion und Lyse von Blutgerinnseln. Es gibt jedoch noch viel Unbekanntes über die morphologischen und strukturellen Merkmale von Blutgerinnseln, die bei Patienten mit einer Krankheit auftreten. In dieser Forschungsarbeit werden experimentelle Techniken vorgestellt, die es ermöglichen, morphologische Unterschiede von krankhaften Gerinnselstrukturen aufgrund von Krankheitszuständen wie Diabetes und Sichelzellenanämie zu untersuchen. Unsere Studie konzentriert sich auf die Präparation und Auswertung von Fibringerinnseln, um morphologische Unterschiede mit verschiedenen experimentellen Assays und konfokaler Mikroskopie zu beurteilen. Darüber hinaus wird eine Methode beschrieben, die eine kontinuierliche Echtzeitberechnung der Lyseraten in Fibringerinnseln ermöglicht. Die hier beschriebenen Techniken sind wichtig für Forscher und Kliniker, die komorbide thrombotische Pathologien wie Myokardinfarkte, ischämische Herzkrankheiten und Schlaganfälle bei Patienten mit Diabetes oder Sichelzellanämie aufklären wollen.

Konfokale Mikroskopie Analyse der Glykiertes Fibringerinnsel Strukturen Konfokales Mikroskopiebilder von normalen und glykiertem Blutgerinnsel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die konfokale Mikroskopie-Analyse der normalen und glykiertem Blutgerinnsel zeigt, dass glykiertes Blutgerinnsel sind dichter mit kleineren Poren als die normalen Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Zusatz von FXIIIa während der Gerinnsel Polymerisation. In 3A und 3B ist</strong...

In diesem Manuskript werden experimentelle Techniken, einschließlich Blutaufbereitung, konfokale Mikroskopie und Analyse der Lyserate, vorgestellt, um die morphologischen Unterschiede zwischen normalen und abnormalen Gerinnselstrukturen aufgrund von Krankheitszuständen zu untersuchen.

Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die morphologischen Unterschiede in abnormalen Gerinnselstrukturen zu untersuchen, die bei Diabetes und Sichelzellenanämie auftreten, Krankheitsbedingungen für simulierte diabetische Gerinnsel. Dies wird durch die Abbildung glykierter Gerinnselstrukturen durch konfokale Mikroskopie für Blutproben von Sichelzellpatienten erreicht. Fibringerinnsel, die rote Blutkörperchen enthalten, werden in Echtzeit konfokal abgebildet.Anschließend kann eine mikroskopische Analyse durchgeführt werden, um die Fibrinolyseraten an den normalen und glykierten Gerinnselstrukturen zu bewerten. Letztendlich kann diese Echtzeitanalyse verwendet werden, um die morphologischen Unterschiede zu bewerten, die in krankhaften Gerinnselstrukturen als Reaktion auf die Krankheitszustände auftreten, in denen sie auftreten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Thrombose und Blutstillung zu beantworten, wie z.B. Wie unterscheiden sich die Strukturen der Fibringerinnsel bei Patienten mit Diabetes oder Sichelzellanämie?Um simulierte diabetische Gerinnsel durch konfokale Mikroskopie zu bewerten, tauen Sie zuerst humanes Fibrinogen und 10% fluoreszenzmarkiertes menschliches Fibrinogenkonjugat bei 37 Grad Celsius auf, wenn die Lösungen von erwärmtem menschlichem Fibrinogen vermischt und das Fibrinogenkonjugat in einer Glukosetrics-Natriumchloridlösung inkubiert und die Lösung vor Licht geschützt in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 48 Stunden inkubiert. Gegen Ende der Inkubation wird mit einem nicht flüssigen Klebstoff ein dünner Klebstoff auf zwei Seiten eines Glasobjektträgers angebracht, um eine Kammer zu bilden, dann wird eine Fibrinogenlösung mit dem Raumtemperaturfaktor 13 und Thrombin auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern gemischt und sofort 30 Mikroliter der Fibrinlösung in die Objektträgerkammer überführt. Legen Sie nun einen 22 x 22 Millimeter großen Glasdeckglas mit einer Spitze von 15 Millimetern Dicke auf den Kleber und verschließen Sie die offenen Seiten der Kammer mit klarem Klebstoff, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Kleber nicht mit dem Gerinnsel interagiert.Lassen Sie die Fibringerinnsel zwei Stunden lang bei 21 bis 23 Grad Celsius polymerisieren. Nehmen Sie dann konfokale Mikroskopiebilder der Gerinnsel mit einem 40-fach-Objektiv und einem 488-Nanometer-Argonlaser auf, um Gerinnsel von Sichelzellpatienten zu bewerten. Verdünnen Sie zuerst die Probe der roten Blutkörperchen mit 1 Million Zellen pro Milliliter in serumfreiem Zellkulturmedium und mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mit fünf Mikrolitern der entsprechenden Zellmarkierungslösung.Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius waschen Sie die Zellen dreimal in 37 Grad Celsius Medium, während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, mischen Sie frisch zubereitete Fibrinogenlösung Faktor 13 und Thrombin, wie gerade gezeigt. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter der markierten roten Blutkörperchen in die Fibrinlösung und geben Sie sofort 30 Mikroliter der Zelllösung in eine Klebekammer ab. Lassen Sie das Fibrin auf einem Glasobjektträger nach zwei Stunden bei 21 bis 23 Grad Celsius polymerisieren, nehmen Sie mit Anregungslasern mit Wellenlängen von 488 Nanometern und 633 Nanometern konfokale Bilder der Gerinnsel auf, um das fluoreszenzmarkierte Fibrin bzw. die roten Blutkörperchen anzuregen.Um die Fibrinolyseraten und die glykierten Gerinnselstrukturen zu bewerten, werden zunächst glykierte Gerinnsel hergestellt, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Fibringerinnsellösung in die Klebekammer abgegeben haben, verschließen Sie jedoch nicht die Enden der Kammer. Lassen Sie die Gerinnsel stattdessen bei 21 bis 23 Grad Celsius in einem versiegelten Gehäuse mit 250 Millilitern Wasser polymerisieren, um eine Austrocknung zu verhindern.Nehmen Sie nach eineinhalb Stunden Bilder der Gerinnsel durch konfokale Mikroskopie auf, wie gerade gezeigt. Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter Plasmin in das offene Ende der Kammer und lassen Sie das Plasmin durch Kapillarwirkung im Gerinnsel verteilen. Öffnen Sie abschließend die Zeitreihenfunktionen der Konfokalmikroskop-Software, klicken Sie auf den Erfassungsmodus und wählen Sie Zeitreihen aus.Wählen Sie dann die Anzahl der Zyklen und das Aufnahmezeitintervall aus, um Echtzeit-Videomaterial der plasmininduzierten Gerinnsellyse aufzunehmen. Die Analyse normaler und glykierter Gerinnsel zeigt, dass glykierte Gerinnsel dichter sind und kleinere Poren aufweisen als normale Gerinnsel, sowohl mit als auch ohne Zusatz von Faktor 13 während der Gerinnselpolymerisation. In der Tat gibt es in den glykierten Blutgerinnseln der UN eine niedrigere Fibrinkonzentration, wodurch eine weniger dichte Struktur entsteht als bei den glykierten Gerinnseln, die eine höhere Fibrinkonzentration enthalten. Fibringerinnsel von Sichelzellenpatienten enthalten rote Blutkörperchen und weisen aufgrund einer erhöhten Fibrinogenkonzentration bei diesen Personen dichtere Strukturen auf als gesunde Fibrinogengerinnsel.Darüber hinaus ist die natürliche Tendenz der roten Blutkörperchen von Sichelzellenpatienten, Aggregate und Geschlechter zu bilden, Klumpen roter Blutkörperchen, die in das Fibrinnetzwerk verwoben werden, was zur Bildung von aberranten Gerinnselstrukturen führt, die sich in ihrer Morphologie deutlich von denen unterscheiden, die bei normalen Patienten beobachtet werden. Schließlich zeigt die Analyse der Fibrinolyseraten von normalen gegenüber glykierten Gerinnseln eine signifikant beeinträchtigte Fähigkeit der simulierten diabetischen Gerinnsel, Fibrin zu bilden, wenn nicht genügend Plasmin vorhanden ist. Diese Forschung wird dazu beitragen, den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Thrombose und Blutstillung zu ebnen, insbesondere für Patienten, die infolge von Sichelzellanämie und Diabetes komorbide Erkrankungen entwickeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt die Verwendung eines UV-sichtbaren Spektralphotometers zur Überwachung der Bildung von unlöslichen Fibringerinnseln in Abhängigkeit von der Änderung der Lösungstrübung. Das UV-sichtbare Spektralphotometer misst die Absorption der Lösung über die Zeit, die die Trübungsänderung aufgrund der Bildung unlöslicher Fibringerinnsel darstellt.

UV-sichtbare Spektroskopie zur Überwachung der Bildung von Fibringerinnseln

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

Fibrin ist verantwortlich für die Gerinnselbildung während der Hämostase und Thrombose. Trübungsassays und Thromboelastograhy (TEG) können als synergistische Werkzeuge eingesetzt werden, die eine komplementäre Bewertung eines Gerinnsels ermöglichen. Diese beiden Techniken zusammen können mehr Einblick in die Art und Weise geben, wie Gerinnungsbedingungen die Bildung von Fibringer beeinflussen.

Nutzung von Trübung und Thromboelastographie zur komplementären Clot-Charakterisierung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.

Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

Diese Studie beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Zellkomponentenanalyse von zerebralen Blutgerinnseln durch Gerinnselauflösung, Zellfärbung und routinemäßige Blutuntersuchung.

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In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.

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Erfahren Sie die morphologischen Unterschiede glykierter Fibringerinnsel bei Diabetes und Sichelzellanämie mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen der Fibrinolyseraten und liefert wertvolle Erkenntnisse für die Thromboseforschung.

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