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Methodenartikel

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in Xenopus

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DOI:

10.3791/52062

⸱

6. November 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Xenopus ist zu einem wichtigen Werkzeug für sezieren die Mechanismen für kraniofaziale Entwicklung und Defekten. Ein Verfahren zur orofazialen Entwicklung quantifizieren für strengere Analyse der orofazialen Phänotypen auf Aufhebung mit Substanzen, die die Genexpression oder Proteinfunktion genetisch oder molekular manipulieren lassen. Mit zweidimensionalen Bilder der embryonalen Köpfe werden traditionelle Größendimensionen-wie orofazialen Breite, Höhe und Raum- gemessen. Zusätzlich ist ein Maß für die Rundheit embryonalen Mundöffnung verwendet, um die Form des Mundes zu beschreiben. Geometrische Morphometrie dieser zweidimensionalen Bildern wird auch durchgeführt, um eine anspruchsvollere Ansicht von Änderungen in der Form des orofacial Region. Wahrzeichen sind an bestimmten Stellen im orofazialen Region zugeordnet und Koordinaten erstellt. Eine Hauptkomponentenanalyse wird verwendet, um Wahrzeichen Koordinaten Hauptkomponenten, die dann zu unterscheiden, die Behandlung zu verringernGruppen. Diese Ergebnisse werden als Streudiagramm, in dem Personen mit ähnlichen orofazialen Formen zusammenballen angezeigt. Es ist auch nützlich, eine Diskriminanzanalyse, die die Positionen der Landmarken zwischen zwei Behandlungsgruppen statistisch verglichen zuführen. Diese Analyse basiert auf einer Transformationsnetz, wo Änderungen in Markierungsposition werden als Vektoren betrachtet angezeigt. Ein Raster ist auf dieser Vektoren, so dass ein Verziehen Muster angezeigt, um zu zeigen, wo signifikante Landmarkenpositionen geändert haben überlagert. Formänderungen in der Diskriminanzanalyse auf einem statistischen Maß basiert, und kann daher von einem p-Wert berechnet werden. Diese Analyse ist einfach und zugänglich, nur ein Stereoskop und Freeware-Software erfordern, und somit ein wertvoller Forschung und Lehre Ressource sein.

Einleitung

Unter den am weitesten verbreiteten und auch schwerwiegendsten Form der menschlichen Geburtsfehler sind diejenigen den Mund und Gesicht, zu beeinflussen, wie Gesichtsspalten ein. Kinder mit missgebildeten orofazialen Strukturen durchlaufen mehrere Operationen über deren gesamte Lebensdauer und Kampf mit Gesichtsanomalien, Sprache, Gehör und Essstörungen. Deshalb werden neue Forschung in cranio und orofazialen Entwicklung erleichtert ist ausschlaggebend für die Vorbeugung und Behandlung dieser Art von Geburtsschäden beim Menschen. Xenopus laevis wurde als neues Werkzeug zum Präparieren der Mechanismen, die kraniofazialen Entwicklung entstanden (einige Beispiele sind 2,3,4 -11). Daher könnte eine quantitative Methode, um Größe und Form Veränderungen während der Entwicklung des Kopfes und Gesicht dieser Art zu analysieren sehr leistungsfähige 3 sein.

Hier stellen wir ein solches Verfahren; Kombination von traditionellen Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie von einer Xenopus-Studie 12 angepasst und eine Fülle von Studien zur Analyse menschlichen Gesichtsform 13-15. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Forschern ermöglichen, Gesichts Größen und Formen zu quantifizieren, um zwischen verschiedenen orofazialen Phänotypen während der normalen und abnormalen Entwicklung unterscheiden. Diese Analyse wird zur besseren Unterscheidung zwischen subtilen kraniofazialen Defekten wie solche aus synergistische Wirkung von Genen und / oder Umweltfaktoren. Darüber hinaus könnte diese Quantifizierungsmethode auch zeigen sogar leichte Verbesserung oder Rettung eines orofazialen Defekt. Dies macht es zu einem nützlichen Leitfaden bei der Analyse potenzielle Therapeutika daher.

Die Kombination aus Gesichts Messungen und geometrische Morphometrie, die wir hier präsentieren, ermöglicht eine umfassende statistische Analyse der Größe und Form des orofazialen Region als aktuellen Protokolle, die weitgehend nutzen nur eine oder die andere von 15 bis 18. Weiterhin stellen wir eine einfache Möglichkeit, sowohl den medialen und lateralen Ebenen beurteilendas Gesicht ohne aufwändige dreidimensionale bildgebende Geräte in aktuellen Studien 13,19 verwendet erfordern.

Wir zeigen, dass dieses Protokoll über Xenopus laevis Embryonen mit einer Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor, abnormen orofazialen Entwicklung und eine mediane Gaumenspalte 2,3 induziert behandelt. Quantifizierung der Abmessungen und der Form des orofacial Region in diesen Embryonen wurde Veränderungen im Mittelgesicht, die analog zu den Menschen mit ähnlichen Gaumenspalten und Mausmodellen 20,21 ist offenbart. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von anderen Verbindungen auf orofacial Entwicklung, wie natürliche Stoffe, Herbizide, oder Proteinen, wie Wachstumsfaktoren zu beurteilen. Ferner orofazialen Größe und Form Veränderungen aus Störung der Genexpression über Verlust oder Gewinn von Funktionsversuchen (mit Antisense-Morpholinos oder Crispers / Talens) kann auch mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Schließlich diese Methode specifica entwickelten wirlly zu Xenopus Morphologie zu bewerten; es ist jedoch einfach für die Analyse von jedem Wirbeltier modifiziert. Andere Anwendungen könnten auch unter Verwendung dieses Protokolls für den Vergleich nahe verwandter Arten für evolutionäre oder ökologische Studien. Während das Beispiel stellen wir hier nutzt dieses Protokoll, um Analyse der orofazialen Region zu beschreiben, könnte es leicht für die Analyse von anderen Regionen, Organe oder Strukturen verändert werden.

Diese orofazialen Quantifizierung Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Forschungsgemeinschaft sowie ein ausgezeichnetes Lehrmittel für Studenten als Video-Demonstration geworden.

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Protokoll

Alle Experimente unter Verwendung von Xenopus laevis wurden von IACUC (Protokoll # AD20261) genehmigt worden.

1. Vorbereiten Reagenzien und benötigte Materialien

  1. Reagenzien:
    1. Machen 1 l 10x MBS (Modified Barths Saline) Lösung 22. Hinzufügen NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) und NaHCO 3 (25 mM) zu 1 l destilliertem Wasser. Einstellen des pH auf 7,8 mit NaOH.
    2. Auffüllen auf 1 l 1x MBS durch Verdünnen von 100 ml des 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl 2 -Lösung.
    3. Auffüllen auf 1 l 0,1 × MBS durch Verdünnen von 100 ml 1x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser. Um 1 l 0,1x MBS-Lösung, 1 ml 10 mg / ml Gentamicin-Lösung für den Einsatz in Embryokultur.
    4. Stellen hohe Salz MBS durch Auflösen von 4 ml 5 M NaCl in 100 ml 10x MBS. Dann fügen destilliertem Wasser bis Gesamtvolumen beträgt 1 L.
    5. Machen 70% Ethanol durch Verdünnen von 100% eTHANOL zu 70% Ethanol unter Verwendung von destilliertem Wasser.
    6. Machen BMS-543 durch Herstellung einer 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO).
    7. Machen 4% Paraformaldehyd (PFA) durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd-Pulver zu 50 ml destilliertem Wasser. Hitze auf einer Heizplatte auf ca. 65 ° C, an welcher Stelle mit 5 M NaOH tropfenweise, bis die Lösung löscht.
      1. Sobald die Lösung löscht, vom Herd nehmen und 50 ml 2x PBS und 100 ul Tween-20. Lasse auf RT auf Eis kühlen. PH-Wert auf zwischen 7,2 und 7,5 mit HCl.
    8. Einen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween (PBT), die durch Lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml destilliertem Wasser. Mit HCl, pH-Einstellung auf 7,4. 2 ml Tween-20. Passen Endvolumen mit destilliertem Wasser auf gleich 1 L.
    9. Machen Sie eine Cystein-Lösung durch Auflösen von 1 g Cystein in 50 ml destilliertem Wasser oder 0,1x MBS. In 1,5 ml 5 M NaOH einnd stellen Sie den pH-Wert auf 7,8.
    10. Einen 10% Benzocain Stammlösung durch Zugabe von 10 g Benzocain Pulver auf 100 ml 100% EtOH. Für die Euthanasie der erwachsenen Männer und Embryonen bereit Fixierung, zu verdünnen, um eine 0,05% ige Lösung.
    11. Einen Hoden Speicherlösung durch Zugabe von 1 ml Kälberserum zu 9 ml L15 Puffer.
  2. Erforderliche Werkzeuge und Hilfsmittel:
    1. Besorgen Sie sich die in der Tabelle der Materialien und Geräte aufgeführten Geräte, in Abbildung 1 dargestellt.
    2. Ändern einer Pipettenwerkzeug. Setzen Sie die Spitze einer Glaspasteurpipette in eine Flamme aus einem Bunsenbrenner. Drehen Sie die Pipettenspitze, bis es schmilzt und bildet eine abgerundete abgedichteten Ende.
    3. Flatten Knetmasse in den Boden einer Petrischale aus Kunststoff, glätten, um die gesamte Platte abdecken (jeglicher Größe eingesetzt werden können) (Abbildung 1Aiv).
      1. Drücken Sie leicht eine gerade teasing Nadel in den Lehm ausgekleideten Schale bei 45 ° -Winkel. Halten Sie die Nadel dort, und bewegen Sie den Petriausteilen horizontal an eine depressive Linie (Abbildung 1Bi) erstellen. Wiederholen für die gewünschte Anzahl von Zeilen.
      2. Verwenden Sie das Ende einer Glaspipette Werkzeug, um flache, kreisrunde Vertiefungen in jeder Reihe des Tons gesäumten Gericht zu machen, um Embryos Köpfe (Abbildung 1Bii) und Hilfe bei der Organisation der Embryonen beim Fotografieren zu platzieren.
      3. Für die Fotografie, füllen Teller mit PBT (Abbildung 1Biii). Zwischen den Anwendungen gründlich die Schale und Ton Oberfläche mit sterilem Wasser, gefolgt von 70% Ethanol.

2. Xenopus laevis Embryo Kultur und Inhibitor Behandlungen

  1. In-vitro-Befruchtung und Kultur von Xenopus Eiern:
    1. Erhalten und Kultur Xenopus laevis Embryonen mit Standard publizierten Methoden 22,23.
    2. Kurz gesagt, einschläfern einen erwachsenen Mann durch Eintauchen in eine 0,05% Benzocain Lösung. Sezieren Hoden und lagern in Hoden Speicherpuffer. Injizierenerwachsenen Frauen mit humanem Choriongonadotropin (HCG), sammle Eier in hohen Salz MBS und düngen in vitro mit seziert Hoden (2A, B).
    3. Kultur Embryonen in 0,1 MBS bei 15 ° C, bis die gewünschte Stufe (Stufe Embryonen gemäß dem normalen Tabelle Xenopus laevis durch Nieuwkoop und Faber 24,25) erreicht wird.
      1. Hier Kultur Embryonen bis Stadium 22 (24 h nach der Befruchtung (HPF)), und entfernen Sie die Dotterhaut unter einem Stereomikroskop mit zwei Paaren von geschärft Pinzette. Transferembryonen mit einem Standard, Einwegtransferpipette zu einer sauberen Petrischale (100 mm Durchmesser), die 30-40 ml 0,1x MBS.
  2. Inhibitor Behandlungen von Xenopus-Embryonen (in 2 dargestellt):
    1. Füllen Sie die notwendigen Vertiefungen einer 24-Well-Kulturschale mit 1 ml 0,1x MBS mit einem kalibrierten Pipette-Mann. Abgrenzung der Außenseite der gut mit einem feinen PunktmarkierungER (2D, Einschub). Verwenden Sie die Markierung, um auch beschriften der Inhalt in jede Vertiefung auf dem 24-Loch-Kulturschale Deckel hinzugefügt werden. Kopieren Sie diese Informationen auf eine 24-Well-Set-up Seite im Laborjournal.
    2. Übertragen 5-10 Embryonen in jedes Well mit einem Standard, Einmaltransferpipette (2C). Eine entsprechende Anzahl von Embryonen in jeder Vertiefung.
    3. Füllen Sie oder entfernen Sie die 0,1x MBS, so dass er auf gleicher Höhe mit dem 1 ml markierte Linie (2D). Fügen Sie den entsprechenden Volumen DMSO (so dass das endgültige Volumen DMSO 1%) und leicht schwenken. Achten Sie darauf, DMSO zu nahe an den Embryonen hinzufügen und Kontakt der Embryonen mit der Oberfläche des Puffers zu vermeiden.
    4. Fügen Sie das entsprechende Volumen von chemischen auf die Kavitäten pipettieren und vorsichtig wieder wirbeln. Hier wird mit 1 ul 10 mM BMS-453 (ein Retinolsäure-Rezeptor-Antagonist) und 9 & mgr; l DMSO zu 1 ml 0,1 × MBS.
    5. Wenn die chemische lichtempfindlich ist, lose wickeln Sie das cultur Schale in Aluminiumfolie. Kultur Embryonen in einer 15 ° C-Inkubator, bis die gewünschte Stufe. In diesem Beispiel behandeln Embryonen für 16-18 Std.
  3. Waschen Embryonen aus dem Behandlungs und Aufzucht bis Kaulquappe Stufen:
    1. Entfernen der Hälfte bis drei Viertel der Lösung mit einer Einwegübertragungspipette. Achten Sie darauf, um die Embryonen zu stören. Mit einer neuen Transferpipette, füllen Sie die gut mit 0,1x MBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-6 mal.
    2. Transferembryonen in einer großen Petrischale (150 mm Durchmesser) mit 100 ml 0,1 × MBS mit Gentamicin (1 ml / l). Die Embryonen Inkubation bei 15 ° C, bis sie Stufe 42-45 (82-100 HPF) zu erreichen.
    3. Ändern Sie den 0,1x MBS-Lösung, die Gentamicin täglich, und entfernen abgestorbene Embryonen prompt auf Verschmutzung oder Tod anderer Embryonen zu verhindern. Notieren Sie sich die Anzahl der toten Embryonen in Laborjournal.
  4. Befestigungs Embryonen in Paraformaldehyd (PFA):
    1. Fix Embryonen zwischen den Stufen 42 und 45 (82 und 100HPF, beziehungsweise), indem Sie diese in eine neue 24-Well-Kulturschale mit 1-2 ml 0,1x MBS. Beschriften Sie den Deckel mit den gleichen Informationen wie die Behandlung Set-up oben beschrieben (Abschnitt 2.2.1).
    2. Entfernen Sie so viel 0,1x MBS von jedem gut wie möglich, wobei noch genügend Embryonen abgedeckt und die Gewährleistung minimalen Kontakt, um Verletzungen zu verhindern. 1-2 ml von 0,05% Benzocain Lösung in 0,1x MBS und Inkubation bis Embryonen sind nicht mehr reagiert auf Reize.
    3. 1-2 ml von 4% PFA. Alternativ platzieren Embryonen in markierter Mikrozentrifugenröhrchen für die Fixierung, wenn bevorzugt.
    4. Embryonen inkubieren in PFA für 24 Stunden bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler. Entfernen PFA durch Ausführen 3-4 Wäschen mit PBT über einen 3-5 Stunden-Zeitraum.

3. Fotografieren orofazialen Region Xenopus Kaulquappen

  1. Vorge photography Zubereitung (dies ist in Figur 3 dargestellt):
    1. Fixiert Embryonen in einer großen Petrischale (150mm im Durchmesser), die etwa 100 ml PBT.
    2. Machen Sie zwei Schnitte, um den Kopf aus dem Körper (3A, solide schwarze Linien) durchtrennen. Zuerst halten den Embryo mit einer Pinzette und einen Einschnitt an der hinteren Seite des Darms mit einem sterilen Skalpell (3B). Einen zweiten Schnitt an der vorderen Seite des Darms, in der Nähe des Herzens, um den Kopf (3C) vollständig zu entfernen.
    3. Pipette abgetrennt Embryo Köpfe in einem Ton ausgekleideten Schale (Teil 1.2.2) mit einem Standard, Einmaltransferpipette.
      1. Für Frontalansichten, verwenden Sie zwei Paar Pinzette Embryo Köpfe hinteren Seite innerhalb des kreisförmigen Vertiefungen nach unten positionieren. Verwendung der Zange sowohl den Embryo Kopf und den umgebenden Ton, Position Embryonen sind, dass sie vor der Kamera und werden nicht nach hinten oder zur Seite (3D) geneigt zu manipulieren. Schieben Sie die umliegenden Ton um den Kopf mit einer Pinzette und / oder das GlasPipettenwerkzeug, um den Kopf zu fixieren.
      2. Für Seitenansichten, verwenden Pinzette Embryo Köpfe im Inneren der kreisförmigen Vertiefungen zu positionieren, dass sie auf ihrer Seite, in die gleiche Richtung und sind flach gegen den Lehm. Manipulation der Embryokopf und den umgebenden Ton, so dass die Zementdrüsen aller Embryonen werden nach unten um den gleichen Winkel (3E) angeordnet ist. Verwenden Sie die mit dem neckischen Nadel als Führung gezogen, um die Genauigkeit zu gewährleisten, wenn man seitliche Messungen Zeilen.
  2. Aufnahme von Bildern der Kaulquappe Kopf:
    1. Fotografieren Sie den Kopf der Kaulquappe mit jeder Binokular mit einem angeschlossenen Digitalkamera und der entsprechenden Kamera-Software. Verwenden Sie die höchste Vergrößerung, die für alle Embryonen konstant gehalten werden kann.
    2. Zentrieren Sie Embryonen und konfrontiert sie alle in die gleiche Richtung. Machen Sie Bilder mit den besten Lichtverhältnissen, die für die genaueste Bild des orofazialen Region ermöglichen. PositionLichter übermäßigen Schatten zu vermeiden. Speichern Sie Bilder als TIFF-Dateien mit der höchstmöglichen Auflösung.

4. Messung und Analyse von Gesichts Größe Maße in Xenopus Kaulquappen

  1. Messen Sie orofazialen Abmessungen (in Abbildung 4 zusammengefasst):
    1. Bestimmen Sie den Flächenbreite. Identifizieren Sie die Punkte, an denen der ventrale Teil jedes Auge die Peripherien des Gesichts (4A, Pfeile) trifft, und messen Sie den Abstand zwischen diesen Punkten (4A, rote Linie).
    2. Bestimmen Sie die Gesichtshöhe. Bestimmen Sie zuerst die Mittellinie durch Messen des Abstandes zwischen beiden Augen und die Berechnung der Halbzeit-Marke. Als nächstes ziehen horizontale Linien, die die dorsale meisten Rändern der Augen und die dorsale Punkt der Zementdrüse (4B, weiße Linien) zu markieren. An der Mittellinie, den Abstand zwischen den horizontalen Linien (4B, rote Linie).
    3. Bestimmen Sie ter orofazialen Bereich. Verwenden Sie die gleichen horizontalen Linien markieren die dorsalen Ränder der Augen und Zementdrüse zu Flächenmessung führen (4C, weiße Linien). Beginnen an der Stelle, an der die horizontale Linie markiert die Oberkante der Zementdrüse entspricht der Umfang der linken Seite des Gesichts (Fig 4CA).
      1. Spur entlang der Kante der Fläche, umfassend das Auge bis zu dem Punkt, wo die horizontale Linie markiert die Spitze der Augen entspricht dem Umfang der Fläche (Fig 4ZB). Weiter entlang dieser dorsalen meisten horizontalen Linie zu verfolgen, bis zu dem Punkt, wo sie den Umfang der rechten Seite der Seite (Figur 4 cc) erfüllt.
      2. Unten Spuren entlang der Kante der Fläche umfasst das Auge bis zu dem Punkt, wo der ventralen meisten horizontalen Linienmarkierungs die Oberseite der Zementdrüse entspricht dem Umfang der rechten Seite der Seite (Fig 4cd). Weiterhin entlang dieser untere horizontale Linie unt Spurenil es trifft den Punkt, wo Verfolgung begann. Verwenden Sie Bildbearbeitungssoftware, um den Bereich innerhalb der Ablaufverfolgung zu berechnen.
    4. Bestimmen Sie die Schnauze Länge. Am seitlichen Bilder, machen Sie eine vertikale Linie, die den vorderen Augen markiert. Dann messen Sie den horizontalen Abstand von der vorderen meisten Punkt, wo das Gesicht trifft den dorsalen Rand des Zementdrüse auf die vertikale Linie markiert den vorderen des Auges (4D).
    5. Bestimmen Sie die Maulweite. Messen Sie den horizontalen Abstand zwischen linken und rechten Stellen, an denen die oberen und unteren "Lippen" der Mundöffnung treffen (4E). Diese könnten als der Frosch Äquivalent der labialen Kommissuren werden.
    6. Bestimmen Sie den Mund Rundheit. Berechnen Mund Rundheit als inverse Seitenverhältnis, wo (4   ×   [Bereich]) / (π   ×   [Hauptachse] 2 >).
      1. Verwenden Sie das Lasso-Werkzeug in einem Foto-Editor, um die Ränder der Mundöffnung verfolgen wie in 4F gezeigt. Wählen Analysieren in der Hauptsymbolleiste, und wählen Sie messen. Alternativ berechnet die Rundheit aus der Messung der Fläche und dem Durchmesser der Mündung.
  2. Die Datenanalyse von Gesichtsmaße:
    1. Eingang die Messungen der Gesichts Dimensionen in einem Datenanalyseprogramms, um die Behandlungsgruppe mit der Kontrolle zu vergleichen. Bestimmen Sie den Mittelwert jeder Messung sowohl für Versuchs- und Kontrollgruppen, um Balkendiagramme erstellen. Bestimmen Sie die Standardabweichung, um Fehlerbalken erstellen. Führen Student-t-Tests statistisch vergleichen Gruppen.
      HINWEIS: Diese Daten können sehr variabel auf die leicht unterschiedliche Entwicklungsstand unter Embryonen sein.

5. Quantitative Analyse der Orofacial Form und Morphometrie

  1. Platz Sehenswürdigkeiten und Create Wahrzeichen Koordinatendatei (in der 5A dargestellt).
    1. Wahr wählen, dass sie erfassen die Form des Zielbildes, und kann wiederholt in der gleichen relativen Position in allen Proben angebracht, die analysiert werden. Wenn eine Struktur nicht in allen Proben vorhanden sind, stellen Sie keine ein Meilenstein auf dieser Struktur.
      1. Hier setzen 24 der Sehenswürdigkeiten des Mittelgesichts mit Kennzeichen wie die Augen, Nase und Mund darstellen. Aus Gründen der Einheitlichkeit der Sehenswürdigkeiten Ort auf halbem Weg zwischen zuvor platzierte Landmarken (zB Mund Sehenswürdigkeiten, Abbildung 5Ai).
    2. Erfassen Wahrzeichen Koordinaten und erstellen "Wahrzeichen Koordinatendatei". Öffnen Sie das erste Bild einer Kaulquappe Fläche (zum Beispiel das erste Steuer Embryo).
      1. Wählen Sie die Registerkarte Plugins auf der Hauptsymbolleiste und wählen Pointpicker aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie die Punkte hinzufügen Registerkarte und Ort Sehenswürdigkeiten in gewünschten Stellen als Landmarken werden als bunten Kreuze erscheinen ( Abbildung 5Ai).
      2. Bewegen Wahrzeichen Orten nach der Platzierung durch die Auswahl der Move Kreuze Werkzeug. Wenn alle Sehenswürdigkeiten sind auf dem Bild platziert wurde, wählen Sie die Registerkarte Anzeige Ergebnisse auf der Hauptsymbolleiste, und wählen Sie Show (Abbildung 5Aii) auf wegweisende Koordinaten anzeigen und kopieren in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 5Aiii).
      3. Beim Einfügen diese Koordinaten aus dieser ersten Embryos in einem Tabellenkalkulationsprogramm, lassen Sie eine leere Zeile oberhalb der Daten. In Spalte B dieses leere Zeile (Zeile 1), Typ "LM =" mit der Anzahl der Sehenswürdigkeiten in der Probe. Geben Sie hier "LM = 24" seit 24 Sehenswürdigkeiten wurden (Abbildung 5Aiii, roter Kasten) erstellt.
      4. In der Zeile unterhalb der Datenpunkte, Typ "ID =" mit einem Namen Identifizierung der Probe. Hier in Abbildung 5Aiii, geben Sie "ID = CON1" denn dies ist das Wahrzeichen von Koordinatendaten des ersten Kontrollembryo (Abbildung 5Aiii, roter Pfeil).
      5. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit Gesichtern von jedem Embryo in dem Experiment (experimentelle und Kontrollen), bis alle Wahrzeichen Koordinaten in die Tabellenkalkulation eingegeben.
        HINWEIS: Es ist wichtig, dass jeder Embryo wird einen eindeutigen Namen in der "ID =" Zeile angegeben. Hier wird beispielsweise der nächste Satz von Wahrzeichen Koordinaten die ID "CON2" gegeben, da war es der zweite Embryo in der Kontrollgruppe.
      6. Kopieren Sie den gesamten zweiten und dritten Spalte in ein Textdokument und speichern als TXT-Datei.
  2. Einrichten der morphometrischen Software zur Datenanalyse (in 5B dargestellt).
    1. Hier wählen Sie Create New Data Set im Hauptmenü in der morphometrischen Software-Programm. Benennen Sie die Datei und die Daten in die entsprechenden Felder gesetzt (zum Beispiel "Retinsäure Hemmung" und "Gesichtswahrzeichen" bezeichnet) in der Pop-up-Bildschirm (Abbildung 5BI). Importieren Sie die Datei als TPS und select die Textdatei von Koordinaten, um die Datenmenge (Abbildung 5BI, roter Pfeil) zu erstellen.
    2. Datenabgleich und Procrustes passen:
      1. Führen Sie eine Procrustes fit und Ausrichtung. Markieren Sie die Daten in der Registerkarte Projektbaum zu setzen, wählen Vorrunde auf der Hauptsymbolleiste, und New Procrustes Fit im Dropdown-Menü.
      2. Wählen Sie Ausrichten von Hauptachse und wählen Sie Führen Procrustes Fit am Boden der Box (Abbildung 5Bii, roter Pfeil). Zurück zu den Vorrundenspielen im Dropdown-Menü wählen Sie Generieren Kovarianzmatrix (Abbildung 5Biii), und wählen Sie Ausführen.
      3. Informieren Sie sich über die Zusammenhänge der Kovarianzmatrix in der Registerkarte Ergebnisse.
    3. Erstellung einer "Klassifikator Datei" von jeder Probe in den Daten an den entsprechenden Klassifizierer Variable Zuordnung zu unterscheiden, ob es in der experimentellen Gruppe und der Kontrollgruppe gehört.
      1. Beschriften Sie zwei Spalten in einer Tabellenkalkulation. Beschriften Sie die Kopfzeile der ersten Kolumnen mit "ID" und geben die gleiche ID für jede Probe gegeben (zum Beispiel CON1, RARINHIB1 usw., Fig 5Biv). Kennzeichnen den Header der zweiten Spalte mit "Behandlung" und Eingabe in jede Zelle der Behandlungsgruppe, die an der Probe in der benachbarten Zelle ID aufgeführt entspricht.
      2. Hier verwenden "CONTROL und RAR-Inhibitor" Etiketten als Klassifizierer (Abbildung 5Biv). Kopieren Sie in eine Textdatei und speichern als TXT-Datei. Import Classifier Variablen in die morphometrischen Software-Programm. Wählen Sie Spiel durch Identifier, und öffnen Sie die Textdatei (Abbildung 5Bv).
  3. Erstellen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) Streudiagramm, indem Sie die Variation Dropdown-Menü und wählen Principal Component Analysis (Abbildung 6AI). Als nächstes wählen Sie die Registerkarte Grafik, um drei zusätzliche Registerkarten angezeigt: PC Formänderungen, Eigenwerte, und PC-Scores (Abbildung 6Aii). Der PC Partituren Registerkarte werden die bivariate Hauptkomponentenstreudiagramm der Procrustes fit Landmarkendaten (Abbildung 6Aii).
    1. So ändern Sie die Hauptkomponenten aufgetragen werden, um das Popup-Menü in der Handlung Raum und wählen Sie die gewünschte Achse (Abbildung 6Aiii, roter Pfeil) zu ändern.
    2. Wählen Sie die Farbe Datenpunkte Werkzeug (Abbildung 6Aiii). Wählen Klassifizierer zuvor im zweiten Popup-Menü, das die Farbe der einzelnen Kategorien (Abbildung 6Aiv) zu bestimmen scheint importiert (Abschnitt 5.2.2).
    3. Informieren Sie sich über die Höhe der Varianz von jedem Hauptkomponente in der Registerkarte Ergebnisse (Abbildung 6AV) gefangen genommen. Export Graphen als BMP-Datei.
  4. Erstellen Sie eine Unterscheidungsfunktion Analyse (DFA) Transformationsnetz in der morphometrischen Software-Programm, indem Sie Diskriminanzanalyse unter der Vergleich Registerkarte (Abbildung 6BI). Im Popup-Menü, stellen Sie sicher, dass der entsprechende Datensatz selreflektierte und die Art der Daten die Procrustes-fit-Koordinaten.
    1. Markieren Sie die Paare von Gruppen, die verglichen werden, und führen 1.000 Permutationstests (Abbildung 6Bii).
    2. Unter Grafiken sehen die Vektorkarte der Koordinaten in der Formunterschied Registerkarte (Abbildung 6Biii). Wenn das Bild umgekehrt wird, um das Popup-Menü in der Handlung Platz, um das Diagramm in der richtigen Orientierung (Abbildung 6Biii) kippen.
    3. Die Richtung der Vektoren reflektiert den Formunterschied von der ersten Gruppe im Vergleich zu der zweiten, die in der Diskriminanzfunktionskoeffizienten Menü vor dem Ausführen der Analyse (Abbildung 6Bii) angezeigt wird. Um die Richtung der Vektoren umzukehren, um das Popup-Menü in der Handlung Raum und verändern das Zeichen des Skalierungsfaktors, so dass es negativ ist (Abbildung 6Biii, iv). Der Wert der Skalenwert um den Faktor zehn, die am besten repräsentiert die statistischen Unterschiede in Markierungsposition betwee eingestelltn die beiden Gruppen ohne Verzerrung und in der Regel auf den Standard (Fig 6Biv) verlassen.
    4. Auch in der Pop-up-Menü, ändern Sie die Grafik in einer Transformationsnetz, um die Vektoren auf einem Gitter überlagern (Abbildung 6Biii, v).
    5. Geben Sie die Anzahl der horizontalen und vertikalen Linien des Gitters in der Pop-up-Menü (Abbildung 6Biii, v).
    6. Exportieren Sie die Grafik als BMP-Datei.
    7. Sehen Sie sich die Procrustes und Mahalinobis Entfernungen und p-Werte unter der Registerkarte Ergebnisse (Abbildung 6Bvi).
  5. Zusätzliche morphometrische Analysen, die nützlich für die Beurteilung der mehr als eine Behandlungsgruppe sind
    1. Erstellen Sie eine Hauptkomponentenanalyse Transformationsnetz. Die PC-Formänderungen Registerkarte zeigt die Vektorkarte von Formänderungen entfallen Varianz innerhalb jeder Probengruppe. Verwenden Sie das Popup-Menü in der Zeichnungsfläche, um das Bild richtig auf eine Transformationsnetz orientieren und überlagern Vektoren. Stellen Sie den Skalierungsfaktorzu dem Wert auf der x-Achse des PC Partituren Diagramm, das dem geschätzten Mitte der Kontrollgruppe entspricht. Exportieren Sie das Bild als BMP-Datei.
    2. Erstellen Sie ein Streudiagramm CVA. Unter dem Reiter-Vergleich auf der Hauptsymbolleiste, wählen Canonical Variate Analysis, und markieren Sie den Klassifikator Variablensatz, die zuvor importiert wurde (siehe Abschnitt 5.2.3). Wählen 1.000 Iterationen für Permutationstests, und wählen Sie Ausführen. Wählen Sie die Registerkarte CV Partituren, die bivariate CVA Streudiagramm anzeigen. Dies wird auf der Grundlage der hochgeladenen Klassifikatoren Farbe codiert. Ändern Sie das Farbschema, indem Sie das Popup-Menü in der Handlung Raum (siehe Abschnitt 5.3.3). Export als BMP-Datei.
    3. Erstellen Sie ein CVA Transformationsnetz. Ein Transformationsnetz der CVA Ergebnisse beim Vergleich mehr als zwei Gruppen erzeugt werden. Unter der Registerkarte Grafik, wählen Sie CV Formänderungen, um die Transformation Raster der Wahrzeichen Koordinaten visualisieren. Rufen Sie das Popup-Menü in der Handlung Raum änderndie Richtung des Vektors, überlagern Ergebnisse auf eine Transformationsnetz, und geben Sie die Anzahl der Rasterlinien. Exportieren Sie die Grafik als BMP-Datei.

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Ergebnisse

Hier wird eine quantitative Analyse der orofacial Größe und Form wurde gezeigt, Embryonen mit einem Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor (RAR-Inhibitor) zu unbehandelten Kontrollen behandelt vergleichen. Embryonen wurden mit einer 1 & mgr; M Konzentration dieser chemischen Inhibitor von Stufe 24 bis 30 (26-35 HPF) behandelt, ausgewaschen und in Stufe 42 (82 hpf) befestigt ist. Sie wurden dann verarbeitet und analysiert, wie in dem Protokoll beschrieben. Ergebnisse sind Originaldaten, aber im Einklang mit Beobachtungen in f...

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Diskussion

Xenopus laevis hat sich zu einem nützlichen Werkzeug für Sezieren der Entwicklungsmechanismen zugrunde liegenden orofazialen Entwicklung; Allerdings gibt es noch keine Protokolle Größe und Form Veränderungen dieser Region bei Fröschen beschreibt. Die hier beschriebene Methode wird erheblich auf das Gebiet der orofazialen Entwicklung, indem sie für eine strengere Quantifizierung der orofazialen Phänotypen in Xenopus und anderen Wirbeltieren beitragen.

Die erste, kritischer A...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Start-up-Gelder an A. Dickinson von VCU unterstützt diese Arbeit.

Die Autoren möchten sich Dan Nacu für sein künstlerisches Talent bei der Erstellung der schematischen Darstellung zu bestätigen.

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Materialien

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PräpariermikroskopZeissmit AxioCamICC1 Kamera
Dumont #5 Inox-PinzetteFine Science Tools11251-10
Steriles Einweg-SkalpellSklar06-2015
24-Well-PlatteFisher Scientific087721
Standard Einweg-TransferpipettenFisher Scientific13-711-7M
150 mm x 15 mm PetrischalenFalcon351058
InkubatorenEctothermSet auf 15 > C oder 20 &Grad; C
ModelliermassePremo oder eine andere ungiftige Modelliermassein schwarz oder weiß
Gerade NadelThermo Scientific19010
Kapillarschlauch (für Nadeln)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm AD x 0,5 mm ID/Faser, je 100 mm
Nadelabzieher, Modell P-97Sutter Instrument Co.Nadelabzieher: P-97 Flaming/ Bown Mikropipettenabzieher Filament: FB300BVerwenden Sie für Filamente Sutter 3,00 mm quadratische Box-Filamente, 3,0 mm breit.
PipettiererGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CysteinSigma-Aldrich52-90-4
Paraformaldehyd PulverSigma-Aldrich158127
PetrischalenFalcom353003, 351058100 mm Durchmesser und 150 mm Durchmesser
100% EthanolVWR89125-170

Referenzen

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