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Methodenartikel

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

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DOI:

10.3791/52041

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16. Januar 2015

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1Department of Entomology, Virginia Tech

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll entwickelt, um die Auswirkungen eines epigenetischen Medikaments DZNep auf die Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensfähigkeit von Mücken zu untersuchen. In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren für die wässrige Exposition von DZNep gegenüber unreifen Mücken und eine blutbasierte Exposition von DZNep gegenüber adulten Mücken zusätzlich zur Messung der SAH-Hydrolase-Hemmung.

Zusammenfassung

Insektizidresistenz stellt ein großes Problem für die Malariakontrollprogrammen. Mücken Anpassung an eine Vielzahl von Veränderungen in der Umwelt schnell, so dass die Malaria unter Kontrolle eine allgegenwärtige Problem in tropischen Ländern. Die Entstehung von resistenten Populationen Insektizid garantiert die Erforschung von neuartigen Arzneimittelziel Wege und Verbindungen für Vektor-Moskito-Kontrolle. Epigenetische Medikamente werden auch in der Krebsforschung etabliert, aber nicht viel über deren Auswirkungen auf Insekten bekannt. Diese Studie liefert ein einfaches Protokoll für die Prüfung der toxikologischen Wirkungen von 3-Deazaneplanocin A (DZNep), eine experimentelle zugelassene epigenetische Arzneimittel zur Krebstherapie, in der Malaria-Vektor, Anopheles gambiae. Eine konzentrationsabhängigen Anstieg der Sterblichkeit und Abnahme der Größe wurde in unreifen Moskitos zu DZNep ausgesetzt beobachtet, während die Verbindung reduziert die Fruchtbarkeit der erwachsenen Mücken in Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Darüber hinaus gab es eine drogenabhängige Abnahme der S -Adenosylhomocystein (SAH) Hydrolaseaktivität in Mücken nach Exposition gegenüber DZNep Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Diese Protokolle stellen die Forscher mit einer einfachen, Schritt-für-Schritt-Verfahren, um mehrere toxikologische Endpunkte für ein experimentelles Medikament zu beurteilen und wiederum zeigen eine einzigartige mehrgliedrige Ansatz für Ausflüge in die toxikologischen Wirkungen von wasserlöslichen epigenetische Arzneimittel oder Verbindungen Interesse gegen vector Mücken und andere Insekten.

Einleitung

Malaria ist für die höchste Anzahl von Insekten verursachten Todesfälle in der Welt verantwortlich. Schätzungsweise 219 Millionen Fälle treten jährlich weltweit, was zu etwa 660.000 Todesfällen, vor allem in Afrika ein. Trotz aller gemeinsamen Bemühungen, Malaria Programme mehrere Herausforderungen. Während insektizide behandelten Moskitonetzen und Innenrest Spritzen bilden wichtige Komponenten des Programms, Resistenz gegen Insektizide in der lokalen Bevölkerung behindern diese Bemühungen 2. Die rasche Zunahme der Insektizide resistent Mückenpopulationen weitgehend auf die Fähigkeit der Malariamücken, schnell auf Veränderungen in ihrer Umgebung anpassen und nutzen unterschiedliche Nischen 3,4,5 zugeschrieben. Um die bestehenden Mechanismen der Insektizid-Resistenz zu überwinden, ist die Erforschung von neuartigen Insektizid Ziele und nächste Generation Verbindungen gewährleistet. Eine einfache, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bestimmung der Wirksamkeit von experimentellen Insektizide auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malaria-mosquitoes erheblich verbessern würde diese Bemühungen.

Pharmakologische Untersuchungen der Wirkung von Medikamenten auf Zelllinien und Tiermodellen haben die Verwendung von epigenetischen Medikamenten als ein nützliches Werkzeug zur Modulation der Genetik und Physiologie von Zellen und Organismen hergestellt. DNA-Methylierung und Histon-Modifikation gibt zwei epigenetische Mechanismen, die die Genexpression in vielzelligen Organismen beeinflussen, ohne die zugrunde liegenden DNA-Sequenz 6. Post-translationale Modifikationen wie Methylierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Genexpression und kann einige grundlegende Prozesse 7,8,9 beeinflussen. Forschung in einigen Insektenarten haben die Bedeutung der Epigenetik in Verfahren, die Oogenese hervorgehoben und Erhaltung von Stammzellen 10 sowie Dosiskompensation 11. Jedoch werden solche Aspekte der Krankheitsvektoren noch erforscht werden. Verwendung einer Verbindung, dieses System in Mücken modulieren, können Sie uns mit in liefernSehenswürdigkeiten in der neuen Insektizid Zielpfade. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) ist eine bekannte Histonmethylierung Inhibitor, der Auswirkungen auf die verschiedenen Arten von Krebs wurden untersucht 12,13,14,15,16. DZNep ist ein stabiles wasserlösliches Arzneimittel, das epigenetische indirekt hemmt Histon Lysin N-methyltransferase (EZH2), eine Komponente der Polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) in Säugerzellen. PRC2 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Stammzellen in multizellulären Organismen und Histon-Methylierung ist ein Schlüsselaspekt der PRC2 vermittelte Gen-Silencing. Bei immungeschwächten Mäusen Zellen mit DZNep vorbehandelt wurde gezeigt, dass weniger tumorerzeugende 17 zu sein. Dieses Medikament wird immer für die Untersuchung anderer Krankheiten, wie zum Beispiel nicht-alkoholische Fettleber, in der EZH2 beteiligt ist 18 verwendet. DZNep ist ein etablierter S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) Hydrolaseinhibitors 19, 20. Die Hemmung der SAH-Hydrolase-Ergebnisse in eineAkkumulation von SAH und wiederum führt zur Hemmung der Methyltransferase-Aktivität durch die Begrenzung des verfügbaren methyl Donorgruppen. SAH ein Aminosäurederivat durch Organismen wie Insekten, in ihren Stoffwechselwege verwendet. Eine neue Studie hat gezeigt, dass DZNep in niedrigen Dosen können Diapause beeinflussen und verzögern die Entwicklung von Insekten 21 gezeigt.

Hier wird ein robustes Verfahren, um die Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu untersuchen wird entwickelt. Die drei Teile des Protokolls enthalten Anweisungen für die Prüfung der Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung auf unreifen Moskitos, Erwachsenen Blut-Fütterung Frauen, und die Enzymaktivität der erwachsenen männlichen und weiblichen Mücken. Zuerst wird DZNep in Wasser gelöst, um unreifen Moskitos Entwicklung und das Überleben zu studieren. Dies wird in zwei Konzentrationen durchgeführt, um alle Unterschiede, die sich aus 10-fachen Anstieg der Wirkstoffexposition zu vergleichen. Um die Wirkung des Medikaments auf erwachsene weibliche Mücken, DZNep erkundenauf defibrilliert Schafblut hinzugefügt und das Blut künstlich zu Frauen geleitet. Anschließend wird das Ergebnis des Medikaments auf Fruchtbarkeit sucht. Schließlich wird ein Test der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. Während dieses Protokoll mit einem Malaria-Mücke, Anopheles gambiae entwickelt, kann es leicht zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen der Zinsen auf Stechmückenarten oder andere Insekten angepasst werden. Die in diesem Protokoll aufgeführten Techniken können nicht effizient auf ein Arzneimittel mit begrenzter oder keiner Löslichkeit in Wasser oder wäßrigen Medien angewendet werden.

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Protokoll

Anmerkung: Die drei Teile des Protokolls beschreiben die wässrige Belichtung des DZNep Medikament Larven Mücken, einem blutbasierten Belichtung DZNep an erwachsene Weibchen ihre Wirkung der Fruchtbarkeit zu untersuchen und SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep gemessen unter Verwendung eines einfachen kolorimetrischen Technik. Eine schematische Darstellung dieser Untersuchungen ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Unreife Mosquito Entwicklung und Hinterbliebenen Assays

HINWEIS: Dieser Abschnitt erklärt die Verwendung eines wasserlöslichen Wirkstoff, der Mückenlarven Entwicklung und das Überleben beeinflusst.

  1. Hatch A. gambiae Eier bei 28 ° C in destilliertem Wasser (dH 2 O) und Rück sie 2. Larvenstadium.
  2. Nehmen Sie ein Sechs-Well-DNase, RNase freie Zellkulturplatte und gießen Sie 10 ml dH 2 O in jede Vertiefung.
  3. Wählen Mückenlarven an 2. Larvenstadium und fügen 15 Larven pro Vertiefung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium bis zum Teller, S.ut sie auf einem Papiertuch für 2-3 Sekunden, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
  4. Label-Brunnen mit farbcodierten Bänder Experiment zufällig. Beschriften Sie zwei Vertiefungen pro Testkonzentration auf jeder Platte (Abbildung 2).
  5. Eine 1 mM DZNep chlorid (MW = 298,73) Stammlösung durch Auflösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Brühe Lösung DZNep.HCl kennzeichnungs Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 0,5 & mgr; M und 5,0 & mgr; M.
    HINWEIS: Die Stammlösung kann bei 4 gespeichert werden ° C für kurzfristige (1 Tag bis zu einem Monat) oder -20 ° C für die langfristige (länger als einen Monat).
    HINWEIS: Die Zugabe der Stammlösung zum vorgenannten Konzentrationen nicht das Volumen des Wassers in den Vertiefungen erheblich ändern. Jedoch im Falle von viel höheren Konzentrationen ist es ratsam, die Verbindung im Larvenmedium lösen, um eine unnötige Verdünnung der Verbindung zu vermeiden.
  6. In gleicher Höhe Flocke Fischfutter in jede Vertiefung. Die Plattes und inkubieren Sie bei 28 ° C in einem Inkubator.
  7. Notieren Sie sich die Sterblichkeit für die DZNep-behandelten und unbehandelten Larven Mücken nach einer 24-Stunden-Expositionszeit. Entfernen und entsorgen Sie keine toten Larven. Wiederholen Sie diesen Aufnahme jeden Tag, bis alle Larven sterben oder verpuppen und sich als Erwachsene. Nehmen die Größe Larven jeden zweiten Tag, das heißt Tag 0, 2, 4, 6, 8, bis sie Verpuppung.
  8. Analysieren Sie die Entwicklung der Larven und Mortalitätsdaten mit einem geeigneten statistischen Analyse-Software.
    HINWEIS: Ein Balkendiagramm können die Mortalitätsdaten in Microsoft Excel darzustellen. Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) durchgeführt mit einer Software wie JMP oder SPSS wird zeigen, wenn verschiedene Dosen des Medikaments in signifikant das Überleben von Moskitolarven führen.

2. Fecundity Assay durch Verabreichung Drug durch künstliche Zufuhr an weiblichen Mücken

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Zugabe des Medikaments, um Blut einnd Verfütterung an erwachsenen weiblichen Moskitos mit einem künstlichen Feedersystem.

  1. Einrichtung für Erwachsene Moskitokäfige mit gleicher Anzahl von männlichen und weiblichen Mücken für Kontroll- und Testkäfig. Geben Sie 10% Zuckerlösung in Watte, sowohl den Käfigen, bis die Weibchen getränkt sind bereit für die Zuführung (3-5 Tage ist optimal für Anopheles gambiae).
  2. 2 Stunden vor der blutsaugenden, entfernen Sie die Baumwollkugeln, um sicherzustellen, Weibchen sind hungrig.
  3. Montieren Sie zwei künstliche Blut Anleger, die eines umgekehrten breiten unteren Glastrichter (Durchmesser = 50 mm, Länge = 70 mm) und einem umgebenden Kunststoff mit Industriekleber versiegelt bestehen. Befestigen Plastikröhrchen (Durchmesser = 7 mm), um zwei Zuführungen 'Auslässe (Durchmesser = 10 mm) über Anschlüsse für Zu- und Abfluss von Wasser. Beschriften Sie die zwei Zuführungen als "Control" und "5 uM DZNep."
  4. Mit einem handelsüblichen Heizelement, das Programm für die Fütterung eingestellt. In "Menü", wählen Sie "Einstellungen"und wählen Sie "Sollwerte"; vorinstallierte Programme wird angezeigt. Wählen Sie "SP1" und stellen Sie die Temperatur für 37 ° C.
    HINWEIS: Der Heizkörper wird sichergestellt, daß das Blut verabreicht wird, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Zusätzliche Programmeinstellungen können für verschiedene Moskito oder Insektenarten verwendet werden.
  5. Füllen Sie einen Eimer mit Wasser und tauchen Sie das Heizelement in das Wasser.
  6. Schneiden Sie ein Quadrat Stück Parafilm (50 mm x 50 mm), und ziehen Sie es, um eine dünne membranöse Film zu machen. Bedecken Sie den Boden der künstlichen Anleger, die mit dem Parafilm. Schneiden Sie ein Stück Parafilm (50 mm x 10 mm), ziehen Sie es und die Ränder der Anleger.
  7. Bauen Sie das System, den Anschluss der Zuleitungen und Heizelement durch die Rohre. Einmal abgeschlossen, schalten Sie das System und wählen Sie "SP1". Drücken Sie auf "Enter", um das System zu starten.
    HINWEIS: Das Wasser wird auf 37 zu bekommen beheizt ° C und bei dieser Temperatur gehalten.
  8. Überwachen the Temperatur des Wassers mit einem Thermometer in den Wassereimer.
    HINWEIS: Die Anschlüsse und Rohre zur Aufrechterhaltung eines konstanten Zirkulation des Wassers durch das System, so dass die Temperatur des Blutes bei 37 bleibt ° C.
  9. Füllen Sie eine flache Bodenschale mit 10% Bleichmittel-Lösung, die verwendet werden, um irgendwelche Blutverschmutzungen dekontaminiert werden.
  10. 2 ml defibrilliert Schafblut zu einem Reaktionsgefäß. Kennzeichnen Sie diese als "Control". Wiederholen Sie den Vorgang für die Versuchsröhre als "5 uM DZNep" .Add 6 ul der DZNep Stammlösung (siehe Punkt 1.5) in die Versuchsröhre mit "5 uM DZNep" gekennzeichnet mischen Sie vorsichtig das Blut und Drogen durch Umdrehen es mehrmals. Das Röhrchen 10 min bei RT.
  11. Mit einer Pipette 2 ml Kontroll- und Test Blut an die Spitze der entsprechend bezeichneten Anleger. Entsorgen Sie die Pipette in der Bleichlösung. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tasche und atmen Luft am Käfig regelmäßig, um f fördernemales für die Fütterung.
  12. Lassen Sie die Mücken ernähren ca. 30 min. Nach Zuführung abgeschlossen ist, schalten Sie das Heizelement, nehmen die Anleger aus und schneidet den Parafilm. Weichen Sie die Zuführung in Bleichlösung etwa 5 Minuten und spülen Sie gut in VE-Wasser.
  13. Entfernen Sie die Feeder und legte Watte mit Zuckerwasser auf den Käfigen für 48 Stunden. Ein Eierspeise Wasser und Filterpapier, das in den Käfigen über Nacht auf die Eiablage zu erleichtern. Beschriften Sie jedes Eierspeise mit der jeweiligen Test- oder Kontroll Konzentration.
  14. Entfernen Sie die Eierspeise nächsten Tag und untersuchen Sie die Anzahl und Struktur der Eier unter einem Stereomikroskop. Besorgen Sie Bilder mit der Q-colors5 Software. Die Anzahl der Eier. Analysieren Unterschied in der Anzahl von Eiern von Test- und Kontrollkäfigen erhalten.
    HINWEIS: Ein ungepaarter t-Test kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Zahl der Eier signifikant unterschiedlich (p ≤0.05) gestellt sind.

3. Biochemische Assay von Mosquito Enzyme Inhibitionvon Drug

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Enzym-Aktivitätstest unter Verwendung von DTNB als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen.

  1. Vorbereiten einer 0,1 M Na 2 HPO 4 (dibasisches Natriumphosphat) Lösung durch Zugabe von 14,19 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O. Als nächstes bereiten eine 0,1 M NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat) Lösung durch Zugabe von 13,79 g NaH 2 PO 4 zu 1 l dH 2 O.
  2. Daraufhin wird die 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung mit 0,1 M NaH 2 PO 4 -Lösung auf pH 8,5.
    Hinweis: das wird die Arbeitsstammlösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) sein.
  3. Vorbereiten einer Homogenisierung Lösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) durch Zugabe von 0,3% Triton X-100.
    HINWEIS: Die Homogenisierung Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden
  4. Prepare ein 1,6 mM SAH (MW = 384,4) durch Auflösen von 6,15 mg von SAH in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  5. Vorbereiten einer 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) durch Auflösen von 6,3 mg DTNB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Halten Sie die frische DTNB-Lösung auf Eis bis zum Gebrauch.
  6. Bereiten Sie eine 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) durch Lösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O Weiter verdünnt man das 1 mM DZNep Lösung in einer Reihe von Konzentrationen von 1,000 & mgr; M bis 0,002 & mgr; M in dH 2 O.
  7. Um die SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep messen, bereiten eine Rohenzymextrakt Mücken: homogenisieren 10 Nicht-Blut-fed erwachsenen Mücken in 1 ml eiskaltem 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), das 0,3% Triton X- 100, mit einem Glas Gewebehomogenisator. Übertragen Sie das Homogenat zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Zentrifugieren des Homogenats für 5 Minuten bei 10.000 × g bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden der Überstand als Enzymquelle für die SAH biochemischen Assays.
  9. Für die Blindbehandlung (dh keine DZNep kein Enzym) werden 50 & mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, und 100 & mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) auf die einzelnen Vertiefungen einer 96-well, Flachboden-Mikrotiterplatte.
  10. Für die Kontrolle (dh, kein DZNep) werden 50 & mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 & mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) und 50 ul Enzym (SAH Hydrolase aus Rohextrakt) erhaltenen Individuums Brunnen.
  11. Für DZNep Behandlungen, fügen Sie 50 ul 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 ul Enzym und 50 ul ausgewählt DZNep Konzentration auf einzelne Vertiefungen. Bereiten Sie 4 Wiederholungen pro Behandlung und Kontrolle.
  12. Lesen der optischen Dichte (OD) der SAH Enzymproben bei 405 nm für 5 Minuten bei 20 s Intervallen unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät.
  13. Die OD des Leer OD von Steuer einnd Behandlung OD von jedem erhalten gut. Berechnen der verbleibenden SAH-Hydrolase-Aktivität unter Verwendung der folgenden Gleichung Prozent:% Restaktivität = (OD Behandlung / Kontrolle OD) × 100.

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Ergebnisse

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Assays; es die verschiedenen Schritte des in diesem Artikel genannten Verfahren beschreibt. Da das Protokoll auf die verschiedenen Lebensstadien Mücken basiert, gibt es keine besondere Reihenfolge für die Experimente detailliert hier folgen. Der Benutzer kann wählen, einen oder mehrere Assays gleichzeitig durchzuführen, je nach Proben Verfügbarkeit.

Abbildung 2 zeigt die für den unreifen Moskitos Entwicklu...

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Diskussion

Es gibt mehrere Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Für die Larventest sollte darauf geachtet werden, um korrekt zu kennzeichnen und zu replizieren jede Testkonzentration werden. Randomisierung von Proben und das Hinzufügen der benannten Menge des Arzneimittels an die jeweiligen Testbrunnen ist ein wichtiger Teil dieser Versuchsanordnung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium von Moskitolarven in eine 96-Well-Mikroplatte, kann jede Larve auf einem Papiertuch für 2-3 sec gesetzt, um übersc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Victor Marquez für die Bereitstellung von DZNep.HCl und Scotty Bolling für die Herstellung der Bluternähren. Die Mopti- und SUA2La-Stämme von An. gambiae wurden vom Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) bezogen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Fralin Life Science Institute und das Stipendium der National Institutes of Health 1R21AI094289 an Igor V. Sharakhov.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-MikroplatteFisher Scientific12565561
ZellkulturplatteCytoOneCC7682-7506
ZentrifugeSorvall Fresco76003758Es kann eine andere Zentrifuge verwendet werden
Farbige BandrollenFisherS68134
DissektionsmikroskopOlympusSZ
DTNBSigma AldrichD8130
DZNep.HClSigma AldrichSMLO305
Eierschalenbecher
FilterpapiereFisher09-795E
Glas-FeederVirginia Tech
Glasgewebe-Homogenisator
HeizelementFisher ScientificNC0520091
InkubatorPercival wissenschaftlicheI36VLC8Es kann ein anderer Inkubator verwendet werden
Mikrozentrifugenröhrchen, 2  mlAxygen22-283
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5  mlAxygenMCT-150-C
MikropipetteEppendorf4910 000.069
Na2HPO4Fisher ScientificM-3154
NaH2PO4FisherScientific M-8643
pH-Messgerät Mettler Toledo 7easyS20
Plate ReaderSpectramaxM2
SAHSigma AldrichA9384Store at -20 ° C
Triton X-100Sigma AldrichT8787

Referenzen

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