Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in Xenopus

Unter den am weitesten verbreiteten und auch schwerwiegendsten Form der menschlichen Geburtsfehler sind diejenigen den Mund und Gesicht, zu beeinflussen, wie Gesichtsspalten ^ein. Kinder mit missgebildeten orofazialen Strukturen durchlaufen mehrere Operationen über deren gesamte Lebensdauer und Kampf mit Gesichtsanomalien, Sprache, Gehör und Essstörungen. Deshalb werden neue Forschung in cranio und orofazialen Entwicklung erleichtert ist ausschlaggebend für die Vorbeugung und Behandlung dieser Art von Geburtsschäden beim Menschen. Xenopus laevis wurde als neues Werkzeug zum Präparieren der Mechanismen, die kraniofazialen Entwicklung entstanden (einige Beispiele sind ^{2,3,4 -11).} Daher könnte eine quantitative Methode, um Größe und Form Veränderungen während der Entwicklung des Kopfes und Gesicht dieser Art zu analysieren sehr leistungsfähige ³ sein.

Hier stellen wir ein solches Verfahren; Kombination von traditionellen Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie von einer Xenopus-Studie ¹² angepasst 13-15. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Forschern ermöglichen, Gesichts Größen und Formen zu quantifizieren, um zwischen verschiedenen orofazialen Phänotypen während der normalen und abnormalen Entwicklung unterscheiden. Diese Analyse wird zur besseren Unterscheidung zwischen subtilen kraniofazialen Defekten wie solche aus synergistische Wirkung von Genen und / oder Umweltfaktoren. Darüber hinaus könnte diese Quantifizierungsmethode auch zeigen sogar leichte Verbesserung oder Rettung eines orofazialen Defekt. Dies macht es zu einem nützlichen Leitfaden bei der Analyse potenzielle Therapeutika daher.

Die Kombination aus Gesichts Messungen und geometrische Morphometrie, die wir hier präsentieren, ermöglicht eine umfassende statistische Analyse der Größe und Form des orofazialen Region als aktuellen Protokolle, die weitgehend nutzen nur eine oder die andere ^{von 15 bis 18.} Weiterhin stellen wir eine einfache Möglichkeit, sowohl den medialen und lateralen Ebenen beurteilendas Gesicht ohne aufwändige dreidimensionale bildgebende Geräte in aktuellen Studien ^13,19 verwendet erfordern.

Wir zeigen, dass dieses Protokoll über Xenopus laevis Embryonen mit einer Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor, abnormen orofazialen Entwicklung und eine mediane Gaumenspalte ^2,3 induziert behandelt. Quantifizierung der Abmessungen und der Form des orofacial Region in diesen Embryonen wurde Veränderungen im Mittelgesicht, die analog zu den Menschen mit ähnlichen Gaumenspalten und Mausmodellen ^20,21 ist offenbart. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von anderen Verbindungen auf orofacial Entwicklung, wie natürliche Stoffe, Herbizide, oder Proteinen, wie Wachstumsfaktoren zu beurteilen. Ferner orofazialen Größe und Form Veränderungen aus Störung der Genexpression über Verlust oder Gewinn von Funktionsversuchen (mit Antisense-Morpholinos oder Crispers / Talens) kann auch mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Schließlich diese Methode specifica entwickelten wirlly zu Xenopus Morphologie zu bewerten; es ist jedoch einfach für die Analyse von jedem Wirbeltier modifiziert. Andere Anwendungen könnten auch unter Verwendung dieses Protokolls für den Vergleich nahe verwandter Arten für evolutionäre oder ökologische Studien. Während das Beispiel stellen wir hier nutzt dieses Protokoll, um Analyse der orofazialen Region zu beschreiben, könnte es leicht für die Analyse von anderen Regionen, Organe oder Strukturen verändert werden.

Diese orofazialen Quantifizierung Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Forschungsgemeinschaft sowie ein ausgezeichnetes Lehrmittel für Studenten als Video-Demonstration geworden.

Alle Experimente unter Verwendung von Xenopus laevis wurden von IACUC (Protokoll # AD20261) genehmigt worden.

1. Vorbereiten Reagenzien und benötigte Materialien

1. Reagenzien:
   1. Machen 1 l 10x MBS (Modified Barths Saline) Lösung ^22. Hinzufügen NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO ₄ (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) und NaHCO ₃ (25 mM) zu 1 l destilliertem Wasser. Einstellen des pH auf 7,8 mit NaOH.
   2. Auffüllen auf 1 l 1x MBS durch Verdünnen von 100 ml des 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl _{2 -Lösung.}
   3. Auffüllen auf 1 l 0,1 × MBS durch Verdünnen von 100 ml 1x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser. Um 1 l 0,1x MBS-Lösung, 1 ml 10 mg / ml Gentamicin-Lösung für den Einsatz in Embryokultur.
   4. Stellen hohe Salz MBS durch Auflösen von 4 ml 5 M NaCl in 100 ml 10x MBS. Dann fügen destilliertem Wasser bis Gesamtvolumen beträgt 1 L.
   5. Machen 70% Ethanol durch Verdünnen von 100% eTHANOL zu 70% Ethanol unter Verwendung von destilliertem Wasser.
   6. Machen BMS-543 durch Herstellung einer 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO).
   7. Machen 4% Paraformaldehyd (PFA) durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd-Pulver zu 50 ml destilliertem Wasser. Hitze auf einer Heizplatte auf ca. 65 ° C, an welcher Stelle mit 5 M NaOH tropfenweise, bis die Lösung löscht.
      1. Sobald die Lösung löscht, vom Herd nehmen und 50 ml 2x PBS und 100 ul Tween-20. Lasse auf RT auf Eis kühlen. PH-Wert auf zwischen 7,2 und 7,5 mit HCl.
   8. Einen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween (PBT), die durch Lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na ₂ HPO ₄ und 0,24 g KH ₂ PO ₄ in 800 ml destilliertem Wasser. Mit HCl, pH-Einstellung auf 7,4. 2 ml Tween-20. Passen Endvolumen mit destilliertem Wasser auf gleich 1 L.
   9. Machen Sie eine Cystein-Lösung durch Auflösen von 1 g Cystein in 50 ml destilliertem Wasser oder 0,1x MBS. In 1,5 ml 5 M NaOH einnd stellen Sie den pH-Wert auf 7,8.
   10. Einen 10% Benzocain Stammlösung durch Zugabe von 10 g Benzocain Pulver auf 100 ml 100% EtOH. Für die Euthanasie der erwachsenen Männer und Embryonen bereit Fixierung, zu verdünnen, um eine 0,05% ige Lösung.
   11. Einen Hoden Speicherlösung durch Zugabe von 1 ml Kälberserum zu 9 ml L15 Puffer.
2. Erforderliche Werkzeuge und Hilfsmittel:
   1. Besorgen Sie sich die in der Tabelle der Materialien und Geräte aufgeführten Geräte, in Abbildung 1 dargestellt.
   2. Ändern einer Pipettenwerkzeug. Setzen Sie die Spitze einer Glaspasteurpipette in eine Flamme aus einem Bunsenbrenner. Drehen Sie die Pipettenspitze, bis es schmilzt und bildet eine abgerundete abgedichteten Ende.
   3. Flatten Knetmasse in den Boden einer Petrischale aus Kunststoff, glätten, um die gesamte Platte abdecken (jeglicher Größe eingesetzt werden können) (Abbildung 1Aiv).
      1. Drücken Sie leicht eine gerade teasing Nadel in den Lehm ausgekleideten Schale bei 45 ° -Winkel. Halten Sie die Nadel dort, und bewegen Sie den Petriausteilen horizontal an eine depressive Linie (Abbildung 1Bi) erstellen. Wiederholen für die gewünschte Anzahl von Zeilen.
      2. Verwenden Sie das Ende einer Glaspipette Werkzeug, um flache, kreisrunde Vertiefungen in jeder Reihe des Tons gesäumten Gericht zu machen, um Embryos Köpfe (Abbildung 1Bii) und Hilfe bei der Organisation der Embryonen beim Fotografieren zu platzieren.
      3. Für die Fotografie, füllen Teller mit PBT (Abbildung 1Biii). Zwischen den Anwendungen gründlich die Schale und Ton Oberfläche mit sterilem Wasser, gefolgt von 70% Ethanol.

2. Xenopus laevis Embryo Kultur und Inhibitor Behandlungen

1. In-vitro-Befruchtung und Kultur von Xenopus Eiern:
   1. Erhalten und Kultur Xenopus laevis Embryonen mit Standard publizierten Methoden ^22,23.
   2. Kurz gesagt, einschläfern einen erwachsenen Mann durch Eintauchen in eine 0,05% Benzocain Lösung. Sezieren Hoden und lagern in Hoden Speicherpuffer. Injizierenerwachsenen Frauen mit humanem Choriongonadotropin (HCG), sammle Eier in hohen Salz MBS und düngen in vitro mit seziert Hoden (2A, B).
   3. Kultur Embryonen in 0,1 MBS bei 15 ° C, bis die gewünschte Stufe (Stufe Embryonen gemäß dem normalen Tabelle Xenopus laevis durch Nieuwkoop und Faber ^24,25) erreicht wird.
      1. Hier Kultur Embryonen bis Stadium 22 (24 h nach der Befruchtung (HPF)), und entfernen Sie die Dotterhaut unter einem Stereomikroskop mit zwei Paaren von geschärft Pinzette. Transferembryonen mit einem Standard, Einwegtransferpipette zu einer sauberen Petrischale (100 mm Durchmesser), die 30-40 ml 0,1x MBS.
2. Inhibitor Behandlungen von Xenopus-Embryonen (in 2 dargestellt):
   1. Füllen Sie die notwendigen Vertiefungen einer 24-Well-Kulturschale mit 1 ml 0,1x MBS mit einem kalibrierten Pipette-Mann. Abgrenzung der Außenseite der gut mit einem feinen PunktmarkierungER (2D, Einschub). Verwenden Sie die Markierung, um auch beschriften der Inhalt in jede Vertiefung auf dem 24-Loch-Kulturschale Deckel hinzugefügt werden. Kopieren Sie diese Informationen auf eine 24-Well-Set-up Seite im Laborjournal.
   2. Übertragen 5-10 Embryonen in jedes Well mit einem Standard, Einmaltransferpipette (2C). Eine entsprechende Anzahl von Embryonen in jeder Vertiefung.
   3. Füllen Sie oder entfernen Sie die 0,1x MBS, so dass er auf gleicher Höhe mit dem 1 ml markierte Linie (2D). Fügen Sie den entsprechenden Volumen DMSO (so dass das endgültige Volumen DMSO 1%) und leicht schwenken. Achten Sie darauf, DMSO zu nahe an den Embryonen hinzufügen und Kontakt der Embryonen mit der Oberfläche des Puffers zu vermeiden.
   4. Fügen Sie das entsprechende Volumen von chemischen auf die Kavitäten pipettieren und vorsichtig wieder wirbeln. Hier wird mit 1 ul 10 mM BMS-453 (ein Retinolsäure-Rezeptor-Antagonist) und 9 & mgr; l DMSO zu 1 ml 0,1 × MBS.
   5. Wenn die chemische lichtempfindlich ist, lose wickeln Sie das cultur Schale in Aluminiumfolie. Kultur Embryonen in einer 15 ° C-Inkubator, bis die gewünschte Stufe. In diesem Beispiel behandeln Embryonen für 16-18 Std.
3. Waschen Embryonen aus dem Behandlungs und Aufzucht bis Kaulquappe Stufen:
   1. Entfernen der Hälfte bis drei Viertel der Lösung mit einer Einwegübertragungspipette. Achten Sie darauf, um die Embryonen zu stören. Mit einer neuen Transferpipette, füllen Sie die gut mit 0,1x MBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-6 mal.
   2. Transferembryonen in einer großen Petrischale (150 mm Durchmesser) mit 100 ml 0,1 × MBS mit Gentamicin (1 ml / l). Die Embryonen Inkubation bei 15 ° C, bis sie Stufe 42-45 (82-100 HPF) zu erreichen.
   3. Ändern Sie den 0,1x MBS-Lösung, die Gentamicin täglich, und entfernen abgestorbene Embryonen prompt auf Verschmutzung oder Tod anderer Embryonen zu verhindern. Notieren Sie sich die Anzahl der toten Embryonen in Laborjournal.
4. Befestigungs Embryonen in Paraformaldehyd (PFA):
   1. Fix Embryonen zwischen den Stufen 42 und 45 (82 und 100HPF, beziehungsweise), indem Sie diese in eine neue 24-Well-Kulturschale mit 1-2 ml 0,1x MBS. Beschriften Sie den Deckel mit den gleichen Informationen wie die Behandlung Set-up oben beschrieben (Abschnitt 2.2.1).
   2. Entfernen Sie so viel 0,1x MBS von jedem gut wie möglich, wobei noch genügend Embryonen abgedeckt und die Gewährleistung minimalen Kontakt, um Verletzungen zu verhindern. 1-2 ml von 0,05% Benzocain Lösung in 0,1x MBS und Inkubation bis Embryonen sind nicht mehr reagiert auf Reize.
   3. 1-2 ml von 4% PFA. Alternativ platzieren Embryonen in markierter Mikrozentrifugenröhrchen für die Fixierung, wenn bevorzugt.
   4. Embryonen inkubieren in PFA für 24 Stunden bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler. Entfernen PFA durch Ausführen 3-4 Wäschen mit PBT über einen 3-5 Stunden-Zeitraum.

3. Fotografieren orofazialen Region Xenopus Kaulquappen

1. Vorge photography Zubereitung (dies ist in Figur 3 dargestellt):
   1. Fixiert Embryonen in einer großen Petrischale (150mm im Durchmesser), die etwa 100 ml PBT.
   2. Machen Sie zwei Schnitte, um den Kopf aus dem Körper (3A, solide schwarze Linien) durchtrennen. Zuerst halten den Embryo mit einer Pinzette und einen Einschnitt an der hinteren Seite des Darms mit einem sterilen Skalpell (3B). Einen zweiten Schnitt an der vorderen Seite des Darms, in der Nähe des Herzens, um den Kopf (3C) vollständig zu entfernen.
   3. Pipette abgetrennt Embryo Köpfe in einem Ton ausgekleideten Schale (Teil 1.2.2) mit einem Standard, Einmaltransferpipette.
      1. Für Frontalansichten, verwenden Sie zwei Paar Pinzette Embryo Köpfe hinteren Seite innerhalb des kreisförmigen Vertiefungen nach unten positionieren. Verwendung der Zange sowohl den Embryo Kopf und den umgebenden Ton, Position Embryonen sind, dass sie vor der Kamera und werden nicht nach hinten oder zur Seite (3D) geneigt zu manipulieren. Schieben Sie die umliegenden Ton um den Kopf mit einer Pinzette und / oder das GlasPipettenwerkzeug, um den Kopf zu fixieren.
      2. Für Seitenansichten, verwenden Pinzette Embryo Köpfe im Inneren der kreisförmigen Vertiefungen zu positionieren, dass sie auf ihrer Seite, in die gleiche Richtung und sind flach gegen den Lehm. Manipulation der Embryokopf und den umgebenden Ton, so dass die Zementdrüsen aller Embryonen werden nach unten um den gleichen Winkel (3E) angeordnet ist. Verwenden Sie die mit dem neckischen Nadel als Führung gezogen, um die Genauigkeit zu gewährleisten, wenn man seitliche Messungen Zeilen.
2. Aufnahme von Bildern der Kaulquappe Kopf:
   1. Fotografieren Sie den Kopf der Kaulquappe mit jeder Binokular mit einem angeschlossenen Digitalkamera und der entsprechenden Kamera-Software. Verwenden Sie die höchste Vergrößerung, die für alle Embryonen konstant gehalten werden kann.
   2. Zentrieren Sie Embryonen und konfrontiert sie alle in die gleiche Richtung. Machen Sie Bilder mit den besten Lichtverhältnissen, die für die genaueste Bild des orofazialen Region ermöglichen. PositionLichter übermäßigen Schatten zu vermeiden. Speichern Sie Bilder als TIFF-Dateien mit der höchstmöglichen Auflösung.

4. Messung und Analyse von Gesichts Größe Maße in Xenopus Kaulquappen

1. Messen Sie orofazialen Abmessungen (in Abbildung 4 zusammengefasst):
   1. Bestimmen Sie den Flächenbreite. Identifizieren Sie die Punkte, an denen der ventrale Teil jedes Auge die Peripherien des Gesichts (4A, Pfeile) trifft, und messen Sie den Abstand zwischen diesen Punkten (4A, rote Linie).
   2. Bestimmen Sie die Gesichtshöhe. Bestimmen Sie zuerst die Mittellinie durch Messen des Abstandes zwischen beiden Augen und die Berechnung der Halbzeit-Marke. Als nächstes ziehen horizontale Linien, die die dorsale meisten Rändern der Augen und die dorsale Punkt der Zementdrüse (4B, weiße Linien) zu markieren. An der Mittellinie, den Abstand zwischen den horizontalen Linien (4B, rote Linie).
   3. Bestimmen Sie ter orofazialen Bereich. Verwenden Sie die gleichen horizontalen Linien markieren die dorsalen Ränder der Augen und Zementdrüse zu Flächenmessung führen (4C, weiße Linien). Beginnen an der Stelle, an der die horizontale Linie markiert die Oberkante der Zementdrüse entspricht der Umfang der linken Seite des Gesichts (Fig 4CA).
      1. Spur entlang der Kante der Fläche, umfassend das Auge bis zu dem Punkt, wo die horizontale Linie markiert die Spitze der Augen entspricht dem Umfang der Fläche (Fig 4ZB). Weiter entlang dieser dorsalen meisten horizontalen Linie zu verfolgen, bis zu dem Punkt, wo sie den Umfang der rechten Seite der Seite (Figur 4 cc) erfüllt.
      2. Unten Spuren entlang der Kante der Fläche umfasst das Auge bis zu dem Punkt, wo der ventralen meisten horizontalen Linienmarkierungs die Oberseite der Zementdrüse entspricht dem Umfang der rechten Seite der Seite (Fig 4cd). Weiterhin entlang dieser untere horizontale Linie unt Spurenil es trifft den Punkt, wo Verfolgung begann. Verwenden Sie Bildbearbeitungssoftware, um den Bereich innerhalb der Ablaufverfolgung zu berechnen.
   4. Bestimmen Sie die Schnauze Länge. Am seitlichen Bilder, machen Sie eine vertikale Linie, die den vorderen Augen markiert. Dann messen Sie den horizontalen Abstand von der vorderen meisten Punkt, wo das Gesicht trifft den dorsalen Rand des Zementdrüse auf die vertikale Linie markiert den vorderen des Auges (4D).
   5. Bestimmen Sie die Maulweite. Messen Sie den horizontalen Abstand zwischen linken und rechten Stellen, an denen die oberen und unteren "Lippen" der Mundöffnung treffen (4E). Diese könnten als der Frosch Äquivalent der labialen Kommissuren werden.
   6. Bestimmen Sie den Mund Rundheit. Berechnen Mund Rundheit als inverse Seitenverhältnis, wo (4   ×   [Bereich]) / (π   ×   [Hauptachse] ² >).
      1. Verwenden Sie das Lasso-Werkzeug in einem Foto-Editor, um die Ränder der Mundöffnung verfolgen wie in 4F gezeigt. Wählen Analysieren in der Hauptsymbolleiste, und wählen Sie messen. Alternativ berechnet die Rundheit aus der Messung der Fläche und dem Durchmesser der Mündung.
2. Die Datenanalyse von Gesichtsmaße:
   1. Eingang die Messungen der Gesichts Dimensionen in einem Datenanalyseprogramms, um die Behandlungsgruppe mit der Kontrolle zu vergleichen. Bestimmen Sie den Mittelwert jeder Messung sowohl für Versuchs- und Kontrollgruppen, um Balkendiagramme erstellen. Bestimmen Sie die Standardabweichung, um Fehlerbalken erstellen. Führen Student-t-Tests statistisch vergleichen Gruppen.
      HINWEIS: Diese Daten können sehr variabel auf die leicht unterschiedliche Entwicklungsstand unter Embryonen sein.

5. Quantitative Analyse der Orofacial Form und Morphometrie

1. Platz Sehenswürdigkeiten und Create Wahrzeichen Koordinatendatei (in der 5A dargestellt).
   1. Wahr wählen, dass sie erfassen die Form des Zielbildes, und kann wiederholt in der gleichen relativen Position in allen Proben angebracht, die analysiert werden. Wenn eine Struktur nicht in allen Proben vorhanden sind, stellen Sie keine ein Meilenstein auf dieser Struktur.
      1. Hier setzen 24 der Sehenswürdigkeiten des Mittelgesichts mit Kennzeichen wie die Augen, Nase und Mund darstellen. Aus Gründen der Einheitlichkeit der Sehenswürdigkeiten Ort auf halbem Weg zwischen zuvor platzierte Landmarken (zB Mund Sehenswürdigkeiten, Abbildung 5Ai).
   2. Erfassen Wahrzeichen Koordinaten und erstellen "Wahrzeichen Koordinatendatei". Öffnen Sie das erste Bild einer Kaulquappe Fläche (zum Beispiel das erste Steuer Embryo).
      1. Wählen Sie die Registerkarte Plugins auf der Hauptsymbolleiste und wählen Pointpicker aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie die Punkte hinzufügen Registerkarte und Ort Sehenswürdigkeiten in gewünschten Stellen als Landmarken werden als bunten Kreuze erscheinen (
      2. Bewegen Wahrzeichen Orten nach der Platzierung durch die Auswahl der Move Kreuze Werkzeug. Wenn alle Sehenswürdigkeiten sind auf dem Bild platziert wurde, wählen Sie die Registerkarte Anzeige Ergebnisse auf der Hauptsymbolleiste, und wählen Sie Show (Abbildung 5Aii) auf wegweisende Koordinaten anzeigen und kopieren in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 5Aiii).
      3. Beim Einfügen diese Koordinaten aus dieser ersten Embryos in einem Tabellenkalkulationsprogramm, lassen Sie eine leere Zeile oberhalb der Daten. In Spalte B dieses leere Zeile (Zeile 1), Typ "LM =" mit der Anzahl der Sehenswürdigkeiten in der Probe. Geben Sie hier "LM = 24" seit 24 Sehenswürdigkeiten wurden (Abbildung 5Aiii, roter Kasten) erstellt.
      4. In der Zeile unterhalb der Datenpunkte, Typ "ID =" mit einem Namen Identifizierung der Probe. Hier in Abbildung 5Aiii, geben Sie "ID = CON1" denn dies ist das Wahrzeichen von Koordinatendaten des ersten Kontrollembryo (Abbildung 5Aiii, roter Pfeil).
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass jeder Embryo wird einen eindeutigen Namen in der "ID =" Zeile angegeben. Hier wird beispielsweise der nächste Satz von Wahrzeichen Koordinaten die ID "CON2" gegeben, da war es der zweite Embryo in der Kontrollgruppe.
      5. Kopieren Sie den gesamten zweiten und dritten Spalte in ein Textdokument und speichern als TXT-Datei.
2. Einrichten der morphometrischen Software zur Datenanalyse (in 5B dargestellt).
   1. Hier wählen Sie Create New Data Set im Hauptmenü in der morphometrischen Software-Programm. Benennen Sie die Datei und die Daten in die entsprechenden Felder gesetzt (zum Beispiel "Retinsäure Hemmung" und "Gesichtswahrzeichen" bezeichnet) in der Pop-up-Bildschirm (Abbildung 5BI). Importieren Sie die Datei als TPS und select die Textdatei von Koordinaten, um die Datenmenge (Abbildung 5BI, roter Pfeil) zu erstellen.
   2. Datenabgleich und Procrustes passen:
      1. Führen Sie eine Procrustes fit und Ausrichtung. Markieren Sie die Daten in der Registerkarte Projektbaum zu setzen, wählen Vorrunde auf der Hauptsymbolleiste, und New Procrustes Fit im Dropdown-Menü.
      2. Wählen Sie Ausrichten von Hauptachse und wählen Sie Führen Procrustes Fit am Boden der Box (Abbildung 5Bii, roter Pfeil). Zurück zu den Vorrundenspielen im Dropdown-Menü wählen Sie Generieren Kovarianzmatrix (Abbildung 5Biii), und wählen Sie Ausführen.
      3. Informieren Sie sich über die Zusammenhänge der Kovarianzmatrix in der Registerkarte Ergebnisse.
   3. Erstellung einer "Klassifikator Datei" von jeder Probe in den Daten an den entsprechenden Klassifizierer Variable Zuordnung zu unterscheiden, ob es in der experimentellen Gruppe und der Kontrollgruppe gehört.
      1. Beschriften Sie zwei Spalten in einer Tabellenkalkulation. Beschriften Sie die Kopfzeile der ersten Kolumnen mit "ID" und geben die gleiche ID für jede Probe gegeben (zum Beispiel CON1, RARINHIB1 usw., Fig 5Biv). Kennzeichnen den Header der zweiten Spalte mit "Behandlung" und Eingabe in jede Zelle der Behandlungsgruppe, die an der Probe in der benachbarten Zelle ID aufgeführt entspricht.
      2. Hier verwenden "CONTROL und RAR-Inhibitor" Etiketten als Klassifizierer (Abbildung 5Biv). Kopieren Sie in eine Textdatei und speichern als TXT-Datei. Import Classifier Variablen in die morphometrischen Software-Programm. Wählen Sie Spiel durch Identifier, und öffnen Sie die Textdatei (Abbildung 5Bv).
3. Erstellen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) Streudiagramm, indem Sie die Variation Dropdown-Menü und wählen Principal Component Analysis (Abbildung 6AI). Als nächstes wählen Sie die Registerkarte Grafik, um drei zusätzliche Registerkarten angezeigt: PC Formänderungen, Eigenwerte, und PC-Scores (Abbildung 6Aii). Der PC Partituren Registerkarte werden die bivariate Hauptkomponentenstreudiagramm der Procrustes fit Landmarkendaten (Abbildung 6Aii).
   1. So ändern Sie die Hauptkomponenten aufgetragen werden, um das Popup-Menü in der Handlung Raum und wählen Sie die gewünschte Achse (Abbildung 6Aiii, roter Pfeil) zu ändern.
   2. Wählen Sie die Farbe Datenpunkte Werkzeug (Abbildung 6Aiii). Wählen Klassifizierer zuvor im zweiten Popup-Menü, das die Farbe der einzelnen Kategorien (Abbildung 6Aiv) zu bestimmen scheint importiert (Abschnitt 5.2.2).
   3. Informieren Sie sich über die Höhe der Varianz von jedem Hauptkomponente in der Registerkarte Ergebnisse (Abbildung 6AV) gefangen genommen. Export Graphen als BMP-Datei.
4. Erstellen Sie eine Unterscheidungsfunktion Analyse (DFA) Transformationsnetz in der morphometrischen Software-Programm, indem Sie Diskriminanzanalyse unter der Vergleich Registerkarte (Abbildung 6BI). Im Popup-Menü, stellen Sie sicher, dass der entsprechende Datensatz selreflektierte und die Art der Daten die Procrustes-fit-Koordinaten.
   1. Markieren Sie die Paare von Gruppen, die verglichen werden, und führen 1.000 Permutationstests (Abbildung 6Bii).
   2. Unter Grafiken sehen die Vektorkarte der Koordinaten in der Formunterschied Registerkarte (Abbildung 6Biii). Wenn das Bild umgekehrt wird, um das Popup-Menü in der Handlung Platz, um das Diagramm in der richtigen Orientierung (Abbildung 6Biii) kippen.
   3. Die Richtung der Vektoren reflektiert den Formunterschied von der ersten Gruppe im Vergleich zu der zweiten, die in der Diskriminanzfunktionskoeffizienten Menü vor dem Ausführen der Analyse (Abbildung 6Bii) angezeigt wird. Um die Richtung der Vektoren umzukehren, um das Popup-Menü in der Handlung Raum und verändern das Zeichen des Skalierungsfaktors, so dass es negativ ist (Abbildung 6Biii, iv). Der Wert der Skalenwert um den Faktor zehn, die am besten repräsentiert die statistischen Unterschiede in Markierungsposition betwee eingestelltn die beiden Gruppen ohne Verzerrung und in der Regel auf den Standard (Fig 6Biv) verlassen.
   4. Auch in der Pop-up-Menü, ändern Sie die Grafik in einer Transformationsnetz, um die Vektoren auf einem Gitter überlagern (Abbildung 6Biii, v).
   5. Geben Sie die Anzahl der horizontalen und vertikalen Linien des Gitters in der Pop-up-Menü (Abbildung 6Biii, v).
   6. Exportieren Sie die Grafik als BMP-Datei.
   7. Sehen Sie sich die Procrustes und Mahalinobis Entfernungen und p-Werte unter der Registerkarte Ergebnisse (Abbildung 6Bvi).
5. Zusätzliche morphometrische Analysen, die nützlich für die Beurteilung der mehr als eine Behandlungsgruppe sind
   1. Erstellen Sie eine Hauptkomponentenanalyse Transformationsnetz. Die PC-Formänderungen Registerkarte zeigt die Vektorkarte von Formänderungen entfallen Varianz innerhalb jeder Probengruppe. Verwenden Sie das Popup-Menü in der Zeichnungsfläche, um das Bild richtig auf eine Transformationsnetz orientieren und überlagern Vektoren. Stellen Sie den Skalierungsfaktorzu dem Wert auf der x-Achse des PC Partituren Diagramm, das dem geschätzten Mitte der Kontrollgruppe entspricht. Exportieren Sie das Bild als BMP-Datei.
   2. Erstellen Sie ein Streudiagramm CVA. Unter dem Reiter-Vergleich auf der Hauptsymbolleiste, wählen Canonical Variate Analysis, und markieren Sie den Klassifikator Variablensatz, die zuvor importiert wurde (siehe Abschnitt 5.2.3). Wählen 1.000 Iterationen für Permutationstests, und wählen Sie Ausführen. Wählen Sie die Registerkarte CV Partituren, die bivariate CVA Streudiagramm anzeigen. Dies wird auf der Grundlage der hochgeladenen Klassifikatoren Farbe codiert. Ändern Sie das Farbschema, indem Sie das Popup-Menü in der Handlung Raum (siehe Abschnitt 5.3.3). Export als BMP-Datei.
   3. Erstellen Sie ein CVA Transformationsnetz. Ein Transformationsnetz der CVA Ergebnisse beim Vergleich mehr als zwei Gruppen erzeugt werden. Unter der Registerkarte Grafik, wählen Sie CV Formänderungen, um die Transformation Raster der Wahrzeichen Koordinaten visualisieren. Rufen Sie das Popup-Menü in der Handlung Raum änderndie Richtung des Vektors, überlagern Ergebnisse auf eine Transformationsnetz, und geben Sie die Anzahl der Rasterlinien. Exportieren Sie die Grafik als BMP-Datei.

Hier wird eine quantitative Analyse der orofacial Größe und Form wurde gezeigt, Embryonen mit einem Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor (RAR-Inhibitor) zu unbehandelten Kontrollen behandelt vergleichen. Embryonen wurden mit einer 1 & mgr; M Konzentration dieser chemischen Inhibitor von Stufe 24 bis 30 (26-35 HPF) behandelt, ausgewaschen und in Stufe 42 (82 hpf) befestigt ist. Sie wurden dann verarbeitet und analysiert, wie in dem Protokoll beschrieben. Ergebnisse sind Originaldaten, aber im Einklang mit Beobachtungen in früheren Publikationen 2,3. Steuer Embryonen wurden mit dem Fahrzeug, DMSO behandelt und normal entwickelt (Fig 7AI, ii). Embryos mit einer 1 & mgr; M Konzentration der RAR-Inhibitor behandelt wurden, zeigten leichte Verengung des Gesichts, Augenanomalien und eine fehlerhafte embryonale Mundöffnung, die mehr dreieckförmige (Fig 7Aiii, iv).

Zuerst wurden herkömmliche orofacial Dimensionen gemessen und sind in Figur 7B zusammengefasst. S TATISTISCHE Signifikanz wurde durch Durchführen der Student-t-Test unter Annahme ungleiche Varianz zwischen Inhibitor behandelten Embryonen und Steuerungen für jede Messung ermittelt. Wir fanden, dass sowohl Schnauze Länge und Flächenbreite signifikant in RAR-Inhibitor behandelten Embryonen verringerte im Vergleich zu Kontrollen (p-Werte = 0,0062 und 0,0058 sind; Abbildung 7bi, ii). Während Gesichtshöhe und Mund Rundheit signifikant erhöht (p-Werte = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), Maulweite signifikant ab (p-Wert = 2,5175 x 10 -10; Abbildung 7Biii-v) .Das Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Gesamt orofacial Bereich zwischen den beiden Gruppen (p-Wert = 0,3754, Fig 7Bvi). Diese Daten zeigen, dass der Verlust von Retinsäure-Signalisierung zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Entwicklungsergebnisse in kürzerer Schnauze, leichte Verengung des Mittelgesichts Region und Fehlbildung der embryonalen Mundöffnung.

Als nächstes wurden die statistischen Unterschiede in der Form der orofacial Bereich zwischen RAR-Inhibitor behandelten Embryonen und Kontrollen bewertet und durch Durchführen einer Diskriminanzanalyse (DFA) visualisiert. Die Procrustes Abstand bwischen den beiden Gruppen war signifikant (distance = 0,2665, p-Wert <0,0001, 7D), die eine Änderung in orofacial Form, wenn Retinsäure Signalisierungs gestört ist. Tatsächlich dramatische Verschiebungen in der Position der seitlichen Grenzsteine ​​in der orofazialen Region deuten auf eine Einengung des Gesichtsform jeweiligen auf die Höhe in Inhibitor behandelten Embryonen (7D). Darüber hinaus ist die leichte Verschiebung nach außen in Position der Nasenmarken (7D, Pfeile) zeigt die Abnormalität in Nasenloch Position in diesen Embryonen, die mit verringerten Auswuchs der Schnauze ist. Die Verschiebungen in Wahrzeichen, die die Ränder der Mundöffnung Show Positionsänderungen, die die Bildung eines dreieckigen Mundöffnung, dass reflektieren zu definieren, ist im Einklang mit der medianen Spalt in unseren früheren Studien 2,3 gemeldet. Zusätzlich zur Vektorverschiebungen, die Schärmuster der Transformationsnetz stellt auch Formänderungen in der oderofacial Region. Verziehen in der Mittelgesichtsbereich ist konsistent mit der Mittelgesichts-Hypoplasie und Gesamtgesichts Verengung in Embryonen mit verminderter Retinsäure Signale (7D) gesehen.

Die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse (EDA) zeigen Formänderungen, die im Einklang mit unserer qualitativen Analyse waren sowie enthüllt einige Änderungen, die nicht ausreichend durch traditionelle Größenmessungen allein gefangen genommen wurden. Zum Beispiel, während die orofacial Bereich war nicht signifikant verschieden zwischen den Kontrollen und Inhibitor behandelten Embryonen (Fig 7Bvi) ergab die DFA Transformationsnetz dramatischen Veränderungen in diesem Bereich in Übereinstimmung mit dem Gesichts Verengung Inhibitor behandelten Embryonen (7A, D) gesehen. Ferner sind die Schärmuster und Wahrzeichen Verschiebungen der Mundöffnung, verbunden mit der erheblichen Veränderung, die wir in den Mund Rundheit sah, veranschaulichen die Fehlbildung der Mundöffnung Form in Inhibitor behandelt embryos. Zusammengefasst, eine Kombination von herkömmlichen Messungen der Abmessungen und geometrischen Gesichts morphometrische Analyse zeigt die Veränderungen in der Form und Größe des Bereichs, wenn orofacial Retinsäure Signale gestört.

Abbildung 1. Benötigte Materialien. (A) Werkzeuge für die Datenanalyse. (I) 24-Well-Platte, (ii) Standardeinmaltransferpipette, (iii) Dumont # 5 Inox Pinzette, (iv) Lehm ausgekleidete Petrischale, (v) gerade teasing Nadel, (vi) Glaspipette-Werkzeug, (vii ) sterile Einwegskalpell. (B) Herstellung des Tons ausgekleidete Schale. (I) Eine gerade Necken Nadel wird verwendet, um horizontale Zeilen in dem Ton zu ziehen. (Ii) Eine Glaspipette-Werkzeug wird verwendet, um kreisrunde Vertiefungen entlang jeder Reihe zu machen. (Iii) Das Gericht wird mit PBT für die Bildgebung gefüllt.

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Abbildung 2. In-vitro-Fertilisation und Kultur von Xenopus Eier. (A) Nach HCG Injektion, laevis erwachsenen Xenopus Weibchen dazu gebracht werden, Eier zu legen. (B) Die Eier werden im hohen Salz MBS Verwendung von Standardverfahren gesammelt, mit Hoden aus einer männlichen extrahiert befruchtet und kultiviert. (C) Die Embryonen werden auf ein übertragenes 24-Well-Schale mit 0,1x MBS mit einem Standard, Einmaltransferpipette. (D) einer kalibrierten Pipette-Mann wird verwendet, um in eine leere gut messen 1 ml, und ein Marker verwendet, um dieses Niveau auf der Außenseite alle Vertiefungen abzugrenzen haltigen Embryonen (kleines Bild). 0,1x MBS wird dann hinzugefügt oder entfernt, so dass es Ebene mit diesem Zeichen ist.

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Abbildung 3: Herstellung von Embryos Köpfe für die Bildgebung. (A) Schematische Darstellung der zwei Einschnitte erforderlich, um Köpfe, solide schwarze Linien zu entfernen. Maßstabsbalken = 400 & mgr; m. (B) Die erste Schnitt am hinteren Ende des Darms, um den Schwanz und Druck vom Skalpells zu entfernen. Maßstabsbalken = 400 & mgr; m. (C) Das zweite Schnitt wird am vorderen Ende des Darms, nahe dem Herzen gemacht, um den Kopf vollständig abzutrennen. Maßstabsbalken = 400 & mgr; m. (D) frontalen Blick auf Reihe Embryo Köpfe in Ton positioniert. Maßstabsbalken = 650 & mgr; m. (E) Seitenansichten Reihe Embryo Köpfe Position in Ton. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m cg: Zementdrüse.

Abbildung 4. Traditionelle Größenmessungen von orofazialen Dimensionen. (A) Ansichtsbreite. Pfeile zeigen die Stelle, wo der ventralen Abschnitt des Auges des Umfangs der Fläche entspricht. Rote Linie ist die Zahnbreite, gemessen als Abstand zwischen diesen Punkten. Maßstabsbalken = 210 & mgr; M. (B) Gesichtshöhe. Weiße Linien sind Führungen vor der Messung an der dorsalen Rand der Augen und der dorsalen Kante des Zementeinführung zu ziehen. Rote Linie ist die Gesichtshöhe, gemessen als Abstand zwischen diesen beiden Führungen an der Mittellinie des Gesichts. Maßstabsbalken = 210 & mgr; M. (C) Orofacial Bereich. Weiße Linien sind Führungen vor der Messung gezogen. (A) Punkt, wo die Bodenführung entspricht dem ventralen Rand des linken Auges. Rote Linie zeigt die Verfolgung rund um das linke Auge. (B) Punkt, wo die dorsalen Rand des Auges trifft das obere Führung. Blaue Linie zeigt die dorsale Grenze des orofazialen Bereich, entlang der oberen Führungs am dorsalen Rand der Augen verfolgt. (C) Punkt, wo die obere Führung trifft den rechten Gesichts Peripherie. Grüne Linie zeigtdie Verfolgung rund um das rechte Auge. (D) Punkt, wo die ventralen Rand des rechten Auges trifft den unteren Führungs. Gelbe Linie zeigt ventrale Grenze des orofazialen Bereich, entlang der unteren Führungs am dorsalen Rand des Zementdrüse zurückzuführen. Maßstabsbalken = 210 & mgr; M. (D) Schnauze Länge. Weiße Linie ist der vordere Rand des Auges und ist als Leitfaden vor der Messung gezogen. Rote Linie ist Schnauze Länge, von dieser Linie bis zu dem Punkt, wo die dorsalen Rand des Zementdrüse trifft den seitlichen Umfang des Gesichts gemessen. Maßstabsbalken = 300 & mgr; M. (E) Maulweite. Arrows sind die Punkte, wo die dorsalen und ventralen Lippen aufeinander. Die rote Linie ist der Maulweite, gemessen als Abstand zwischen diesen beiden Punkten. Maßstabsbalken = 200 & mgr; M. (F) Mouth Rundheit. Der Umfang der Mundöffnung wird zurückverfolgt und in Rot dargestellt. cg: Zementdrüse. Maßstabsbalken = 200 & mgr; M.

Abbildung 5. Capturing Sehenswürdigkeiten und Vorbereitungen für geometrische morphometrische Analyse. (A) Mit Foto-Editing-Software und einem Tabellenkalkulationsprogramm, um Sehenswürdigkeiten und Capture Koordinaten platzieren. (I) Mehrfarbige Kreuze sind die Sehenswürdigkeiten auf dem Bild mit dem Add Punkte Werkzeug in ImageJ, um die Form des orofazialen Region dar gelegt. (Ii) Landmark-Daten unter Verwendung der Ergebnisse anzeigen Werkzeug angezeigt. (Iii) Landmark Daten kopiert und in eine Tabellenkalkulation eingefügt. Oberhalb der zweiten Spalte ist ein Header, die die Anzahl der Sehenswürdigkeiten und durch "LM = 24" (rotes Feld) bezeichnet. Unterhalb der zweiten Spalte der Daten wird die Probe einen eindeutigen Namen gegeben und durch "ID = CON1" (roter Pfeil) bezeichnet. Dies wird für alle Bilder in einem Probensatz wiederholt und die Daten als Textdatei gespeichert. (B) Vorläufige Datenanalyse in einem geometrischen morphometrischen Softwsind Programm. (I) Die Textdatei in der Foto-Editing-Software erstellt wird in die morphometrische Programm MorphoJ importiert, als TPS-Datei. Datei wird von roten Pfeil angezeigt. (Ii) Landmark Koordinatendaten wird durch Procrustes anpassbare Hauptachsen ausgerichtet sind. Rote Pfeil zeigt die Ausführung der Ausrichtung. (Iii) Eine Kovarianzmatrix Procrustes fit Sehenswürdigkeiten in der Vorrunden Menü erzeugt. (Iv) Ein Klassifizierer Datei wird in einer Tabelle erstellt. Spalte A und B sind Überschriften "ID" und "Behandlung", gegeben sind. Die IDs zu jeder Probe in Wahrzeichen der Datenerhebung gegeben werden eingegeben unter Spalte A und der Behandlungsgruppe, zu der jede Probe gehört eingegeben in Spalte B (v) Der Klassifikator Datei wird in die morphometrische Programm als Klassifizierer variablen Satz importiert und Matched durch Identifier für die gewählte Datensatzes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Zahl.

Abbildung 6. Die statistische Analyse in morphometrischen Software. Von der Registerkarte Variation (A) Hauptkomponentenanalyse (PCA) (i) PCA ausgewählt. (Ii) Die ersten beiden Hauptkomponenten Procrustes Sehenswürdigkeiten werden als Streudiagramm auf der Registerkarte PC Partituren angezeigt. (Iii) Ein Popup-Menü wird in der Grundstücksraum gebracht. Dieses Menü wird verwendet, um zu ändern, welche Hauptkomponenten gegeneinander (roter Pfeil) aufgetragen werden und die Datenpunkte (blau markiert) zu färben. (Iv) Die Datenpunkte werden nach den Klassifikator Variablen im Popup-Menü eingefärbt. (V) Prozentsatz der Varianz von jedem Hauptkomponente erfasst wird in dem Register Ergebnisse angezeigt. (B) Diskriminanzanalyse (EDA) (i) DFA aus der Registerkarte Vergleich. (ii) Der Datensatz von Procrustes Koordinaten für DFA ausgewählt und die zuvor hochgeladenen Klassifikatoren für die Gruppierung gewählt. Die gewünschten Gruppen verglichen werden ausgewählt und Permutation Tests ausgeführt werden. (Iii) DFA Ergebnisse werden als Vektorkarte in der Registerkarte Form Differenz angezeigt. Ein Popup-Menü in der Handlung Raum verwendet werden, um das Bild korrekt auszurichten. (Iv) Durch Auswahl der Registerkarte Set-Skalierungsfaktor in der Pop-up-Menü, das Vorzeichen der Skalierungsfaktor kann geändert werden. (V) Die Vektorkarte ist mit einem Transformationsnetz mit der gewünschten Anzahl von Gitterlinien, indem Sie Ändern Sie den Diagrammtyp im Popupmenü der Vektorkarte geändert. (Vi) Die Mahalanobis und Procrustes Entfernungen und entsprechenden p-Werte sind unter dem Register Ergebnisse angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Orofacial Analyse von Steuerungs- und RAR gehemmt behandelten Embryonen. (A) (i, ii) Repräsentative Bilder der Bedienelemente. Maßstabsbalken = 270 & mgr; m. (Iii, iv) Embryos mit einer 1 & mgr; M Konzentration der RAR-Inhibitor, BMS-453 behandelt. Maßstabsbalken = 260 & mgr; m. (I, iii) Frontalansichten. Mundöffnung in rote Punkte dargestellt. (II, IV) Seitenblick. cg:. Zementdrüse (B) Traditionelle orofazialen Dimensionen der Kontrolle (schwarz) und Inhibitor behandelten (blau) Embryonen. (I) Schnauze Länge in mm (ii) Ansichtsbreite in mm (iii) Gesichtshöhe, in mm (iv) Maulweite in mm (v) Mund Rundheit, eine einheitslose Zahl in ImageJ Verwendung der Gleichung bestimmt: (4   ×   [Bereich]) / (π   ×   [Hauptachse] 2). (Vi) Orofacial Bereich, in mm (C) Hauptkomponentenanalyse. Die Kontrollen sind in schwarz und RAR-Inhibitor behandelten Embryonen sind in blau. Schwarze Pfeile zeigen Ausreißer. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Diskriminanzanalyse Anzeigen der Procrustes Entfernung und p-Wert ist, zusätzlich zu einem Transformationsnetz. Geschlossener Kreis Ende des Vektors ist das Wahrzeichen Position in RAR-Inhibitor behandelten Embryonen. Das Ende der Zeile des Vektors ist die Markierungsposition in der Kontrollgruppe. Schwarze Pfeile zeigen Verschiebung Nasen Sehenswürdigkeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.