Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die morphologischen Unterschiede in abnormalen Gerinnselstrukturen zu untersuchen, die bei Diabetes und Sichelzellenanämie auftreten, Krankheitsbedingungen für simulierte diabetische Gerinnsel. Dies wird durch die Abbildung glykierter Gerinnselstrukturen durch konfokale Mikroskopie für Blutproben von Sichelzellpatienten erreicht. Fibringerinnsel, die rote Blutkörperchen enthalten, werden in Echtzeit konfokal abgebildet.

Anschließend kann eine mikroskopische Analyse durchgeführt werden, um die Fibrinolyseraten an den normalen und glykierten Gerinnselstrukturen zu bewerten. Letztendlich kann diese Echtzeitanalyse verwendet werden, um die morphologischen Unterschiede zu bewerten, die in krankhaften Gerinnselstrukturen als Reaktion auf die Krankheitszustände auftreten, in denen sie auftreten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Thrombose und Blutstillung zu beantworten, wie z.B. Wie unterscheiden sich die Strukturen der Fibringerinnsel bei Patienten mit Diabetes oder Sichelzellanämie?

Um simulierte diabetische Gerinnsel durch konfokale Mikroskopie zu bewerten, tauen Sie zuerst humanes Fibrinogen und 10% fluoreszenzmarkiertes menschliches Fibrinogenkonjugat bei 37 Grad Celsius auf, wenn die Lösungen von erwärmtem menschlichem Fibrinogen vermischt und das Fibrinogenkonjugat in einer Glukosetrics-Natriumchloridlösung inkubiert und die Lösung vor Licht geschützt in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 48 Stunden inkubiert. Gegen Ende der Inkubation wird mit einem nicht flüssigen Klebstoff ein dünner Klebstoff auf zwei Seiten eines Glasobjektträgers angebracht, um eine Kammer zu bilden, dann wird eine Fibrinogenlösung mit dem Raumtemperaturfaktor 13 und Thrombin auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern gemischt und sofort 30 Mikroliter der Fibrinlösung in die Objektträgerkammer überführt. Legen Sie nun einen 22 x 22 Millimeter großen Glasdeckglas mit einer Spitze von 15 Millimetern Dicke auf den Kleber und verschließen Sie die offenen Seiten der Kammer mit klarem Klebstoff, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Kleber nicht mit dem Gerinnsel interagiert.

Lassen Sie die Fibringerinnsel zwei Stunden lang bei 21 bis 23 Grad Celsius polymerisieren. Nehmen Sie dann konfokale Mikroskopiebilder der Gerinnsel mit einem 40-fach-Objektiv und einem 488-Nanometer-Argonlaser auf, um Gerinnsel von Sichelzellpatienten zu bewerten. Verdünnen Sie zuerst die Probe der roten Blutkörperchen mit 1 Million Zellen pro Milliliter in serumfreiem Zellkulturmedium und mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mit fünf Mikrolitern der entsprechenden Zellmarkierungslösung.

Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius waschen Sie die Zellen dreimal in 37 Grad Celsius Medium, während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, mischen Sie frisch zubereitete Fibrinogenlösung Faktor 13 und Thrombin, wie gerade gezeigt. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter der markierten roten Blutkörperchen in die Fibrinlösung und geben Sie sofort 30 Mikroliter der Zelllösung in eine Klebekammer ab. Lassen Sie das Fibrin auf einem Glasobjektträger nach zwei Stunden bei 21 bis 23 Grad Celsius polymerisieren, nehmen Sie mit Anregungslasern mit Wellenlängen von 488 Nanometern und 633 Nanometern konfokale Bilder der Gerinnsel auf, um das fluoreszenzmarkierte Fibrin bzw. die roten Blutkörperchen anzuregen.

Um die Fibrinolyseraten und die glykierten Gerinnselstrukturen zu bewerten, werden zunächst glykierte Gerinnsel hergestellt, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Fibringerinnsellösung in die Klebekammer abgegeben haben, verschließen Sie jedoch nicht die Enden der Kammer. Lassen Sie die Gerinnsel stattdessen bei 21 bis 23 Grad Celsius in einem versiegelten Gehäuse mit 250 Millilitern Wasser polymerisieren, um eine Austrocknung zu verhindern.

Nehmen Sie nach eineinhalb Stunden Bilder der Gerinnsel durch konfokale Mikroskopie auf, wie gerade gezeigt. Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter Plasmin in das offene Ende der Kammer und lassen Sie das Plasmin durch Kapillarwirkung im Gerinnsel verteilen. Öffnen Sie abschließend die Zeitreihenfunktionen der Konfokalmikroskop-Software, klicken Sie auf den Erfassungsmodus und wählen Sie Zeitreihen aus.

Wählen Sie dann die Anzahl der Zyklen und das Aufnahmezeitintervall aus, um Echtzeit-Videomaterial der plasmininduzierten Gerinnsellyse aufzunehmen. Die Analyse normaler und glykierter Gerinnsel zeigt, dass glykierte Gerinnsel dichter sind und kleinere Poren aufweisen als normale Gerinnsel, sowohl mit als auch ohne Zusatz von Faktor 13 während der Gerinnselpolymerisation. In der Tat gibt es in den glykierten Blutgerinnseln der UN eine niedrigere Fibrinkonzentration, wodurch eine weniger dichte Struktur entsteht als bei den glykierten Gerinnseln, die eine höhere Fibrinkonzentration enthalten. Fibringerinnsel von Sichelzellenpatienten enthalten rote Blutkörperchen und weisen aufgrund einer erhöhten Fibrinogenkonzentration bei diesen Personen dichtere Strukturen auf als gesunde Fibrinogengerinnsel.

Darüber hinaus ist die natürliche Tendenz der roten Blutkörperchen von Sichelzellenpatienten, Aggregate und Geschlechter zu bilden, Klumpen roter Blutkörperchen, die in das Fibrinnetzwerk verwoben werden, was zur Bildung von aberranten Gerinnselstrukturen führt, die sich in ihrer Morphologie deutlich von denen unterscheiden, die bei normalen Patienten beobachtet werden. Schließlich zeigt die Analyse der Fibrinolyseraten von normalen gegenüber glykierten Gerinnseln eine signifikant beeinträchtigte Fähigkeit der simulierten diabetischen Gerinnsel, Fibrin zu bilden, wenn nicht genügend Plasmin vorhanden ist. Diese Forschung wird dazu beitragen, den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Thrombose und Blutstillung zu ebnen, insbesondere für Patienten, die infolge von Sichelzellanämie und Diabetes komorbide Erkrankungen entwickeln.