Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen.
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Methodenartikel
Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in Xenopus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Xenopus ist zu einem wichtigen Werkzeug für sezieren die Mechanismen für kraniofaziale Entwicklung und Defekten. Ein Verfahren zur orofazialen Entwicklung quantifizieren für strengere Analyse der orofazialen Phänotypen auf Aufhebung mit Substanzen, die die Genexpression oder Proteinfunktion genetisch oder molekular manipulieren lassen. Mit zweidimensionalen Bilder der embryonalen Köpfe werden traditionelle Größendimensionen-wie orofazialen Breite, Höhe und Raum- gemessen. Zusätzlich ist ein Maß für die Rundheit embryonalen Mundöffnung verwendet, um die Form des Mundes zu beschreiben. Geometrische Morphometrie dieser zweidimensionalen Bildern wird auch durchgeführt, um eine anspruchsvollere Ansicht von Änderungen in der Form des orofacial Region. Wahrzeichen sind an bestimmten Stellen im orofazialen Region zugeordnet und Koordinaten erstellt. Eine Hauptkomponentenanalyse wird verwendet, um Wahrzeichen Koordinaten Hauptkomponenten, die dann zu unterscheiden, die Behandlung zu verringernGruppen. Diese Ergebnisse werden als Streudiagramm, in dem Personen mit ähnlichen orofazialen Formen zusammenballen angezeigt. Es ist auch nützlich, eine Diskriminanzanalyse, die die Positionen der Landmarken zwischen zwei Behandlungsgruppen statistisch verglichen zuführen. Diese Analyse basiert auf einer Transformationsnetz, wo Änderungen in Markierungsposition werden als Vektoren betrachtet angezeigt. Ein Raster ist auf dieser Vektoren, so dass ein Verziehen Muster angezeigt, um zu zeigen, wo signifikante Landmarkenpositionen geändert haben überlagert. Formänderungen in der Diskriminanzanalyse auf einem statistischen Maß basiert, und kann daher von einem p-Wert berechnet werden. Diese Analyse ist einfach und zugänglich, nur ein Stereoskop und Freeware-Software erfordern, und somit ein wertvoller Forschung und Lehre Ressource sein.
Einleitung
Unter den am weitesten verbreiteten und auch schwerwiegendsten Form der menschlichen Geburtsfehler sind diejenigen den Mund und Gesicht, zu beeinflussen, wie Gesichtsspalten ein. Kinder mit missgebildeten orofazialen Strukturen durchlaufen mehrere Operationen über deren gesamte Lebensdauer und Kampf mit Gesichtsanomalien, Sprache, Gehör und Essstörungen. Deshalb werden neue Forschung in cranio und orofazialen Entwicklung erleichtert ist ausschlaggebend für die Vorbeugung und Behandlung dieser Art von Geburtsschäden beim Menschen. Xenopus laevis wurde als neues Werkzeug zum Präparieren der Mechanismen, die kraniofazialen Entwicklung entstanden (ein....
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Protokoll
Alle Experimente unter Verwendung von Xenopus laevis wurden von IACUC (Protokoll # AD20261) genehmigt worden.
1. Vorbereiten Reagenzien und benötigte Materialien
- Reagenzien:
- Machen 1 l 10x MBS (Modified Barths Saline) Lösung 22. Hinzufügen NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) und NaHCO 3 (25 mM) zu 1 l destilliertem Wasser. Einstellen des pH auf 7,8 mit NaOH.
- Auffüllen auf 1 l 1x MBS durch Verdünnen von 100 ml des 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl 2 -Lösung.
- Auffüllen auf 1 l....
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Ergebnisse
Hier wird eine quantitative Analyse der orofacial Größe und Form wurde gezeigt, Embryonen mit einem Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor (RAR-Inhibitor) zu unbehandelten Kontrollen behandelt vergleichen. Embryonen wurden mit einer 1 & mgr; M Konzentration dieser chemischen Inhibitor von Stufe 24 bis 30 (26-35 HPF) behandelt, ausgewaschen und in Stufe 42 (82 hpf) befestigt ist. Sie wurden dann verarbeitet und analysiert, wie in dem Protokoll beschrieben. Ergebnisse sind Originaldaten, aber im Einklang mit Beobachtungen in f.......
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Diskussion
Xenopus laevis hat sich zu einem nützlichen Werkzeug für Sezieren der Entwicklungsmechanismen zugrunde liegenden orofazialen Entwicklung; Allerdings gibt es noch keine Protokolle Größe und Form Veränderungen dieser Region bei Fröschen beschreibt. Die hier beschriebene Methode wird erheblich auf das Gebiet der orofazialen Entwicklung, indem sie für eine strengere Quantifizierung der orofazialen Phänotypen in Xenopus und anderen Wirbeltieren beitragen.
Die erste, kritischer A.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Start-up-Gelder an A. Dickinson von VCU unterstützt diese Arbeit.
Die Autoren möchten sich Dan Nacu für sein künstlerisches Talent bei der Erstellung der schematischen Darstellung zu bestätigen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Präpariermikroskop | Zeiss | mit AxioCamICC1 Kamera | |
| Dumont #5 Inox-Pinzette | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Steriles Einweg-Skalpell | Sklar | 06-2015 | |
| 24-Well-Platte | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Einweg-Transferpipetten | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petrischalen | Falcon | 351058 | |
| Inkubatoren | Ectotherm | Set auf 15 > C oder 20 &Grad; C | |
| Modelliermasse | Premo oder eine andere ungiftige Modelliermasse | in schwarz oder weiß | |
| Gerade Nadel | Thermo Scientific | 19010 | |
| Kapillarschlauch (für Nadeln) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm AD x 0,5 mm ID/Faser, je 100 mm |
| Nadelabzieher, Modell P-97 | Sutter Instrument Co. | Nadelabzieher: P-97 Flaming/ Bown Mikropipettenabzieher Filament: FB300B | Verwenden Sie für Filamente Sutter 3,00 mm quadratische Box-Filamente, 3,0 mm breit. |
| Pipettierer | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cystein | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyd Pulver | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petrischalen | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm Durchmesser und 150 mm Durchmesser |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
Referenzen
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012). <....
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Nachdrucke und Genehmigungen
