Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Summary

Nach der Exozytose wird die fusionierte Plasmamembran durch einen Prozess gewonnen, der als Endozytose bekannt ist. Dieser Mechanismus reformiert neue synaptische Vesikel für die nächste Runde der Freisetzung. Einzelne endozytäre Ereignisse werden durch die Verwendung der zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in chromaffinen Nebennierenzellen der Maus erfasst und analysiert.

Abstract

Neuronale Übertragung ist ein integraler Bestandteil der zellulären Kommunikation innerhalb des Gehirns. Die Depolarisation der präsynaptischen Membran führt zu einer Vesikelfusion, die als Exozytose bekannt ist und die synaptische Übertragung vermittelt. Die anschließende Entnahme von synaptischen Vesikeln ist notwendig, um neue, mit Neurotransmittern gefüllte Vesikel in einem Prozess zu erzeugen, der als Endozytose bezeichnet wird. Während der Exozytose führt die Verschmelzung von Vesikelmembranen zu einer Vergrößerung der Oberfläche und die anschließende Endozytose zu einer Verkleinerung der Oberfläche. Hier demonstriert unser Labor eine grundlegende Einführung in zellgebundene Kapazitätsaufzeichnungen einzelner endozytärer Ereignisse in der chromaffinen Nebennierenzelle der Maus. Diese Art der elektrischen Aufzeichnung ist nützlich für hochauflösende Aufzeichnungen von Exozytose und Endozytose auf der Ebene einzelner Vesikel. Während mit dieser Technik sowohl Vesikelexozytose als auch Endozytose nachgewiesen werden können, liegt der Schwerpunkt unseres Labors auf der Vesikelendozytose. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Technik, die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse zu analysieren. Hier werden die Verfahren für die Dissektion von Nebennierengewebe der Maus, die chromaffine Zellkultur, grundlegende zellgebundene Techniken und nachfolgende Beispiele für einzelne Spuren zur Messung eines singulären endozytären Ereignisses beschrieben.

Introduction

Synaptischen Übertragung wird durch Exocytose von Neurotransmitter-haltigen synaptischer Vesikel vermittelten, und diese Vesikel müssen lokale endozytischen Recycling innerhalb der Nervenendigung unterziehen, um neuronale Kommunikation langfristig aufrecht zu erhalten. Angesichts der wesentlichen Rolle der synaptischen Übertragung im Gehirn, das Verständnis der molekularen Maschinerie, die synaptischen Vesikel-Zyklus ist eine wesentliche Grundlage für ein besseres Verständnis der zellulären Kommunikation als Ganzes darstellt. Unter Zellmodellsysteme, hat die chromaffinen Nebennierenzell einige der endgültige Einblick in die molekulare Maschinerie zugrunde liegenden s....

Protocol

HINWEIS: Das gesamte Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, wie von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Illinois in Chicago genehmigt.

1. Lösungen und Kultur Medien Vorbereitungen

1. Halten Sie alle Lösungen bei -20 ° C für bis zu sechs Monate. Halten Sie das Kulturmedium bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
2. Planen 100 ml Kulturmedium durch Mischen von 1 ml Pen-Strep-Lösung und 1 ml itsX (Insulin-Transferrin-Selen-Ergänzung) auf 100 ml mit DMEM.
3. Vorbereitung Enzymlösung durch Mischen mit 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl ₂

Results

Die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Dichtung Gigaohm sind entscheidend für die Qualität der Cell-Attached-Kapazität Aufnahmen. Daher ist es wichtig, eine effektive und effiziente Zellkultur vor der elektrophysiologischen Ableitungen und typische lebensfähigen Zellen beschaffen sind in Abbildung 1 dargestellt. Üben und Zeit hilfreich, um eine Giga-Ohm Dichtung mit hoher Qualität sein. Wenn man kann deutlich sehen, Zellverformung, wenn der Patch-Pipette nähert sich der Zelle, wie in Schritt-Proto.......

Discussion

Cell-Attached-Kapazitätsmessungen erfordern mehrere wichtige Schritte, um Aufnahmen mit hoher Qualität erfolgreich zu erhalten: 1) lebensfähig und gesunden Zellen von Nebennieren hergestellt werden; 2) PDL Beschichtung der Deck; 3) Gigaohm Dichtung Bildung; 4) Geräuschpegel des Systems; und 5) Phasenkorrektur.

Für Tierchirurgie, ist eine potenziell Änderungen machen können, um den chirurgischen Ansatz, um am besten anpassen und Geschicklichkeit, um Schäden bei der Präparation zu verhindern. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysin	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Von UV-Strahlung fernhalten
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Deckglas	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Nur auf ICE auftauen!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus Patch-Verstärker	HEKA
BNC-2090 Datenerfassungskarte	National Instruments
Igor Datenerfassungssoftware	Wavemetrics
P-97 Pipettenabzieher	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Kapillaren aus Borosilikatglas	Sutter Instruments	B150-110-10	Außendurchmesser: 1,5 mm Innendurchmesser: 1,10 mm Länge: 10 cm