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Summary

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Abstract

Viele Aspekte der Infektion von Makrophagen durch Cryptococcus neoformans wurden ausgiebig untersucht und gut definiert. Jedoch eine bestimmte Interaktion, die nicht klar verstanden wird, ist nicht-lytischen Exozytose. In diesem Verfahren werden Hefezellen in den extrazellulären Raum durch eine schlecht verstandenen Mechanismus, der sowohl die Makrophagen und Cn lebensfähigen Blätter freigegeben. Hier beschreiben wir, wie man eine große Anzahl von infizierten Makrophagen individuell für eine 24-Stunden-Infektionsperiode von Zeitraffer-Mikroskopie zu folgen. Infizierten Makrophagen werden in einer Wärmekammer mit einem CO ₂ Atmosphäre in einem Mikroskop, die die gleichen Bedingungen wie einem Zellkulturbrutschrank bietet angebracht gebracht. Live digitalen Mikroskopie kann Informationen über die dynamischen Wechselwirkungen zwischen einem Wirt und Pathogen, die nicht von statischen Bildern ist. In der Lage, jede infizierte Zelle visualisieren können Hinweise darauf, wie Makrophagen behandeln Pilzinfektionen stellen, und umgekehrt. Diese Technik isa leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der Dynamik, die hinter einem komplexen Phänomen sind.

Introduction

Die Phasen der Pilzinfektion zwischen Cryptococcus-Zellen und Makrophagen sind gut dokumentiert ^1-3. Nach Hefezellen werden durch Makrophagen aufgenommen werden, kann eine Vielzahl von Wechselwirkungen auftreten: der Makrophagen kann lysieren Freigabe seiner Pilzbelastung in den extrazellulären Raum, oder es könnte die Infektion, indem die Hefe-Zellen innerhalb der Grenzen seiner zellulären Membran ⁴ zu steuern. Nichtlytischen Exozytose, ein Verfahren, bei dem ein Makrophage getilgt einige oder alle der Cryptococcus-Zellen in die Umgebung oder eine benachbarte Zelle, und beide Wirt und Pathogen lebensfähig bleiben ^5: jedoch seit einigen Jahren ein neues Ergebnis wurde unabhängig durch zwei Gruppen beschrieben ^-8. Mehrere Studien haben versucht, die molekularen Mechanismen hinter dieser Interaktion zu verstehen, aber wir haben noch nicht über einen vollen Griff auf, was treibt dieses Phänomen.

Die Fähigkeit, Bilder in Echtzeit zu erfassen und anschließend analysieren mehrere infizierened Makrophagen ermöglicht es, viele Fragen zu den physikalischen Eigenschaften umliegenden nicht-lytischen Exozytose in Bezug auf Timing, Raumkapazität, Veränderung der Morphologie und auch Stress von Makrophagen während einer Pilzinfektion zu beantworten. Indem die Zellen in einer Umgebung, die vergleichbar mit der von einem Inkubator untergebracht ist, so können wir die dynamische Natur der Makrophagen-Pilzzelle Wechselwirkungen erblicken. Forscher haben diese Technik verwendet, um verschiedene Komponenten dieses Prozesses zu studieren. Die Rolle der Phagosom in diesem Prozess wurde deutlich gemacht mit Fluoreszenzfärbung und Aktin Blockern ^9, während eine andere Gruppe verwendet diese Methode, um zu zeigen, dass nicht-lytischen Exozytose wurde in Zellen, die hatten die Waschkeimbildungsproteindomänen gelöscht ¹⁰ blockiert. Die Wirkung der Cytokine Signaling hat auch festgestellt worden mit Echtzeit-Mikroskopie ^11. Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf C. neoformans, wie es auch mit Candida albicans beobachtet, another Pilzkrankheitserreger, der die Fähigkeit, Makrophagen ¹² infizieren. Diese Ergebnisse sind Beispiele dafür, wie dieses Verfahren eine Fülle von Informationen zu einem Bereich, den wir wissen so wenig über ist.

Protocol

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institut für Tierwissenschaften an der Albert-Einstein-College of Medicine durchgeführt. 1. Wachstumsbedingungen von C. neoformans H99 (Serotyp A) Wachsen einzelne C. neoformans (Cn) Kolonien auf Sabouraud-Agar-Platten. Ein Tag vor dem Experiment, wählen Sie eine Kolonie und zu impfen 10 ml Sabouraud-Bouillon. Ermöglichen Kultur über Nacht bei 37 ° C wachsen bei einer Geschwindigkeit von 250 UpM schüttelnd. 2. Isolierung und Herstellung von primären Knochen Makrophagen aus C57 / Bl6 Mäuse Euthanize Mäuse indem Tier in einer CO 2-Kammer bis sie nicht mehr atmen. Als zweite Maßnahme, zervikal den Hals verrenken vor Beginn der Dissektion. Sterilisieren ganzen Körper mit 70% igem Alkohol. Entfernen Sie die beiden Oberschenkelknochen und Schienbein und Knochen statt in sterilen DMEM. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe und Muskulatur mit desilicat wischt, bis Knochen sind absolut sauber. Legen Sie nur intakte Knochen in eine Petrischale mit 70% igem Alkohol und Inkubation für 3 min zu assoziierten Mikroorganismen abzutöten. Entfernen Sie Knochen und in Petrischale mit sterilem DMEM. Schneiden Sie vorsichtig die Enden der Knochen. Halten Knochen über eine leere 50 ml konischen Röhrchen auf Eis gestellt und vorsichtig bündig 10 ml kaltem DMEM mit einer 25 G-Nadel durch die einzelnen Knochen. HINWEIS: Jede Maus wird 4 Knochen (2 Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen 2) zu erhalten. Daher sollte man der Maus etwa 40 ml der Zellsuspension zu erhalten. Zentrifuge Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 650 x g beträgt. Während dieser Zentrifugation vorbereiten und Filter sterilisieren Knochenmark-Makrophagen Zuführen Medien DMEM mit 20% L929, 10% fötales Kälberserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamin besteht , 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1% 2-Mercaptoethanol. Resuspendieren resultierende Pellet mit 10 ml Zuführen Medien. Geben Zelle suspensIonen durch eine 70 um Zell Sieb, um Zellklumpen zu stören und zu entfernen große Trümmer. Platte 1 ml der Zellsuspension in 10 ml Medium Zuführen in Petrischalen, die für die Gewebekultur Verwendung (für insgesamt 10 Platten) angegeben sind. Sodass die Zellen bei 37 ° C mit 10% CO 2 anhaften. 5 ml frisch Fütterung Medien am 3. Tag Am Tag 7, komplett ersetzen die Futter Medien und Makrophagen sind bereit, verwendet werden. Der Tag vor dem Experiment, nehmen Makrophagen aus Platte, indem Sie beim Einzug von Medien und fügen 5ml eines sanften Zelle Stripping Reagenz bis zum Teller. Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C und Makrophagen entfernen mit sanften Pipettieren. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 650 × g für 10 min. Pellet in 1 ml Zuführen Medien. Mit Hilfe eines 1:20 Verdünnung wird die Konzentration von Makrophagen durch Pipettieren von 10 ul Zellsuspension auf einer Hämocytometers. Mit 14 mm Glasboden Petrischalen, Teller einKonzentration von 1 x 10 5 Makrophagen direkt auf das innere Wohl die ein Maximum von 200 ul hält, so ist Vorsicht geboten, dieses Volumen nicht überschreiten, wie in Abbildung 4 dargestellt. Damit sich die Zellen an die Petrischale aus Glas, indem man das Geschirr in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde zu halten. 1-2 ml der Fütterung Medien mit LPS supplementiert mit 1 mg / ml IFNg und bei 500 U / ml und ermöglichen Zellen über Nacht inkubiert. 3. Co-Inkubation von primären murinen Makrophagen und C. neoformans Am Tag des Experiments zu entfernen 1 ml einer Übernachtkultur angeimpft und Pellet Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 420 x g beträgt. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit sterilem PBS auf Medien und extrazellulären Cryptococcus Produkte wie das Polysaccharid glucuronoxylomannan (GXM) an der oben genannten Geschwindigkeit und Zeit zu entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml sterilem PBS und eine 1: 100-Verdünnung. Je 10 ul ter Verdünnung auf einem Hämocytometers und zählen Zellen. Hinzufügen Hefezellen bei einer MOI von 1: 5. Zum Beispiel, wenn es 1 x 10 5 Makrophagen / gut, machen Sie eine Zellsuspension von 5 x 10 6 / ml Cn und 100 l dieser Lösung für einen Gesamtbetrag von 5 x 10 5 Cn. Hinzufügen des berechneten Volumens Cryptococcus Zellsuspension zu 1 ml Medium mit der Zuführung mAb 18B7-Antikörper in einer Konzentration von 10 ug / ml. Inkubieren Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min. Fütterung entfernen Medien aus Glasboden Petrischale und waschen 1x mit sterilem PBS. 100 l opsonisiertes Cn direkt gut. Sodass die Zellen für 2 h bei 37 ° C mit 10% CO 2 inkubiert. Nach Co-Inkubation, überprüfen Sie mit dem Mikroskop, dass Makrophagen haben Cn verinnerlicht. Berücksichtigt internalisiert werden sollte Cryptococcus-Zellen deutlich innerhalb der Grenzen des Makrophagen ersichtlich. Waschpetrischale 3x mit sterilem PBS auf jegliche extracellula entfernenR Cn. 1-2 ml der Fütterung Medien ohne Zugabe von mAb 18B7 und Einrichten Mikroskop. 4. Visualisierung nichtlytischen Exocytosis in Echtzeit mittels digitaler Lichtmikroskopie HINWEIS: Um diese Experimente durchführen, ein Mikroskop, das mit einem angehängten Brutraum, die CO 2 Lieferung und ein Heizungseinheit erforderlich beinhaltet kommt. Vor dem Experiment, vorwärmen die Inkubationskammer für mindestens 30 min auf 37 ° C. Sicherzustellen, dass die CO 2-Einheit liest 5% zu Beginn des Experiments. Ort Glasboden Petrischale auf Mikroskop-Plattform, Deckel mit CO 2 Deckel, und schließen Sie alle Türen, keine Wärme entweicht gewährleisten. Verwendung der 10X-Objektiv mit dem Mikroskop im Phasenkontrast, sich auf eine klare Bereich der infizierten Makrophagen. Bezogen auf das Experiment, das Ziel zu bestimmen, wie viele Makrophagen untersucht werden müssen, verwendet. Einrichten Mikroskop-Software zu take eine Bild alle 4 Minuten für eine 24-Stunden-Zeitraum. Nach 24 Stunden wird das Experiment Abschluss erreicht haben und insgesamt 361 Bilder werden gesammelt worden sein. Exportieren Sie diese Bilder als .jpegs bei einer 5%-Kompression. Mit Image J Software, Bilder als visuelle Stapel bei 5 Bildern pro Sekunde. Wenn der Film braucht, um für die Veröffentlichung oder eine Präsentation zu sehen, speichern Sie sie entweder als AVI-oder MOV-Datei je nach dem Format am besten für den Betrachter.

Representative Results

Die Bilder, die diese Technik kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, Informationen rund um das, was passiert, nachdem Zellen phagozytiert C. sammeln analysierende neoformans. Wie in Figur 1 zu sehen ist, gibt es etwa 100 Makrophagen, die entweder infiziert oder nicht infiziert sind. Jede dieser Makrophagen gibt dem Zuschauer die Möglichkeit, Wirt-Pathogen-Interaktionen auf einer mikroskopischen Ebene sehr zu studieren. Wie die Figuren 2 und 3 zeig…

Discussion

Hier haben wir eine Methode, mit der Pilz-Makrophagen-Interaktionen können aufgezeichnet und in Echtzeit über einen 24-Stunden-Zeitraum analysiert werden beschrieben. Unser Labor hat dieses Protokoll verwendet, um viele der zeitlichen Aspekte des nicht-lytischen Exozytose zu studieren und wird auch weiterhin in Echtzeit-Mikroskopie zu verwenden, um die morphologischen Komponenten, die diesen Prozess umgeben ermitteln.

Für diese Technik, um optimale Ergebnisse zu erhalten, sollte besondere…

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes 	Fisher Scientific 	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss