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Schnell Fluorescent In-situ- Hybridisierung Protokoll für Xist-RNA in Kombination mit Immunfluoreszenz von Histonmodifikationen in X-Chromosom-Inaktivierung

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DOI:

10.3791/52053

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26. November 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben ein leicht anpassbares strangspezifisches Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokoll (FISH) in Kombination mit Immunfluoreszenz entwickelt. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der RNA-Dynamik bei gleichzeitigem Einblick in die Chromatinstruktur, die Kernorganisation und die Transkriptionsregulation auf Einzelzellebene.

Zusammenfassung

Kombinieren RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit Immunfluoreszenz (Immuno-FISH) schafft eine Technik, die auf der Ebene einzelner Zellen verwendet werden können, um die räumliche Dynamik RNA Lokalisierung mit gleichzeitige Einblick in die Lokalisierung von Proteinen, epigenetische Modifikationen und andere Details zu detektieren die durch Immunfluoreszenz markiert werden kann. X-Chromosom-Inaktivierung ist ein Paradigma für lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) vermittelte Gen-Silencing. X-inaktiven spezifischen Transkripts (Xist) lncRNA Ansammlung (genannt Xist Wolke) an einem der beiden X-Chromosomen in weiblichen Säugern ist ein kritischer Schritt, um X-Chromosom Inaktivierung initiieren. Xist-RNA direkt oder indirekt in Wechselwirkung mit verschiedenen Chromatin-modifizierende Enzyme und stellt verschiedene epigenetischen Landschaften in den inaktiven X-Chromosom (Xi). Eine bekannte epigenetischen Kennzeichen der Xi ist der Histone H3 trimethyl-Lysin-27 (H3K27me3) Änderung. Hier haben wir eine einfache und schnelle Immun FISH beschreibenProtokoll zum Nachweis von Xist-RNA mit RNA-FISH mit mehreren Oligonukleotid-Sonden in Verbindung mit Immunfluoreszenz von H3K27me3, um die Lokalisierung von Xist-RNA und die damit verbundenen epigenetische Veränderungen zu untersuchen. Verwendung von Oligonucleotidsonden zu einer kürzeren Inkubationszeit und empfindlicher Nachweis von Xist RNA im Vergleich zu in vitro transkribierte RNA-Sonden (Ribosonden). Dieses Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für das Verständnis der Dynamik von lncRNAs und die damit verbundenen epigenetische Modifikation der Chromatinstruktur, Kern Organisation und Transkriptionsregulation.

Einleitung

Säugetier X-Chromosom Inaktivierung (XCI) ist eine Strategie, um die Unwucht in X-verknüpften Gens Dosis zwischen XX und XY, wobei eines der beiden X-Chromosomen in Weibchen transkriptionell inaktivierten 1 kompensieren. X-Chromosom-Inaktivierung ist eine große Modellsystem für lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) Forschung. X-Chromosom-Inaktivierung von mehreren lncRNAs geregelt und wurde ausgiebig in den letzten Jahrzehnten untersucht, um die Übersprechmechanismen zwischen lncRNAs, Transkription, Chromatinstruktur und Kernorganisation 2, 3 aufzudecken.

Die X-Inaktivierung Zentrum (XIC) auf dem X-Chromosom lokalisiert ist eine komplexe genetische Locus einer Reihe von Genen, die Herstellung nicht-kodierenden RNAs 4 besteht. X-inaktiv spezifische Transkript (Xist) lncRNA in eutherian Säugetieren ist eine solche lncRNA, die eine entscheidende Rolle bei der X-Chromosom-Inaktivierung 5,6 spielt. Xist Transkripte umgeben den Ort der futur Xi bis X-Chromosom-Inaktivierung zu initiieren, und erscheinen wie eine Wolke, wenn visualisiert mittels RNA FISH; Diese Formation wird als "Xist Cloud" 7 bezeichnet. Seit Xist-RNA interagiert mit verschiedenen Chromatin-modifizierende Enzyme, wird Co-Lokalisation der Xist Wolken mit verschiedenen epigenetische Modifikationen für stille Chromatin und repressive Transkription während X-Chromosom Inaktivierung 8 beobachtet. Beispielsweise interagiert Xist-RNA mit polycomb repressive komplexen 2 (PRC2), die für H3K27me3 verantwortlich ist und induziert eine repressive Chromatin Zustand 9. Das Auftreten der Xist Wolke am Xi und seine Co-Lokalisierung mit der intensiven H3K27me3 Änderung stellt eine fakultative Heterochromatin Landschaft des Xi 10,11.

Zytogenetischen Techniken, wie DNA / RNA-FISH haben einen langen Weg von der traditionellen Methode mit radioaktiv markierten Sonden 12 auf die jüngsten und modernsten Techniken mit verbesserter Empfindlichkeit und kommenFluoreszenz-Bildgebung mit mehreren Oligonukleotidsonden 13,14. DNA / RNA-FISH in Verbindung mit Immunfluoreszenz wurde routinemäßig als zytologische Werkzeug benutzt, um Raum-Zeit-Atom-Organisation, RNA-Lokalisierung, Chromatinstruktur und Modifikationen zu verstehen. Die Standardsonde Vorbereitung RNA FISH beinhaltet die Verwendung von Plasmid oder bakteriellen künstlichen Chromosoms (BAC) Klonen und deren anschließende Markierung entweder mit Nick-Translation oder Random-Priming-15. Fast 70% der Gene in Mäusen und 40% der Gene in Menschen zeigen jedoch eine Überlappung von Sense- und Antisense-Transkripte 16, daher um Sense- und Antisense-Transkripte unterscheidet die eine strangspezifische FISH-Verfahren. In vitro transkribierte RNA-Sonden (Ribosonde ) werden oft für strangspezifischen RNA-FISH 17,18 verwendet; Dies ist jedoch mit Herstellung eines Plasmid-Klon oder PCR-Produkt mit T7, SP6 oder T3-Promotor und Synthetisieren Ribosonden. Außerdem Ribosonden von genom abgeleitetic DNA oder cDNA enthalten oft unspezifische Regionen und repetitiven Elementen, was zu hohen Hintergrundgeräuschen führen. Ein weiteres Problem ist, dass Ribosonden, die einige hundert Nukleotide lang sind, und enthalten mehrere Fluorophore, nicht effizient in den Zellkern einzudringen. Um dies zu umgehen, wurden mehrere kürzere Oligonukleotidsonden mit einem einzigen Fluorophor am Ende markierten entwickelt worden, die eine gute Empfindlichkeit, einheitliche Signalstärke und der Leichtigkeit der Reinigung und Handhabung von 14 haben. Darüber hinaus sind DNA-Oligonukleotide in der Regel stabiler als RNA. Wir verwendeten eine ähnliche Strategie unter Verwendung von Oligonukleotiden in Xist RNA FISH 19 mit Immunfluoreszenz die epigenetische Dynamik des Xi durch Xist lncRNA während des Prozesses der X-Chromosom Inaktivierung induziert verstehen. Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung von Oligonukleotid-Sonden und die richtige Vorbereitung der Zellen, sowie die Verwertung von Immunfluoreszenz und RNA-FISH. Xist-RNA-FISH mit mehreren oligonucleotides ist kostensparenden Lösung in den langfristigen, wenn Xist RNA FISH wird routinemäßig in einem Labor durchgeführt wird. Diese Technik kann verwendet werden, um lncRNAs in Zellen zu identifizieren und gleichzeitig die Abbildung ihrer Co-Lokalisierung mit epigenetische Modifikationen oder Faktoren werden. Ein großer Vorteil des Protokolls ist die Fähigkeit, leicht zu modifizieren, seine Forschungsinteressen gerecht zu werden.

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Protokoll

1. Probe Vorbereitung

  1. Erhalten mehrere einzigartige Oligonukleotide in Xist (20-30 Nukleotide Länge Oligonukleotide, 63-65 ° C Schmelztemperatur, Tabelle 1) mit einem 5'-Amino Änderung und Aussetzung im Wasser.
  2. Pool äquimolare Mengen von Oligonukleotiden mit 5'-Amino-Modifikation (insgesamt 4,5 ug) und Etikett mit aminreaktiven fluoreszierenden Farbstoff nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Lösen Sie den gepoolten Oligonukleotide in letzten 5 ul Nuklease-freies Wasser und fügen Sie 3 ul 1 M Natriumbicarbonat mit dem Oligonukleotid-Lösung.
    2. Add 2 ul DMSO in das Fläschchen mit aminreaktiven Farbstoff und kurz vortexen.
    3. Mischen Sie die Oligonucleotidlösung mit dem Reaktivfarbstoff in DMSO und Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln.
  3. Reinige den fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden durch G-25-Säule, gefolgt von Ethanolfällung.
    1. Centrifuge G-25-Säule bei 750 g für 1 min, um überschüssige Pufferspeicher zu entfernen.
    2. In 40 ul Nuklease-freies Wasser auf die in Schritt 1.2.3 hergestellten Markierungsmischung und gelten für die Spalte G-25. Zentrifuge bei 750 × g für 2 min.
    3. Dann werden 50 & mgr; l Nuklease-freies Wasser, 10 & mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 250 & mgr; l Ethanol zu der gereinigten Probe aus Schritt 1.3.2. Bei -80 ° C für 30 Minuten und Zentrifugation bei 21.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
    4. Einmal mit 1 ml 70% Ethanol waschen fällt Oligonukleotide.
    5. Re-suspendieren in 50 & mgr; l Nuklease-freies Wasser oder TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) bei einer Endkonzentration von etwa 10 uM.
  4. Verdünne die fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden zu einer Endkonzentration von 250 nM mit Hybridisierungspuffer (10% Formamid; 2 × SSC [300 mM NaCl, 30 mM Natriumcitrat]; 2 mg / ml BSA; 10% Dextransulfat).
    HINWEIS: Mit dieser schnellen FISH-Protokoll, Oligonukleotid-pRoben Xist wurden entworfen und in einer höheren Konzentration als die normale FISH Protokoll unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, um die Inkubationszeit für die Hybridisierung verwendet verkürzen.

2. Schieben Vorbereitung

HINWEIS: Die Objektträger für Immun FISH mit embryonalen Stammzellen der Maus (ES) oder Embryoidkörper (EB) vorbereitet werden differenzierenden Zellen 20, 21 entweder durch den Anbau von ihnen direkt auf einem Polylysin behandelten Folie oder mit Cytospin mit Zellsuspension. Hier wird durch Cytospin-Präparat gezeigt.

  1. Absaugen Kulturmedium in einer 6-Napf-Schale. Mit PBS (Raumtemperatur), und saugen Sie gründlich waschen.
  2. 0,5 ml Trypsin in den 6-Well-Platte, Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C.
  3. 5 ml Medium und zerstreuen Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mehrmals.
  4. Übertragungszellen in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 × g bei Raumtemperatur.
  5. Entsorgen Sie das Medium eind sanft die Zellen in 2 ml PBS.
  6. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers und verdünnte Zellsuspension bei 4 x 10 5 Zellen / ml mit PBS.
  7. Bauen Sie eine Diashow, einen Filter-Karte und eine Kammer mit einem Clip und legen Sie sie in die entsprechenden Schlitze in dem Rotor der Cytospin. Fügen Sie 250 ul jeder Probe in Schritt 2.6 in jede Kammer der Baugruppen in der Cytospin vorbereitet. Zentrifuge bei 1.500 Upm für 10 min bei Raumtemperatur.
  8. Füllen 3 Coplin Gläser auf Eis mit 40 ml eiskaltem PBS, CSK-Puffer (10 mM PIPES, pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose; 3 mM MgCl 2) und CSKT Puffer (CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100), jeweils.
  9. Nachdem der Cytospin beendet ist, die Folie schnell in eiskaltem PBS übertragen und Inkubation für 5 min.
  10. Die Objektträger in eiskaltes CSK Puffer und Inkubation für 1 min.
  11. Die Objektträger in eiskaltes CSKT Puffer und Inkubation für 5 min.
  12. Die Objektträger wieder in eiskaltes CSK buffer und Inkubation für 1 min.
  13. Die Objektträger in 4% Paraformaldehyd in PBS und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.

3. Immunfluoreszenz

  1. Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit PBST (1x PBS mit 0,1% Tween-20) für mehrere Sekunden.
  2. Legen Sie die Dias schräg so dass Restpuffer zu fließen auf der Rutsche. Wischen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit aus der Folie und legen Sie sie in einem leeren Pipettenspitzen-Box mit Wasser. Überlagern Sie die Folie mit 40 ul Blockierungslösung (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), sanft legen Sie eine Deckglas, und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie das Deckglas, entfernen Sie die Blockierungslösung, und fügen Sie 40 ul der Histone H3K27me3 primären Antikörpers zu einer Konzentration von 1: 500 verdünnt in Blockierungslösung. Legen Sie das Deckglas wieder auf der Folie und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Ein RNase-Inhibitor in der Blockierungslösung könnte hilfreich sein, um RNA in dieser RNA FIS erhaltenH-Protokoll bei polyklonalen Antikörpern eingesetzt werden.
  4. Wash schieben 2 mal in Coplin Gläser mit PBST gefüllt, je 5 Minuten, leichtes Schütteln beim Waschen.
  5. Legen Sie die Dias schräg so dass Restpuffer zu fließen auf der Rutsche. Wischen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Folie wieder in die Spitze ein. Overlay mit 40 ul des sekundären Antikörpers (1: 500) in Blocking-Lösung verdünnt, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 15 min im Dunkeln. Für die folgenden Schritte, halten Sie die Folie in der Dunkelheit zu allen Zeiten.
  6. In Färbetrog mit PBST, wie in Schritt 3.4 Waschen Sie 2 mal.

4. RNA-FISH mit Oligonukleotidsonden

  1. Pre-Aufwärmen eine leere Pipettenspitzen-Box mit Wasser auf dem Boden, um Folien aus dem Trocknen bei 37 ° C für die RNA-FISH in Schritt 4.3 zu verhindern.
  2. Legen Sie die Dias schräg so dass Restpuffer zu fließen auf der Rutsche. Wischen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit aus der Folie aus Schritt 3.6 und platzieren Sie die Folie in der Pipettenspitzen-Box mit water an der Unterseite. Gib 500 ul FISH Waschpuffer (10% Formamid in 2 × SSC) auf dem Objektträger, Inkubation 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen FISH Waschlösung, fügen 8 ul von Oligonukleotid-Sonden auf dem Objektträger, legen Sie ein Deckglas, und übertragen Sie die Folie in eine vorgewärmte Pipettenspitzen-Box mit Wasser auf dem Boden; Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 Std.
  4. Platz 3 vorgewärmt Coplin-Glaszylinder in einem Wasserbad bei 37 ° C mit FISH Waschpuffer, FISH Waschpuffer mit DAPI und 2 × SSC.
  5. Nach 1-2 h Inkubation für RNA FISH, setzen Sie den Schieber in die vorgewärmte FISH Waschpuffer.
  6. Inkubieren für ein paar Minuten, bis die Deck fällt der Folie.
  7. Den Objektträger wieder in die Waschpuffer, und weiter Inkubation für 5 min.
  8. Die Objektträger in einem anderen Coplin-Gefäß mit vorgewärmter FISH Waschpuffer mit 0,5 ng / ml DAPI und Inkubation für 5 min.
  9. Die Objektträger in einem anderen Coplin Glas mit vorgewärmten 2x SSC und Inkubation für 5 min.
  10. Legen Sie die Dias schräg so dass Restpuffer zu fließen auf der Rutsche. Wischen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Rückfall in einem trockenen Spitze Box. In 4 ul Antifade mit DAPI auf den Objektträger und setzen Sie ein Deckglas.
  11. Deckglasränder mit Nagellack und beobachten unter dem Mikroskop. Der Schieber kann bei 4 ° C im Dunkeln für einige Monate gelagert werden.

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Ergebnisse

Repräsentative Bilder der schnellen Immun FISH in 1A gezeigt. Co-Lokalisation der Xist RNA Wolke und H3K27me3 Signal auf dem Xi in differen weiblichen Zellen nachgewiesen. Am Tag 12 nach Differenzierung, mehr als 90% des EB-Zellen hatte eine Xist Wolke (1B). (; 150 97%, n = 1C) kurze Oligonucleotidsonden effizient in den Zellkern durchdrungen wird, was zu einer Visualisierung mit Xist RNA fast alle H3K27me3 Signale kolokalisiert.

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Diskussion

In diesem Papier haben wir eine schnelle Immun FISH-Protokoll, das weniger als 5 Stunden dauert, Präparat, Xist-RNA FISH und Immunfluoreszenz für H3K27me3 abzuschließen präsentiert. Im Vergleich mit der allgemeinen Immun FISH Ansatz für Xist-RNA-Erkennung, die in der Regel braucht Inkubation über Nacht für die RNA-FISH, dieses Protokoll nicht nur deutlich reduziert Zeitaufwand, sondern verbessert auch die Empfindlichkeit der Immun-FISH mit Oligonukleotid-Sonden.

Seit Xist ist hoch während X-...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Wir danken Hongjae Sunwoo für hilfreiche Ratschläge zum Oligonukleotiddesign in RNA FISH. Wir danken auch Serenity Curtis für die Bearbeitung des Manuskripts. N.Y. wurde durch ein Postdoctoral Fellowship for Research Abroad der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt von den NIH (RO1-GM102184), der March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337) und dem Developmental Fund and Trustee Grant am Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Oligonukleotide mit 5'-Amino-ModifikationIDT
Alexa Fluor 488 Reactive DyeLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 SäulenGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Rinderserumalbumin, Molecular Biology Grade (für Hybridisierungspuffer)Roche
Histon H3K27me3 AntikörperActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Maus, stark kreuzadsorbiertLife TechnologiesA21424
ProLong Gold Antifading-ReagenzLife TechnologiesP36931
10715859103

Referenzen

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Histon H3K27me3Oligonukleotid SondenEmbryoid Body ZellenCytospin Pr parationFluoreszenzmikroskopieepigenetische Modifikation

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