Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Summary

Der Zebrafisch ist eine hervorragende experimentelle Organismus auf wirbelEntwicklungsProzesse und das Modell menschlichen Krankheit zu studieren. Hier ein Protokoll auf, wie man eine manuelle chemische Bildschirm mit hohem Durchsatz in Zebrafischembryonen mit einer führen beschreiben wir ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) ausgelesen.

Abstract

Zebrafische haben sich zu einem weit verbreiteten Modellorganismus, um die Mechanismen, die Entwicklungsbiologie zugrunde zu untersuchen und menschlichen Krankheitspathologie studieren aufgrund ihrer beträchtlichen Grad an genetischer Erhaltung mit Menschen. Chemische Genetik bringt Testen der Wirkung, dass kleine Moleküle auf einem biologischen Prozess und ist immer eine beliebte Methode, um translationale Forschung therapeutische Verbindungen zu identifizieren. Zebrafische sind speziell attraktiv für für chemische Genetik wegen ihrer Fähigkeit, große Klauen transparent Embryonen, die extern befruchtet werden zu produzieren verwenden. Weiterhin können Zebrafischembryonen leicht Medikament durch die einfache Zugabe einer Verbindung zum Embryo Medien behandelt werden. Verwendung von Vollmontage in situ Hybridisierung (WISH), kann die mRNA-Expression eindeutig in Zebrafischembryonen visualisiert werden. Gemeinsam mit chemischen Genetik und wünschen, wird der Zebrafisch ein potenter gesamten Organismus Kontext, in dem zur Bestimmung der zellulären und physiologischenAuswirkungen von kleinen Molekülen. Innovative Fortschritte bei Technologien, die computerbasierte Screening-Verfahren zu nutzen gemacht, aber für viele Labors solche Optionen nicht zugänglich sind oder bleiben aus Kostengründen. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie Sie ein manuelles Hochdurchsatz-chemisch-genetischen Bildschirm, der grundlegenden Ressourcen erfordert und von einer einzelnen Person oder einer kleinen Gruppe in einem effizienten Zeitperiode erreicht werden auszuführen. Somit stellt dieses Protokoll eine machbare Strategie, die von Forschungsgruppen implementiert werden, um chemische Genetik im Zebrafisch durchzuführen, die nützlich für die Gewinnung grundlegender Einblicke in Entwicklungsprozesse, Krankheitsmechanismen sein können, und neue Verbindungen und Signalwege, die medizinisch relevanten Anwendungen zu identifizieren .

Introduction

Die Identifizierung von wirksamen therapeutischen Medikamenten für die menschliche Krankheit zu behandeln, ist das Endspiel für viele biomedizinische Forscher. Während die Identifizierung und Charakterisierung von potenziellen pharmakologischen Wirkstoffen für klinische Anwendungen hat offensichtliche Wert für das Gesundheitswesen, hat es eine große Herausforderung geblieben. Letztlich ist die Entwicklung von vielen therapeutischen Verbindungen kommt aus dem Wissen über spezifische Zelltypen entweder entwickeln oder Funktion. Der Zebrafisch, Danio rerio, ein Süßwasser Teleost der Cyprinidae Familie, die sich zu einem Mainstream-Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie ¹ hat. Zebrafische sind genetisch manipulierbaren Wirbeltiere, die leicht für wissenschaftliche Studien ^2,3 zu erhalten und zu manipulieren sind. Die Zebrafischembryo ist transparent, extern befruchtet und können durch die Hunderte von einem einzigen erwachsenen Paarung Paar in nur einer Woche ^2,3 hergestellt werden. Außerdem Zebrafisch Aktien wichtige Organsysteme und besitzen eine große degree der genetischen Ähnlichkeit mit Säugetieren, einschließlich Menschen ^4. Auffallend ist, dass 70% der menschlichen Gene haben einen Zebrafisch Ortholog ^4. Aufgrund dieser Ähnlichkeit haben Zebrafisch ein sehr relevant Versuchssystem für die Untersuchung der Mechanismen der Entwicklung von Wirbeltieren und Physiologie und verwendet worden, um eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen ^5-7 zu wiederholen. Diese Gründe, unter anderem haben die Zebrafisch ein idealer Kandidat für die Fortsetzung genetische Vernehmungen gemacht und in einer stetig wachsenden Wertschätzung für die Nützlichkeit der Zebrafisch in der biomedizinischen Forschung ^6,7 geführt.

Im Laufe der letzten Jahrzehnte haben eine Fülle von genetischen Werkzeugen im Zebrafisch entwickelt. Der Zebrafisch Genom zugänglich Mutagenese und Transgenese ^3. Bisher eine Vielzahl von Vorwärts- und Rückwärts genetische Studien wurden durchgeführt, was zu der Erzeugung von mehr als 9.000 Mutanten ^3. Außerdem haben zahlreiche transgenen Linienen erstellt, die bei der Kennzeichnung und Isolierung von spezifischen Zelltypen ³ aktiviert haben. Es gab signifikante laufenden Bemühungen zu zentralisieren und zu verteilen, diese Ressourcen für die Forschung, die auf einem relativ niedrigen Kosten durch den Zebrafisch Internationale Resource Center (ZIRC) ⁸ für Laboratorien zugänglich sind. Ferner ist eine umfangreiche Sammlung von biologischen Informationen und molekulare Werkzeuge, angefangen von Genexpressionsmustern, Sequenzen und Protokolle Morpholino, wurden schrittweise auf dem Zebrafisch Information Network (ZFIN) ^9-11 annotiert. Diese Zebrafisch Forschungsinfrastrukturen sind durch erhebliche NIH Unterstützung und Interessenvertretung dieses Tiermodells ⁸ ermöglicht. Dieser Cache von Zebrafisch-Mutanten, transgenen Linien und relevante Informationen weiterhin von außergewöhnlichem Wert auf die biologische Forschung Gemeinschaft zu groß sein. Doch während Zebrafisch sind jetzt eine gut etablierte und herausragende Modellorganismus, sie a la darstellenrgely ungenutztes Reservoir zur Entwicklungsbiologie und Krankheit durch den Einsatz von chemisch-genetischen Bildschirme zu studieren.

Chemische Genetik ist die Verwendung von kleinen Molekülen, wie beispielsweise Arzneimittel oder andere Verbindungen, um einen biologischen Prozess in einem lebenden System ¹² beeinflussen. Chemische Genetik kann implementiert werden, um die molekularen Mechanismen der Gen-Funktion zu verstehen, wie Agenten zu identifizieren, dass die Rettungs oder verstärken einen bestimmten genetischen Defekt ¹² werden. Ferner stellt chemische Genetik eine große Allee, um translationale Forschung ¹² durchzuführen. Während traditionelle Vorwärts genetischen Screens in Tiermodellen haben enorm mächtig in Verknüpfung spezifischer Gene für Krankheiten gewesen, fehlt ihnen eine zeitliche Dimension, so dass es schwierig oder manchmal unmöglich, Phänotypen, die nach der frühen Embryogenese entstehen würden beobachten. Zusätzlich kann Gen Redundanz machen die aus Termin Genetik beobachteten Ergebnisse schwer zu interpretieren. Alternativ chemische genetischen Screensermöglichen feine zeitliche Kontrolle und gleichzeitig ein wertvoller Ausgangspunkt für die Wirkstoffforschung ^12,13.

Chemische Genetik können mit in vitro-Systemen (zB Zelllinien, Proteine), oder unter Verwendung eines in vivo-System, wie einem ganzen Organismus durchgeführt werden. Verwendung eines in vitro-System für die chemische Genetik kann vorteilhaft sein, weil es einfacher ist, als eine ganze Organismus System leichter arbeiten mit großem Maßstab, weniger kostspielig und weniger zeitintensiv. Als Ergebnis ermöglicht in vitro-Systeme für sowohl Hochdurchsatzscreening (HTS) und High-Content-Screening (HCS). Es gibt eine Reihe von Vorteilen für die Verwendung eines in vitro-System, das betrachtet werden soll, wenn Annäherung chemische Genetik, sondern auch erhebliche Einschränkungen. Eine große Einschränkung der Verwendung einer Zelllinie ist, dass kleine Moleküle wirksam und nicht toxisch in einer bestimmten Zelllinie sein, dennoch toxisch, wenn sie in einem ganzen Organismus ein. Damit ist der springende Punktder Punkt ist, dass in vitro-Systemen nicht die breiten Kontext eines Organismus zu erfassen und sind daher nicht immer in der Lage, genau zu imitieren, was in einem ganzen Organismus passiert. Während Testverbindung in ganzen Organismen können diese Probleme zu umgehen, ist die Verwendung von Säugetier gesamten Organismus Modelle stellt eine Anzahl von physikalischen und ethischen Einschränkungen. Beispielsweise Arzneimittel-Screening in Maus logistisch durch den Raum und Kosten benötigt, um eine ausreichende Stichprobengröße testen behindert. Außerdem kann der Entwicklungs Fragen schwer zu studieren, aufgrund der Tatsache, dass Säugetiere in utero entwickeln. Schließlich, während das Verhalten der biomedizinischen Forschung hat immense gesellschaftliche Bedeutung, gibt es doch erhebliche Anforderungen an den Tierschutz durch Begrenzung intensiven Studien und Linderung der Schmerzen und Leiden der Tiere für die Forschung verwendet zu schützen. Zebrafisch eine tragfähige Ersatz für die Arbeit mit höheren Wirbeltiere wie Säugetiere, und darüber hinaus können viele Themen mit chemischen Genetik an untersucht werdendie embryonalen und Larvenstadien, wenn neurologische Verarbeitung fehlt oder operative auf niedrigem Niveau ^12,13.

Bisher eine Vielzahl von chemischen genetischen Screens wurden durchgeführt unter Verwendung Zebrafischembryonen insbesondere als Verbindung Lieferung kann durch Eintauchen Embryonen in Medien, enthaltend das Arzneimittel von Interesse ^12-15 erreicht werden. Ferner gab es zahlreiche wissenschaftliche und technologische Fortschritte chemische genetischen Screens möglich und überschaubar ^16-20 zu machen. Peterson und Kollegen waren die ersten, Zebrafisch in einer chemisch-genetischen Bildschirm nutzen im Jahr 2000 und später im Jahr 2004 identifizierte eine Verbindung, die eine Aortenisthmusstenose Mutation im Zebrafisch ^21,22 drückt. Chemische Bildschirme sind seit implementiert worden, um mehreren Entwicklungs Geweben (zB die Herz, Blut, Gefäße) ^23-25, physiologische Funktionen (zB neurologische Grundlage für Verhalten) ^26, erwachsener Regeneration ^27,28 und diseas studieren e-Modellen (zB Muskeldystrophie und Krebs) ^29,30. Von diesen Zebrafisch chemische Bildschirme, hat die Entdeckung, dass Prostaglandine regulieren hämatopoetischen Stammzellen zu klinischen Studien beim Menschen getroffen worden, was die Leistung, die von "Tank to bedside" bewegen ^23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). In jüngerer Zeit haben vielversprechender Kandidat Therapeutika für komplexe Organe wie Niere, die zelluläre Pathologie bei polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) ³⁴ und akutem Nierenversagen ^27,35 sanieren entstanden, obwohl diese noch nicht zu klinischen Studien zu bewegen. Diese chemischen genetischen Screens breit zeigen die Nützlichkeit der Prüfung kleiner Verbindungen in den Entwicklungszebrafisch und die Fähigkeit, chemische Genetik gelten für erwachsene Gewebefunktion zu verhören. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von im Handel erhältlichen Pharmakologie Sammlungen, die für ein Studium ¹⁹ zur Verfügung stehen.

ove_content "> In den letzten Jahren gab es Fortschritte in der chemischen prominente genetischen Screening-Technologie, einschließlich der Verwendung von automatisierten Systemen von Robotern für die Arzneimittelabgabe und Handhabung sowie automatische Abbildungssysteme ^36-38. Derartige Systeme erlauben die Möglichkeit, Testen viele Tausende von Verbindungen sowohl HTS und HCS ^36-38 zu erreichen. Leider ist die Verpflichtung von chemischen genetischen Screens mit diesen innovativen Roboter Unternehmen benötigen in der Regel erhebliche Ressourcen. Diese Arten von Ressourcen sind ein großes Hindernis für viele Unternehmen, die der Hauptstadt fehlt zum Erwerb , Betrieb und Wartung solcher Instrumente. Während die Gründung der Infrastruktur für Robot-chemischer Bibliotheken, einschließlich der Übertragung der Embryonen zu Platten angeordnet sind, bleibt unerschwinglich für viele Labors, Automated Imaging und Analyse ist in der Regel leichter zugänglich ^12. Automatisierte Bild Screening ermöglicht die Quantifizierung fluoreszierender transgenen reGepäckträger und erleichtert bestimmte phänotypische Analyse ^12,15.

Obwohl automatische Systeme stellen nützliche technologische Fortschritte, kann viele Fragen durch gezieltere manuelle Bildschirme angesprochen werden, wie die Abfrage von mehreren tausend biologisch aktiven Verbindungen auf einem Entwicklungsprozess mit einer ganzen-mount in situ Hybridisierung (WISH) Auslese ^39. Während ferner eine zunehmende Anzahl von Laboren haben Zebrafisch chemische Bildschirme aufgerufen, um eine Forschungsfrage zu untersuchen, wenige (wenn überhaupt) Bemühungen Sättigung erreicht und viele Themen sind noch nicht mit chemischen Genetik durchbrochen werden. Chemische Bildschirme können mit einem kleinen Zebrafisch Kolonie aus nur wenigen transgenen Wildtyp oder Tanks ausgeführt werden. Daher sollte diese Form der genetischen Verhör erreichbar von den meisten Zebrafisch Forschungsgruppen in den Ausbau / Diversifikation in dieser Arena. Chemischen Bibliotheken unterschiedlicher Größe können von einem kommerziellen Händler und / oder col beschafft werdenlaborators. Aus diesen Gründen kann die chemische Genetik auch in rauen Klimazonen Finanzierung wirtschaftlich machbar sein. Allerdings gibt es Hürden zu Beginn einer chemischen Genetik Bildschirm, wie, wie man logistische Aspekte der Bildschirm zu planen: zB die Zahl der Mitarbeiter für eine erfolgreiche Bildschirm benötigt, die Zuteilung von engagierten Zeit und Zusammensetzen eine physische Protokoll manuell Prozessproben diese Zahl von den hundert bis mehreren tausend. Hier haben wir ausführlich ein manuelles Hochdurchsatz-Protokoll, um chemische Genetik im Zebrafischembryo mit WISH als Auslesezuführen. Dieses Verfahren beinhaltet medikamentöse Behandlung von Zebrafischembryonen, gefolgt von Riboprobe Nachweis von mRNA-Transkripten. Mit diesem Protokoll, ein kleines Team oder sogar ein Einzelperson angemessen zu screenen und zu analysieren, ein bescheidener chemischen Bibliothek etwa 600 Verbindungen in der Spanne von 9 Wochen.

Protocol

Die Verfahren für die Arbeit mit hier beschriebenen Zebrafisch wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Notre Dame genehmigt. Ein Führer durch die Forschungsdesign für dieses Handbuch kleines Molekül Bildschirm in der Zebrafisch wird (Abbildung 1). Eine Übersicht über die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist als Flussdiagramm (Figur 2) vorgesehen. Bitte beziehen Sie sich auf das Beispiel Kennzeichnungssystem (Abbildung 3), die in den Teilen 4-10 beschriebenen Embryo Verarbeitungsschritte zu planen. Für die Inszenierung von Embryonen, finden Sie in der Zebrafisch-Staging-Serie ⁴⁰ beziehen, und zur Herstellung von Antisense-WISH Ribosonden in Parts 9-10 verwendet, beziehen sich auf kürzlich veröffentlichte Methoden ^41.

1. Herstellung von Zebrafisch-Mating Chambers

1. Ein erwachsenen männlichen Zebrafisch und eine erwachsene weibliche Zebrafisch in einen passenden Kammer, durch die Kammerteiler O / N getrennt.
   HINWEIS: Massen Paarungen, wie eins jene mit Gruppen von 2-3 Weibchen und 2-3 Männchen können mehr Embryonen im Vergleich zu Single gepaart Paarungen erzeugen, und kann mit geeigneter Größe Paarungskammern durchgeführt werden.
2. Wiederholen Sie Schritt 1.1, so dass insgesamt 25 Paare von Zebrafisch sind Set-up für jeden 96-Well-Platte von kleinen Molekülen, die getestet werden sollen.

2. Sammlung von Zebrafischembryonen

1. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Trennlinie, die jeden Fisch Paar trennt und nach 1 Stunde, sammeln Zebrafischembryonen mit einem feinmaschigen Sieb und legen Sie sie in eine Petrischale mit E3 Embryo Medium (siehe Materialliste für Rezept).
   HINWEIS: Sammeln Embryonen nach 1 Stunde gewährleistet, dass Embryonen zu ähnlichen Entwicklungsstadien.
2. Verwenden Sie einen Kunststoff Transferpipette, um Schmutz (zB Essen und feste Abfallstoffe) zu entfernen. Als Nächstes verwenden Sie ein Stereomikroskop, jede Kupplung von Embryonen zu beobachten und entfernen Sie alle unbefruchteten Eiern.
3. Dekantiert die E3 Embryo Medien und ersetzen mit frischen E3, dann legen Sie jedes dish von Embryonen in einem 28,5 ° C Inkubator. Nach 2 Stunden zu beobachten jede Kupplung von Embryonen mit einem Stereomikroskop und keine unbefruchteten Eiern zu entfernen.
   HINWEIS: unbefruchteten Eiern können andere Embryonen zu vergiften und wird angezeigt, um auf Einzelzellstadium oder undurchsichtig sein.
4. Fahren Sie mit dem Entwicklungsfortschritt der Embryonen mit einem Stereomikroskop bis sie epiboly erreichen 40% zu überwachen. Beachten Sie die Kugelform des Embryos, die aus zwei getrennten Schichten an der 40% epiboly Stufe ⁴⁰ zusammen sieht.

3. Chemische Verdünnungs Vorbereitung

1. Entfernen Sie die chemische Bibliothek Platte von Lagerung bei -80 ° C, bedecken Sie es mit Aluminiumfolie und tauen es bei RT.
   HINWEIS: Unterschiedliche Bibliotheken werden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit vor allem von der Lösungsmittel auftauen verwendet. Typischerweise wird eine chemische Bibliothek bei -80 ° C eingefroren wird komplett in ca. 3 h bei RT aufgetaut werden. Shop Auftauen Platte (n) an einem sicheren Ort mit entsprechenden Gefahrgutkennzeichnung. Tragen Sie eineppropriate Brillen, ein Laborkittel, und zwei Sätze von Handschuhen beim Umgang mit Chemikalien.
2. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Mehrkanalpipette auf 99 ul E3 in Spalten 2-12 eines 96-Well-Platte hinzuzufügen.
   HINWEIS: Aus unserer Erfahrung ist eine angemessene beginnend Drogenbereich zwischen 10 & mgr; M - 50 um, und auch, wie in aktuellen Protokolle ³⁹ beschrieben. Hier zeigen wir eine 10 um Behandlung, wenn mit einer 1 mM chemischen Bibliothek stock Platte.
3. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Mehrkanalpipette auf 1 & mgr; l von jeder Verbindung zu seinem jeweiligen gut mit E3 hinzuzufügen.
4. Verwenden Sie ein P10 bis 1 ul DMSO (oder den entsprechenden Lösungsmittel) in die Steuersäule (hier, Spalte 12) pipettieren.
5. Decken Sie die chemischen Verdünnungsplatte mit Aluminiumfolie, wie die Aluminiumfolie wird keine lichtempfindlichen Verbindungen in der Bibliothek zu schützen, und schicken Sie das Lager chemischen Bibliothek Platte an die -80 ° C für die Lagerung.

4. Arraying Zebrafischembryonen

1. Wählen Sie eine Petrischaleenthält Zebrafischembryonen im 40% epiboly Bühne. Mit einem Transfer Pipette vorsichtig platzieren etwa 10 Embryonen im Inneren jede Vertiefung einer (1,1 ml) tief 96-Well-Platte. Dispense Embryonen in Spalten 2-12 der tiefen 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Der Forscher sollte den Zeitpunkt der Drogenabhängigkeit, die am besten zu dem Entwicklungsprozess sie verhören wollen zugeschnitten ist auszuwählen. Verwendung eines Kunststofftransferpipette kann Embryo Schaden zu minimieren. Seit medikamentöse Behandlung vor 40% epiboly können zu erhöhten Embryoletalität führen, entwickeln die Embryonen länger vor der Arzneimittelexposition, vor allem, wenn später Entwicklungsprozesse werden geprüft. Anzeige mehr als 15-20 Embryonen in jeder Vertiefung können zu Entwicklungsverzögerung aufgrund Verdrängung und sollte vermieden werden führen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Tiefe 96 Well-Platte, die die Embryonen unterscheidet sich von der chemischen Verdünnungs 96-Well-Platte.
2. Verwenden Sie einen Glastransferpipette, um überschüssige E3 entfernen aus jeder Vertiefung und vertreiben die überschüssige E3 inein flüssiges Abfallbehälter.
   HINWEIS: Dieser Vorgang dauert typischerweise 30 min bis 1 h, je nach Geschwindigkeit des Forschers, so die Embryonen zwischen 50% und 60% epiboly durch Fertigstellung, die das Ziel der Entwicklungsstufe zur Zugabe der hier beschriebenen chemischen Verdünnungs ist. Die Platte in einem 45 ° Winkel gekippt werden, damit die Embryonen auf dem Boden des Bohrlochs fallen, so daß die Spitze der Pipette gegen den Boden der Vertiefung gepreßt zum Abziehen der überschüssigen E3 werden.

5. Zugabe von chemischen Behandlungen

1. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Mehrkanalpipette, die 100 ul chemischen Verdünnungen zu ihren jeweiligen Brunnen in der tiefen Platte mit 96 Vertiefungen angeordnet Zebrafischembryonen zu übertragen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Original gut Lage der Verbindung übereinstimmt mit dem gut Lage in der entsprechenden tiefe 96-Well-Platte (zB die B1 gut Lage in der chemischen Verdünnungsplatte wird in die B1 gut Lage im tiefen pipettiert96-Well-Platte).
2. Befeuchten Sie ein Papiertuch und legen Sie sie in einem lichtempfindlichen Behälter groß genug, um eine 96-Well-Platte zu halten.
   HINWEIS: Die nassen Papiertuch wird verhindert Verdampfen des chemischen Verdünnung.
3. Weiter, verwenden Sie eine Dichtungsmatte, um die tiefe 96-Well-Platte zu versiegeln, legen Sie sie in die lichtempfindliche Behälter, und inkubieren sie bei 28,5 ° C.
   HINWEIS: Lassen Sie die Zebrafischembryonen entwickeln bis zum nächsten Morgen. Alternativ lassen sich die Embryonen entwickeln, bis die entsprechende Entwicklungsstufe für den Prozess analysiert.

6. Entfernen von Chemikalien

1. Einen 8-Kanal Mehrkanalpipette zu 300 ul E3 zu jeder Zeile der Arzneimittel-behandelten Vertiefungen hinzu. Abziehen und entsorgen Sie die E3 / chemische Verdünnung von jeder Reihe von Brunnen. 3-mal mit 300 ul E3 Waschen der Embryonen.
   HINWEIS: Entsorgen drogen Abfälle in einem beschrifteten Behälter nur für diesen Zweck verwendet. Zur Erleichterung der Wäschen, verwenden Sie ein Glasbecken mit E3 gefüllt breit genug, um die mult verwendeniChannel Pipette.

7. Pronase und Beheben von Zebrafischembryonen

1. Übertragen Zebrafischembryonen mit einem Kunststofftransferpipette in vier 24-Well-Platten, dann entfernen Sie alle toten Embryonen. Beschriften Sie die 24-Well-Platten, so dass sie auf die ursprüngliche Medikament gut Stellen entsprechen. Platzieren Sie die Pipette vor einem dunklen Hintergrund nach jedem gut Transfer von Embryonen in der Pipette zu visualisieren und Embryo auch Crossover zu verhindern.
2. Verwenden Sie einen Kunststoff Transferpipette zum Abziehen E3, so dass die Embryonen kaum in Flüssigkeit eingetaucht.
3. Verwenden Sie eine Glaspipette bis 2 Tropfen Pronase Lager (50 mg / ml) in jede Vertiefung hinzufügen. Lassen Embryonen inkubiert in Pronase für 5 min und dann rühren die Brunnen, um zu bewirken das Chorion auseinander zu brechen. Alternativ Pronase die Embryonen, bevor sie an der gewünschten Entwicklungsstufe zur Analyse.
4. Verwenden Sie einen Kunststoff Transferpipette, um die Embryonen zweimal mit E3 waschen.
5. Sobald die Embryonen im gewünschten Stadium der Analyse, completely abziehen und entsorgen Sie die restlichen E3.
6. Verwenden Sie einen Kunststoff Transferpipette an die frische 4% PFA / PBS in jede Vertiefung hinzufügen. Die Embryonen bei 4 ° CO inkubieren / N zu beheben. Verwenden Sie frisch aufgetauten PFA zunächst beheben Embryonen.
   HINWEIS: Fahren Sie mit Ihrem Bildschirm Assay von Interesse durchzuführen. Hier in den Abschnitten 8-10 Detaillierte ist ein Verfahren, um Bildschirmplatten mit WISH verarbeiten. Alternative Methoden können ersetzt werden, wie gewünscht, dann nach § 11 vorzugehen und die Ergebnisse zu bewerten.

8. Embryo Permeabilisierung

1. Verwenden Sie einen Kunststoff Transferpipette aus den Embryos Abzugs die 4% PFA / PBS und waschen Sie die Embryonen zweimal mit 1x (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween) PBST. Übertragen Sie die Embryonen in 48-Well-Platten, dann ziehen Sie die 1x PBST aus den Embryonen. Beschriften Sie die 48-Well-Platten, um die ursprünglichen und Standorte der tiefen 96-Well-Platte passen.
2. Waschen durch Zugabe von 100% Methanol in die Vertiefungen mit einem Kunststofftransferpipette dann ziehen sie ab und fügen Sie 100% methanol erneut auf die Embryonen.
3. Legen die Embryonen bei 20 ° C und Inkubation für mindestens 20 min. Alternativ halten die Embryos in 100% Methanol bei -20 ° C für die langfristige Lagerung.
4. Entfernen Sie die 100% Methanol und waschen Sie die Embryonen mit 50% MeOH / 1x PBST, dann 30% MeOH / 1x PBST und schließlich zweimal mit 1x PBST.
   HINWEIS: Die Embryonen, die älter als 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) kann an dieser Stelle gebleicht werden, um die Pigmentierung ³⁹ zu entfernen.
5. In 15 ul aufgetaut Proteinase K Lager (10 mg / ml) zu 50 ml 1x PBST einen Proteinase K (5 ug / ml) Arbeitslösung herzustellen.
6. Entfernen Sie die 1x PBST von den Embryonen und fügen Sie die Proteinase K-Arbeitslösung. Entfernen Sie die Proteinase K nach 4 min.
   HINWEIS: Der Experimentator sollte bei diesem Schritt um Embryo Abbau zu verhindern schnell arbeiten. Proteinase K-Konzentration und Inkubationszeit benötigen, abhängig von dem Alter der behandelten Embryonen ⁴¹ variiert werden. Die hier beschriebenen Parameter beziehen sich auf Embryonender 24 hpf sind.
7. Waschen Sie die Embryonen mit 1x PBST, dann fügen eiskaltem 4% PFA / PBS. Lassen Sie die Embryonen inkubiert in 4% PFA / PBS für 20 min bei RT.

9. Hybridisierung und Sondenentnahme

1. Mit einem Glas Transferpipette entfernen Sie die 4% PFA / PBS und waschen Sie die Embryonen zweimal mit 1x PBST. Ersetzen Sie die 1x PBST mit 500 ul HYB ⁺ und Inkubation der Embryonen für 4 h bei 70 ° C.
   HINWEIS: Pre-Hybridisierung kann für so wenig wie 2 h durchgeführt werden, aber 4 Stunden ist ideal. Auch können verschiedene Hybridisierungs- und Waschtemperaturen ideal für bestimmte Sonden, wie beispielsweise 65 ° C, sollte aber im Einzelfall getestet werden.
2. Erzeugen, Digoxygenin-markierten Ribosonden entsprechend der Gen (e) von Interesse ^41.
3. 16 ug Ribosonde zu 16 ml HYB ^+. Pre-warm die Ribosonde / HYB ⁺ Lösung bei 70 ° C für mindestens 20 min vor der Verwendung. Bei Verwendung mehrerer Sonden, fügen 16 ug jeder Sonde auf den gleichen HYB ⁺ Volumen (16 ml).
4. Unter Verwendung eines Glastransferpipette, entfernen Sie die HYB ⁺ und verwenden Sie einen P1000 auf 200 ul der Ribosonde / HYB ⁺ Mischung hinzufügen. Kehren Sie die Ribosonde / HYB ⁺ Cocktail direkt vor der Verwendung und Pipetten oben und unten einmal, bevor Sie die Mischung in jede Vertiefung. Verwenden Sie Barriere-Pipettenspitzen, um die Ribosonde / HYB ⁺ Mappe hinzufügen, verhindert dies die Mischung Dampf in die Pipette.
5. Die Embryonen in der Ribosonde / HYB ⁺ Cocktail Inkubation bei 70 ° CO / N. Verwenden eines Klebefilms auf die Plattenvertiefungen für die O / N-Sonde inkubiert und alle folgenden heißen Waschungen abzudecken.
6. Bereiten Sie 50% Formamid / 2x SSCT-, 2x SSCT- und 0,2x SSCT- und Pre-warmen bei 70 ° CO / N.
7. Mit einem P1000, entfernen Sie die Ribosonde / HYB ⁺ und speichern Sie die Mischung bei -20 ° C. Optional Wieder verwenden Riboprobe / HYB ⁺ Mischung bis zu dreimal. Vor jeder Wiederverwendung, fügen Sie in 3 ug Riboprobe zum Original riboprobe / HYB ⁺ Mischung.
8. Verwendung einer Glasüber Pipette waschen Embryonen zweimal mit 50% Formamid / 2x SSCT für 30 min bei 70 ° C. Einmal zu waschen die Embryonen mit 2x SSCT für 15 min bei 70 ° C. Zweimal waschen mit 0.2x die Embryonen SSCT für 30 min bei 70 ° C. Entfernen Sie die 0.2x SSCT- und waschen Sie die Embryonen mit MABT zweimal bei RT.

10. Anti-Digoxigenin Antikörper Inkubation und Nachweis

1. Verwenden Sie einen Glastransferpipette, die MABT aus jeder Vertiefung entfernen. Mit einem Kunststofftransferpipette, fügen frische Blocklösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Embryonen inkubiert in Block 4 h bei RT. Hinzufügen 8 ul anti-Digoxygenin-Antikörper zu 40 ml Blocklösung (5.000-fache Verdünnung).
2. Mit einem Kunststofftransferpipette, ersetzen Sie den Block-Lösung mit dem Antikörper / Blocklösung. Fügen Sie genug Antikörper / Blocklösung, um die Embryonen vollständig zu bedecken.
3. Decken Sie die 48-Well-Platte mit Aluminiumfolie, so dass kein Licht durch, um die Embryonen zu durchdringen. IncUbate die Embryonen O / N bei 4 ° C. Mit einer Glaspipette, entfernen Sie die Antikörper / Blocklösung und waschen die Embryonen 10 mal mit MABT für jede 5-10 min.
   HINWEIS: Die MABT Wäschen kontinuierlich durchgeführt werden, wie es die Forscher 5-10 min dauern MABT in die Vertiefungen zu entfernen von jeder Platte und verzichten frischen MABT.
4. Generieren Sie zwei Röhren von 40 ml (80 ml gesamt) vorge Färbepuffer. Fügen 180 ul NBT (50 mg / ml) und 140 ul BCIP (50 mg / ml) zu einer der vorbereiteten Röhrchen vorge Färbepuffer um die Färbelösung zu erstellen.
   HINWEIS: Diese Farblösung wird ein lila farbigen Substrat zu erzeugen.
5. Ersetzen Sie die MABT mit vorge Färbepuffer und lassen die Embryonen Inkubation bei RT für 5 min.
6. Ersetzen Sie den Pre-Färbepuffer mit der Farblösung und lassen bei RT. Überwachen Sie die kolorimetrische Reaktion alle 15 min mit einem Stereomikroskop.
   HINWEIS: Die Färbung Reaktionen kann von einigen Minuten bis zu vielen Stunden, abhängig von der Sonde zu nehmen.
7. Ripsschnüren die Färbelösung mit 1x PBST nachdem die Färbereaktion ist komplett und dann waschen Sie die Embryonen zweimal mit 1x PBST für 5 min.
8. Entfernen Sie die 1x PBST und fügen 4% PFA / PBS, um die Embryonen zu beheben.
   HINWEIS: Alternativ führen eine Doppel WISH Ribosonden mit einem Anti-Fluorescein-Antikörper markiert erfassen. Bei Durchführung einer Doppel in situ, überspringen Zugabe von 4% PFA / PBS (Schritt 10.9) nach dem 1x PBST waschen (Schritt 10.8) und waschen Sie die Embryonen zweimal für 15 min mit 0,1 M Glycerin, zweimal für 15 min mit MABT wäscht und dann bebrüten die Embryonen für 30 min in Block. Dann fügen Sie auf dem richtigen Antikörper O / N und führen Sie die Schritte 10,3-10,9 mit dem richtigen Farblösung. Zum Nachweis der Fluorescein-markierten Ribosonde, bereiten eine Färbelösung mit BCIP und INT zu einem roten Substrat zu beobachten (siehe Schritt 10.1).

11. Scoring der chemischen Bildschirm Embryo Plates

1. Führen visuelle Scoring der Ergebnisse mit einem Stereomikroskop, um den Embryo sampl bewertenes im Phänotyp-Assay.
2. Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen aus den 48-Well-Platten bis 12-Well-Platten für eine optimale Visualisierung. Beschriften Sie die 12-Well-Platten, so dass sie zu den gut Standorten von der ursprünglichen tiefen 96-Well-Platte entsprechen. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, sehen Sie unter dem Stereomikroskop.
   HINWEIS: Repräsentative Embryonen können aus 12-Well-Platten ausgewählt und auf Glasobjektträger unter einem Deckglas ⁴¹ abgebildet werden.

Results

Die hier beschriebene manuelle Ansatz ermöglicht eine einzelne Forscher, eine Hochdurchsatz-Kleinmolekül chemische Genetik Bildschirm mit dem Zebrafischembryo Modell (Abbildung 1) effizient und erfolgreich durchzuführen. Mit dieser Methode ist es sinnvoll für eine einzelne Person, eine chemische Genetik Bildschirm durchführen, so dass im Laufe der 9 Wochen eine Person (mit einem 40 Stunden-Woche begangen) kann die Durchführung einer Befragung von ~ 600 Verbindungen (Abbildung 1) . So kann die Bank Zeit von einer Person die Notwendigkeit hoher Ressourcen anspruchsvolle Ausrüstung, wie automatisierte Systeme zu umgehen. Die Trade-off ist, dass eine manuelle Bildschirm erfordert mehrere Wochen engagierten Einsatz. Im Gegensatz dazu kann der Einsatz von automatisierten Systemen die Zeit in 1-2 Wochen von Roboterzeitaufwand zu komprimieren und kann relativ gering Forscher Aufwand insgesamt mit sich bringen. Ein Weg, um die Effizienz und / oder Umfang eines Hand Bildschirm erhöhen, ist die 2-3-Forscher insgesamt zu gewinnen, welche Überprüfungen m ermöglichen würdeore Verbindungen unterschiedlicher Konzentration der Verbindung und / oder Screening über einen kürzeren Zeitraum.

Die ersten Schritte in dem Protokoll beteiligt, um eine chemische Genetik Bildschirm in Zebrafischembryonen mit einer Wunschauslese vervollständigen werden als Flussdiagramm (Abbildung 2) veranschaulicht. (1) Chemikalienexposition und Embryo Etikettierung, und (2) Analyse und Bildgebung: Die experimentellen Aufgaben können in zwei Arten von Arbeitswochen aufgeteilt werden. In der chemischen Exposition Arbeitswoche, diese Schritte sind die Einrichtung von Zebrafisch Erwachsene (Tag 1), Embryo-Entnahme, Anordnen Embryonen und medikamentöse Behandlung (Tag 2), die Vorbereitung von Embryonen für in situ Hybridisierung (Tag 3) und in situ Hybridisierung (Tag 4 -6). In der Analyse / Imaging Woche der Forscher analysiert mRNA-Expression, Embryonen und Bild Treffern (Tag 7-11) punkten.

Ein wichtiger Bestandteil der Durchführung einer chemischen Genetik Bildschirm ist, konsequent und genau gut beschriften Standorten. Als chemische Genetik Bildschirm process detailliert hier schließt das Übertragen von Sätzen von Embryonen aus einem Bohrloch in einer Platte zu einer gut in einer anderen Platte mehrere Male, ist die Notwendigkeit, genaue und klare Markierung entscheidend, so dass, wenn eine chemische Treffer erzielt sie linear und leicht zurückverfolgt ihre Identität innerhalb der chemischen Bibliothek (Figur 3). Eine einfache Möglichkeit, dies zu gewährleisten ist, die Platten in einer Weise, dass zu jeder Zeit die gut Standort für eine Reihe von Embryonen von einer Verbindung behandelt direkt die chemischen Bibliothek Drogenplatte auch Standort der verwendet, um jene Embryonen behandeln Verbindung passt zu beschriften (Abbildung 3). Hier wird eine duale Farbcodierung und numerischen Markierungen verwendet, um die Proben, die mit den Siebplatten mit Filzstiften (Figur 3) wurden zugegeben zu organisieren.

Bei der Analyse der Ergebnisse einer Hochdurchsatz-Screening, gibt es eine kritische Notwendigkeit, ein Verfahren zu entwickeln, um vollständig organisieren, zu kommentieren und analysieren Potential kleines MolekülHits. Daher muss eine chemische Genetik Bildschirm haben eine gründliche und klare Bewertungssystem, die sorgfältig entworfen und streng eingehalten. Ein solches System sollte leicht und vollständig vermitteln die wichtige Dynamik einer Verbindung und eine knappe Weg, um die Ergebnisse des fertigen Bildschirm präsentieren. Eine Möglichkeit, ein solches System zu konstruieren ist nach Besoldungsgruppe Embryonen Verwendung eines Klassensystems, das Gesamt morphologischen Schweregrad und das Vertrauen eines Treffers erklären würde. Ferner könnten die Klassenkategorien mit gekoppelt werden ein ⁽⁺⁾ oder ^(-), um entweder eine expansive oder reduktive Wirkung auf die Region (en) von Interesse zu beschreiben. Hier Zebrafischembryos wurden auf einzelne Verbindungen aus einem bioaktiven Bibliothek (Enzo Chemicals) 50% bis 24 epiboly HPF unterzogen und dann durch WISH getestet mit einem Cocktail von drei Ribosonden zu Nephronsegmenten (4A) zu erfassen. Als Beispiel-Grading-System, einem Brunnen, der eine Gruppe von Embryonen, die eine dramatisch vergrößert proximalen convolu hatten enthältTed Tubulus (PCT) der pronephros, der Zebrafisch embryonalen Niere, müssten die für das Wohlbefinden als (Klasse I), die in diesem Fall würde die Klasse mit dem schwersten Mangel assoziiert und das höchste Niveau der Betreiber kategorisiert behandeln Verbindung verursachen Vertrauen in die beobachtet (4B) Phänotyp. (4B) - Die Verbindung würde dann mit (PCT) und ^(+), die vollständige Schreibweise wobei (PCT ⁺ Klasse I) annotiert werden. Dieses Konzept der Klassifizierung bietet eine einfache und schnelle Weise einen Grube von Informationen bezüglich eines kleinen Moleküls von Interesse, einschließlich der Schwere der Verbindungen auf den Organismus zu beschreiben, die Region, die durch das Medikament und die Art, in der der Bereich ist, betroffen ist betroffen (4B).

Fig. 1 & #160;. Manuelle Zebrafischembryo chemischen Bildschirm Strategie Ein Forscher kann führbar eine Platte mit 96 Vertiefungen von Chemikalien auf Zebrafischembryonen zu testen und nachträglich WISH Verarbeitung während einer einzigen Woche. Durchführen von zwei Wochen nach der chemischen Tests (1 Woche (Tag 1-6) und 2 Wochen (Tag 7-12)) mit einem dritten Woche gewidmet Analyseprobe gekoppelt werden. Etwa zwei 96-Well-Platten im Wert von Bildschirm Proben trifft und abgebildet werden Woche 3 (Tag 13-17). Dieses Szenario beträgt das Screening von etwa 200 Verbindungen in einem 3 Wochen Zeitraum, was einer kleinen Bibliothek von etwa 600 Verbindungen, die durch 9 Wochen komplett abgeschirmt. Dieses Handbuch Strategie kann in Abhängigkeit von den verfügbaren Ressourcen geändert werden. Zum Beispiel können drei Forscher die Zeit, um einen Bildschirm von etwa 600 Verbindungen zu 3 Wochen im Vergleich zu der 9 Wochen ist es würde ein Forscher nehmen vervollständigen reduzieren. Screening-Strategien kann durch Zuweisung Forscher, die bestimmte Aspekte des Bildschirms, wie Drogengenuss angepasst werdenment und in-situ-Hybridisierung oder Leitung Forscher unabhängig führen das gesamte Screening-Prozess auf separaten Teilen der chemischen Bibliothek.

Abbildung 2. Flussdiagramm:. Aufschlüsselung der 6 Tage Bildschirm Workflow Die chemische Screening-Prozess diskret nach unten in 6 Tage unterbrochen werden. Tag 1 besteht aus der Einrichtung Zebrafisch Paarung Paare (= /> 25), um Embryonen zu liefern für jede 96-Well-Platte zu sehen sein. Tag 2 das Sammeln Embryonen aus den Paarungskammern und Ordnen von ihnen in einer tiefen 96-Well-Platte, gefolgt von Drogenbehandlung. Am Tag 3, sind Embryonen vorbereitet WISH, einschließlich dechorionation, Gewebefixierung und Embryo Austrocknung. Schließlich wird WISH auf die Embryonen bis Tag 4-6 durchgeführt. Bitte beachten Sie, dass alternative Färbeverfahren auf fixierten Proben können leicht sein swünschen ubstituted.

Abbildung 3. Platte Transfer Kennzeichnung schema. Zebrafisch Embryonen werden aufgereiht und Drogen in einer 96-Well-Platte behandelt zog dann nach einer 24-Well-Platte für Müllbeseitigung und Pronase Exposition. Die Embryonen werden dann in 48-Well-Platten für die Embryo-Vorbereitung, wollen und Gewebefixierung bewegt. Als nächstes werden Embryonen auf 12-Well-Platten für das Scoring, Bildgebung und Speicherung übertragen. Präzise Anordnungs von Embryonen ist durch die Verwendung eines Farbcodierungssystem, das die Forscher ermöglicht den Überblick über die chemische Herkunfts für jede Testprobe zu halten erreicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Beispiel Sortierregeln:. Nieren Segmentierung Assay A WISH Experiment ermöglicht die Forscher auf bestimmte Zelltypen basierend auf der Identität der Sonden, die ausgewählt werden Fleck, so dass die Bewertung der Veränderungen im Embryo Phänotypen entsprechend den Veränderungen im mRNA-Transkription Ort und / oder Ebenen. Als Beispiel drei Segmente der Zebrafisch embryonalen Niere, die pronephros wurden über Bildschirm Mix 1. Bildschirm Mix 1 ist ein Cocktail von Sonden, die aus wt1b, die spezifisch lokalisiert in den podocytes (P) bezeichnet, slc20a1a die den proximalen gewundenen Benotung Tubulus (PCT) und SLC12A1, die den distalen früh (DE) Segment ⁴⁷ Etiketten. Ein Symbol ⁽⁺⁾ neben einem Bereich Markierung verwendet, um die Ausdehnung oder positive Verschiebung dieser Region zu kommentieren, während ein Symbol ^(-) wird verwendet, um die Verkleinerung eines Bereichs diktieren. Hier embryonen Droge mit 13-cis RA behandelt einen vergrößerten proximalen Tubulus und einen vollständigen Verlust des distalen frühen Segment ohne erkennbare Wirkung auf den Podozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Chemische Genetik in der Zebrafisch kann einen entscheidenden Einfluss auf das Fortschreiten der Wirkstoffforschung. Dieses Protokoll bietet eine manuelle Hochdurchsatzverfahren zur chemischen Genetik in Zebrafischembryonen durchführen mit einem Wunsch Auslesen effektiv ermöglicht eine Einzelperson oder kleine Gruppe, um ein kleines Molekül Bildschirm durchzuführen. Diese minimale-Ressource Methode erweitert die Machbarkeit der chemischen Genetik, viele Forschungsgruppen. Insbesondere liefert dieser Bildschirm-Strategie eine wichtige Alternative zur Verwendung von Roboter Instrumentierung, wie solche Systeme nicht breit über Forschungsabteilungen zugänglich. Dieses Handbuch Bildschirm ermöglicht ein einzelnes Individuum auf eine 96-Well-Platte von Verbindungen mit einem Wunsch Auslesen in einem 6 Tage-Woche zu testen. Da Zebrafisch sind eierlegend, wobei die Embryonen entwickeln außerhalb des Elternteils, und die Embryonen sind groß genug, um mit dem bloßen Auge zu sehen (zwischen 1-3 mm), zugänglich für die manuelle Handhabung mit einfachen Instrumenten und der Forscher Array Proben sind sieMultiwell-Platten ohne Verwendung eines Mikroskops. Ferner, da Zebrafisch zu entwickeln rasch kleines Molekül Belichtung wirksam mit einer einzigen Behandlung einer Verbindung, anstatt wiederholten Dosen, die manuelle Weiterverarbeitung minimiert werden. Zebrafisch-Embryonen sind leicht kultiviert, weil ihre Dotter stellt eine Quelle der Ernährung bis zu 5-6 Tage nach der Befruchtung, die die Komplikation der fry Fütterung eliminiert. Zusätzlich wird die Mehrheit der Larvenorgane entwickelt und werden in dieser Zeit, die die Möglichkeit, eine breite Palette von Forschungsfragen zu studieren bietet funktional. Wobei die einfache Zugabe von kleinen Molekülen auf den Embryo Inkubationsmedium ist nicht-invasiv und ermöglicht den Forscher (s), die für Medikamentendosis auszuwählen, die Zeit der Zugabe und Dauer der Belichtung wodurch strenge Kontrolle über viele Variablen und damit für bestimmte Entwicklungsprozesse von Interesse, die abgefragt werden. Wie hier beschrieben, können erhebliche Forschungs Produktivität in kurzer timefr erreicht werdename mit diesem Handbuch Bildschirm Methodik. Nach unserer Erfahrung gibt es eine hohe Rendite auf dem investierten Aufwand, der unter Verwendung eines bekannten bioaktiven chemischen Bibliothek, ein Verfahren von Interesse, wie nephron Segmentierung bei Nierenentwicklung analysieren akzentuiert werden können (Abbildung 4; Poureetezadi und Wingert, unveröffentlicht).

Die hier beschriebene manuelle chemische Bildschirm ist außergewöhnlich vielseitig, weil es einen Test auf festZebraFisch Proben beinhaltet. Zum Beispiel kann diese Strategie überarbeitet, um mehrere Platten von Verbindungen in einer Woche zu testen und dann zu Embryonen Stand der folgenden Woche. Alternative Assays auf festZebraFisch Proben, wie Immunhistochemie oder andere Gewebefärbung Präparate, könnte auch für den Wunsch Auslesewechselt werden. Experimentelle Strategien auszuführen zellulären Assays im Zebrafisch sind anpassungsfähig aufgrund der optischen Klarheit und Transparenz der frühen Entwicklungsstadien. Ferner können die Forscher die Pigmentierung zu späteren sta hemmenges unter Verwendung von Chemikalien oder Vermeidung der Komplikation der Pigment Entwicklung insgesamt durch den Einsatz von Pigment-less genetischen Linien wie Casper oder schiere Zebrafisch ^13. Es ist möglich, kleine Moleküle manuell zu verwalten, verarbeiten den Fleck (en) von Interesse und manuell Note Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops einfach. Allerdings ist es wichtig zu bedenken, dass die automatisierte Bildanalyse durchgeführt werden konnte, und kann in der Tat für Hochauflösung Phänotyp-Analyse erforderlich. Zum Beispiel kann es bevorzugt, Partner ein automatisiertes Bildanalysesystem mit einem direkten Assay sein, wie etwa einer transgenen Reporter, wie dies vereinfacht die manuelle Bearbeitung von Proben quantifiziert Unterschiede nicht leicht wahrnehmbar für das bloße Auge, und eliminiert Forscher Vorspann ^15. Glücklicherweise einige automatisierte Imaging-Systeme sind sowohl benutzerfreundlich und sparsam im Softwarekosten ^15. Der Einsatz und die Fähigkeiten anderer automatisierter Systeme haben sich schnell entwickelt und kannsein, orientieren Organismen verwendet, verwalten medikamentöse Behandlungen und sogar Organismen ^12,15 verlagern. Diese automatisierten Systeme haben ein neues technologisches Zeitalter der Forschung eingeläutet und haben innovative Lösungen bereitgestellt, um große Mengen von Testpersonen zu manipulieren und damit durchführen HTS und HCS-Ansätze in ganzen Organismen ^12,15. Während solche Maschinen sind unbestreitbar nützliche Werkzeuge, sie sind auch sehr teuer und sind außerhalb der Reichweite für viele grundlegende Forschungslaboratorien. Ohne Zugang zu diesen automatisierten Funktionen kann es scheinen, dass die chemische Bildschirme sind nicht möglich. , Umreißt jedoch dieses Protokoll einen Leitfaden, wie Sie eine manuelle Bildschirm, der verwendet werden kann, um eine chemische Genetik Bildschirm auf eine praktische Weise über einen angemessenen Zeitraum abzuschließen befragen.

Nachteile für manuelle Screening und chemische Genetik im allgemeinen vorhanden ist, und sollte im Hinterkopf, wenn man eine chemische Bildschirm gehalten werden. Insbesondere das Verfahren hier gezeigt erfordert eine mäßigeder körperlichen Geschicklichkeit. Diese Sorge ist vermindert oder vollständig durch Wiederholung vermieden, wie Fingerfertigkeit mit der Praxis zu verbessern. Zusätzlich gibt es minimalen Raum für grobe Fehler, da es nur 10 Embryonen pro Vertiefung für die Analyse. Kleine Moleküle können in der Penetranz des Phänotyps, die induziert wird, variieren, so dass eine angemessene Punkteschema Verbindungen von Interesse sind einzuhalten, um zu identifizieren. Entscheidend ist, dass die Forscher nutzen dieses Protokoll auszuarbeiten geeigneter strenge Kriterien für das, was sie einen Hit zu betrachten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Art dieser Form der Bildschirm wird wahrscheinlich einen gewissen Anteil der Fehlalarme, die durch weitere chemische Aufarbeitung abgegrenzt werden kann ergeben. Ferner ist es wichtig, Embryonen genau zu inszenieren und Kupplungen für das Screening kurz nach der Befruchtung zu sammeln, als asynchrone Entwicklung kann zu Komplikationen in der Wirkung der medikamentösen Behandlungen genau Auswertung führen. Ferner wird in Bezug auf chemische Screening als Exexperimentelle Strategie, gibt es eine Fülle von Einschränkungen. Verbindung Löslichkeit und Toxizität von Trägermolekülen (zB Dimethylsulfoxid (DMSO)) kann auch ein Problem darstellen und können unerschwinglich in Prüfung vieler Moleküle sein. Das Chorion kann auch als Hindernis für die Wirkstoffexposition zu handeln. Schließlich, obwohl Zebrafisch ein leistungsfähiges und Translationsmodell für chemische Genetik, Pflege sollte immer bei der Bestimmung, ob eine alternative chemische Bildschirm Strategie, beispielsweise unter Verwendung eines in vitro Systems, wie einer Zelllinie entnommen werden kann, kann die Verwendung von ganzen ersetzt werden Tiere. Dennoch wird die chemische Behandlung in der ganzen Zebrabärbling-System als bevorzugt angesehen, die ähnliche Ansätze in Säugetieren, da sie den Vorteil der Erfassung der systemischen Wirkungen der Verbindungen und Forschern ermöglichen, die Liste der Verbindungen, die in einem Säugetiermodell getestet werden sichten.

Bisher wurden Zebrafisch chemische Bildschirme eine leistungsstarke experimentelles Werkzeug t vorgeseheno abzugrenzen, die Mechanismen der Entwicklung und den Kandidaten pharmakologische Mittel zur Verwendung in der Medizin zu ermitteln, wie die Identifizierung von Molekülen, die Verhütung von Krankheiten Pathologien. Zum Beispiel kann eine Studie von Burns und Kollegen entwickelten eine automatisierte Mikro gut Assay für Herzfrequenz mit transgenen Zebrafischembryonen, die GFP im Myokard ⁴² ausgedrückt. Sie benutzten diese transgene Linie um die Herzfrequenz in der Entwicklung zu analysieren und wie es war auf medikamentöse Behandlung ⁴² betroffen. Eine weitere Studie, durch die Prüfung der Bevölkerungsdichte von hämatopoetischen Stammzellen im Zebrafischembryo, festgestellt, dass Prostaglandin E2 reguliert den HSC Nische ^23. Diese Feststellung wurde in der Maus validiert und wurde später für die klinische Prüfung in der menschlichen Nabelschnur Transplantationen ^23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314) implementiert. Durch mehrere aktuelle Studien, hat chemische Genetik bewährt bei der Untersuchung einer Nierenerkrankung mit der Zebrafisch zu sein 43. Der Zebrafisch Nieren eine ausgezeichnete Paradigma Nephrogenese oder Regenerierung des Nephrons, die Funktionseinheit, die die Niere während der Entwicklung und akutem Nierenversagen ⁴³ umfassen studieren. Nephron Struktur ist stark zwischen dem Zebrafisch embryonalen Niere und der erwachsenen Säugetierniere ^44-50 konserviert. Mehrere Studien, die Zebrafisch embryonalen Nieren verdeutlichen seine inhärente translationalen Potenzial, wenn sie mit chemischen Genetik. Eine chemische Genetik Bildschirm wurde auf zwei Zebrafisch-Mutanten, die auf die Gene PKD2 und ift172, die bekanntermaßen die Hauptakteure in der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) ³⁴ sein kartiert wurden durchgeführt. Der Bildschirm in Folge Identifizieren der pan-Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitor Trichostatin A (TSA) als ein kleines Molekül, das die morphologischen Defekten normalerweise in den mutierten Embryonen gesehen zunichte machen könnte. Ein anderer Ansatz von de Groh und Kollegen getroffen für Verbindungen, die Induc gescreented Ödem in Wildtyp-Zebrafischembryonen, die eine Störung der Nierenfunktion ³⁵ anzeigen würde. Nach der Identifizierung PTBA als Treffer beobachteten sie, dass zusätzlich zu verursachen Ödeme, PTBA erhöht die Expression von pax2a, einen Marker für Nieren Vorläufern. Wichtig ist, dass eine optimierte Ableitung von PTBA dann gezeigt, um die prozentuale Fatalität erwachsenen Zebrafisch, die Gentamicin-induzierte Nierenschäden unterzogen und darüber hinaus beschleunigt die Erholung der Mäuse, die von Nierenschäden erlitten ²⁷ verringern. Zusammengenommen sind diese Beiträge aus Zebrafisch chemische Genetik präsentieren die Arten von Entdeckungen, die mit Hilfe der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.

Während chemische Genetik Forschung trägt erhebliche Verdienst ist es nicht ohne gewisse Herausforderungen. Ausschließlich unter Verwendung eines chemischen Genetik Ansatz machen es kompliziert, um das spezifische Gen oder Gene, die von einer Verbindung betroffen sind zu bestimmen. Selbst wenn ein Target (s) gefunden wird, a significant Lücke zwischen Verbindung Identifikation und Verständnis des Mechanismus (n) der Aktion, in der das kleine Molekül verhält sich bleiben. Zum Beispiel kann es schwierig sein, den Mechanismus, bei dem ein kleines Molekül handelt, da eine einzelne Verbindung, die mit einem Bereich von unterschiedlichen Wirkungen im Organismus bestimmen. Jedoch mit dem Aufkommen neuer Technologien und chemische genetischen Screens in Zebrafisch abgeschlossen, das Problem der Bestimmung eines Mechanismus schrumpft. Ein Verfahren, um festzustellen, die molekularen Effekte der identifizierten Verbindungen ist, um eine Medikamentenbibliothek bekannter bioactives für Screening, wo Mechanismen können möglicherweise von vorher kommentierten Daten abgeleitet werden soll. Zusätzlich Chemoinformatik Algorithmen wie Discovery-Gate sind für die Verwendung, die strukturelle Ähnlichkeiten einer Verbindung mit einer Datenbank von Verbindungen zugeschrieben Mechanismen ¹⁴ vergleichen erhältlich. Noch ein anderer Weg, um den Mechanismus der Verbindung zu erhellen wäre, einen MICR erzeugenoarray nach Behandlungsprofil und dann abfragen dieses Profil in einer Zusammenstellung von Mikroarray-Drogenprofile wie Connectivity Map, auf der Suche nach mechanistisch definierte Verbindungen, die eine ähnliche Wirkung ¹⁴ zu entlocken. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um genetische Mutanten, die eine ähnliche Wirkung wie die Verbindung von Interesse zu identifizieren sein. Suche nach einer Verbindung zwischen einer Verbindung und einer Mutante könnte darauf hindeuten, dass die Verbindung funktioniert molekular stromaufwärts oder stromabwärts des zugehörigen Gens, das durch Behandlung der Mutanten mit der Verbindung und Morpholino abgegrenzt werden könnten. Eine andere Möglichkeit wäre die Massenspektrometrie, die weiterhin mehr Optimiert für Zebrafisch geworden ist sein. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um spezifische Protein-Änderungen oder post-translationale Modifikationen nach der Arzneimittelbehandlung abzugrenzen. Schließlich kleine Moleküle oder sogar ganze Bibliotheken sind manchmal in der Lage ist für Pull-Down der Bindungspartner markiert. Es ist auch erwähnenswert, dass, während der Mechanismus, wie ein kleines Molekül Funktionen is bedeutender Import, gibt es von der FDA zugelassene Medikamente, für die die Mechanismen unbekannt bleiben.

Obwohl Zebrafisch weisen viele Ähnlichkeiten mit Säugetieren genetisch und physiologisch, gibt es immer noch ein Problem der Arzneimittelweiche ^14. Eine Studie untersuchte die Crossover-Fähigkeit der Treffer von einem Bildschirm zum Zellzyklus-Inhibitoren in Zebrafischembryonen ^50. Der Bildschirm führte zur Identifizierung von 14 Treffern, die vorher unbekannt Zellzyklusaktivität besitzen waren. Von diesen 14 Verbindungen, 6 wurde festgestellt, Zellzyklusaktivität in Mensch und Zebrafisch Zellkulturassays haben, wurden 3 gezeigt, dass Serum inaktiviert in Zellkulturassays, 1 war nur in Zebrafisch-Zellen aktiv ist, und 4 hatte keine Aktivität in entweder Zebrafisch oder menschliche Zellkulturassays, sondern nur in dem Zebrafisch gesamten Organismus. Bemerkenswert ist, die 4 Verbindungen, die nur in der Zebrafisch hatte Aktivität zeigen, dass es Unterschiede zwischen Zebrafisch und Säugetieren, die prohi kannbiss die Translations Potenzial bestimmter Verbindungen. Dies ist eine wichtige Überlegung bewusst zu sein, aber es gibt Beispiele für kleine Moleküle, wie PGE _2, die die Fähigkeit von HSZ in menschlichen Empfängern und PTBA-Derivate, die die Geschwindigkeit der Wiederherstellung der Nieren in Säugern zu verbessern engraft verstärkt, wodurch der Beweis der Grundsatz, dass die Frequenzweiche ist möglich ^23,31-33.

Unabhängig von diesen Fallstricke, chemische Genetik und dieser minimal-Ressource-Ansatz hat viel zu der Forschungsgemeinschaft anbieten. Chemische Genetik ist besonders nützlich in der Zebrafisch und wird auch weiterhin eine entscheidende Rolle bei molekularen Signalweg Verhör und Medikamentenentwicklung zu spielen. Chemische Bildschirmen basierend auf diskreten molekularen Ziele dieser Art unterliegen einer hohen Ausfallrate aufgrund von, was als die Konstellation der Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und toxikologischen (ADMET) Eigenschaften ⁵¹ bekannt. Chemische Bildschirmen Verwendung Zebrafisch zukonzentrieren sich auf einen Prozess, anstatt eine diskrete Ziel können mehrere ADMET Probleme zu umgehen und zu identifizieren Verbindungen, die wirksam in dem Kontext des gesamten Organismus. Mit der zunehmenden Ressourcenpool für Zebrafischforschung, einschließlich der aktuellen Mutantenstämme und die Fähigkeit, Genom Bearbeiten verwenden, um gezielte genetische Mutanten und transgenen erstellen verfügbar, gibt es praktisch eine unbegrenzte Anzahl von möglichen chemischen genetischen Screens mit Zebrafisch. Viele chemische Bibliotheken wurden kuratiert, und Spanne Kollektionen mit bekannten bioactives, neue Verbindungen, strukturell vielfältigen und strukturell ähnlich. Diese Reagenzien liefern eine Fülle von spannenden Möglichkeiten für Bildschirm-Kombinationen, die derzeit verfügbar sind und werden wahrscheinlich in den kommenden Jahren weiter wachsen. Mit diesen Möglichkeiten in der Hand, bietet dieses Handbuch und Hochdurchsatz-Protokoll eine praktische und benutzerfreundliche Weise, um die Fähigkeit von Forschungsgruppen, um chemische genetischen Screens verpflichten mit Zebrafisch zu erhöhen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l natürliche Pipettenspitzen	USA Scientific	1111-3800
1x E3			Erzeugen Sie mit 50x E3 und DI-Wasser.
1x PBST			Erzeugt 0,1% Tween-20 in 1x PBS.
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
12-Well-Färbeschale	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
24-Well-Platte	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Erzeugen Sie 4% PFA (w/v) in 1x PBS - kochen, dann einfrieren und bei -20 °C lagern.
48-Well-Platte	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			Erzeugt 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4, 250 mM NaCl und 8,5 mM KCl in DI-Wasser.
96 Deep-Well-Platte	VWR	100-11-940
96-Well-Platten-Dichtmatte	VWR	10011-946
Anti-Digoxigenin-Antikörper	Roche	11-093-274-910	Bei -20 °C aufbewahren.
BCIP	Bestand Sigma	B8503	50 mg/ml mit 100% DMF erzeugen - einfrieren und dann bei -20 °C lagern.
Blocklösung			Erzeugen Sie 50 ml mit 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS und 35 ml MABT. (Tauen Sie BSA und FCS bei 37 °C auf.)
BSA (Rinderserumalbumin) Lagerbestand	American Bioanalytical	AB00448	Erzeugen Sie 10 % BSA durch Rühren der BSA-Flocken in MAB bei Raumtemperatur, frieren Sie sie dann ein und lagern Sie sie bei -20 °C. (Unbenutzte BSA-Flocken bei 4 °C aufbewahren.)
DIG/FLU-markierte Riboprobe in vitro Transkriptionsreaktionsreagenzien	Roche	11175025910; 11685619910	Konsultieren Sie das Verfahren des Herstellers.
DMF (Dimethylformaldehyd)	American Bioanalytical	AB00450
DNase 1 Inhibitor, 10x DNase 1 Puffer	Roche	4716728001
Inkubationsschale für Embryonen	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
Ethanol (EtOH)	Sigma	E7023	50 ml 70 % EtOH mit H2O und 100 % EtOH erzeugen und bei -20 μC lagern.
FCS (fetales Kälberserum) Lager	Invitrogen	16140089	Bei -20 °C aufbewahren.
Filter-Sterilisationseinheit	Corning	430516	0,45 μ m CA / 1 L
Volumen feine Pinzette	Roboz	RS-1050
Mikrozentrifugenröhrchen mit flachem Boden	VWR	87003-300; 87003-298
Formamide	American Bioanalytical	AB00600	Bei -20 °C aufbewahren.
Glasbecken 90 x 50	Kimax Kimble	23000
Glaspipette	VWR	14673-010
Glasfläschchen	Wheaton	225012
Glycerin	Sigma	G7893
Glycin	Sigma	G8898
Glykogen	Roche	10901393001
HYB+			Erzeugung von 50 % Formamid, 0,1 % Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml Hefe-Torula-RNA und 50 μ l/μ l Heparin
INT Vorrat	Sigma	I8377	55 mg/ml mit 70 % DMF und 30 % H2O - einfrieren und bei -20 °C lagern.
MAB			Erzeugen Sie durch Zugabe von 55,0 g Trismabase, 8 ml 1 M Tric-HCl pH 9,5, 23,2 g Maleinsäure und 17,5 g NaCl zu 1,5 l deionisiertem H2O. Anschließend mit entionisiertem H2O auf 2 L auffüllen und autoklavieren.
MABT			Generieren Sie 0,1 % Tween-20 in MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
Mesh-Teesieb	English Tea Store	SKU # ASTR_KEN, MPN # 1705
destilliertes Wasser in molekularer Qualität	Mediatech	25-055-CM
Multi-8-Kanal-Pipette 0,5 - 10 & # 956; l	Eppendorf	3122000.019
Multi-8-Kanal-Pipette 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
Nanotropfen	Thermo	ND-2000c
NBT Schaft	Sigma	N6876	Erzeugen Sie 50 mg/ml mit 70 % DMF und 20 % H2O - einfrieren und bei -20 °C lagern.
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	19210
PCR-Filmkleber	Eppendorf	30127.48
Plattenbehälter (Pencil Box)	Sterilit	1722
Vorfärbepuffer			Erzeugen Sie 0,1 % Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl und 100 mM Tris pH 9,5. (Jedes Mal frisch für den Gebrauch machen.)
Pronase	Roche	11459643001	50 mg/ml mit E3 erzeugen, einfrieren und bei -20 °C lagern.
Proteinase K	Roche	03-115-879-001	10 mg/ml in DI-Wasser erzeugen, dann einfrieren und bei -20 °C lagern.
RNase 1 Inhibitor	Roche	3335399001
Gummikugel	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
Färbelösung-violett	N/A	N/A	Generieren mit 45 μ l NBT und 35 μ l BCIP pro 10 ml, die für den Vorfärbepuffer benötigt werden.
Färbelösung-rot			Generieren mit 31,5 μ l von INT und 35 μ l BCIP pro 10 ml, die für den Vorfärbepuffer benötigt werden.
Stereomikroskop	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA-Polymerase	Roche	11031171001
T7 RNA-Polymerase	Roche	10881775001
Transferpipette	Samco	202, 204
Tween-20 Lager	American Bioanalytical	AB02038
	Wasserbad Thermo	51221073	( Modell # 2831)