Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.
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Methodenartikel
Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito- Aedes aegypti
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die elektrophysiologische Aufzeichnung von Aktionspotentialen von sensorischen Neuronen von Stechmücken gibt Forschern einen Einblick in die chemische Wahrnehmung dieser Krankheitsvektoren. Wir haben kürzlich durch direkte elektrophysiologische Untersuchung ein bitteres sensorisches Neuron in der Labellon von weiblichen Aedes aegypti identifiziert, das auf DEET und andere Repellentien sowie auf bitteres Chinin reagiert. Diese gustatorischen Rezeptor-Neuronenreaktionen veranlassten uns zur Sequenzierung der Gesamt-mRNA sowohl aus männlichen als auch aus weiblichen Labella- und Tarsen-Proben, um die mutmaßlichen Chemorezeptionsgene aufzuklären, die in diesen Kontakt-Chemorezeptionsgeweben exprimiert werden. Die Proben der Tarsen wurden für beide Geschlechter in pro-, meso- und metathorakale Subtypen unterteilt. Anschließend validierten wir unseren Datensatz, indem wir eine qRT-PCR an denselben Gewebeproben durchführten und statistische Methoden verwendeten, um die Ergebnisse zwischen den beiden Methoden zu vergleichen. Studien, die sich mit der molekularen Funktion befassen, könnten nun auf spezifische Gene abzielen, um diejenigen zu bestimmen, die an der abstoßenden Wahrnehmung durch Mücken beteiligt sind. Diese Rezeptorwege können verwendet werden, um neuartige Repellentien auf eine Störung des Wirtssuchverhaltens zu untersuchen und so die Ausbreitung schädlicher Viren einzudämmen.
Einleitung
Verbindungen wie DEET, Picaridin, Citronellal und IR3535 wurde gezeigt, dass Mücken, einschließlich der wichtigen Krankheitsüberträger Aedes aegypti 1,2 wirksam abwehren. Wir erfassen Aktionspotentiale aus sensorischen Neuronen mit bestimmten Geschmacks Sensillen verbunden, um die Zellen mit Moskitoabweisung beteiligt zu bestimmen. Mit nachgeschaltetem Sequenzierung der exprimierten Gene in diesen Geweben gekoppelt ist, können wir die Gene wahrscheinlich Vermittlung der Reaktionen dieser Zellen, um neue Verbindungen zu verbessern abweisende Fähigkeiten Bildschirm identifizieren.
RNA-seq ist ein mächtiges Werkzeug, schn....
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Protokoll
1. Aufzucht Ae. aegypti Erwachsene
- Hatch Eier in etwa ¾ Zoll Wasser in flache Schale. Überbelegung wird die Größe des Erwachsenen zu reduzieren.
- Rück Larven bei 25 ° C (12-hl: 12-HD) und führen mit Grundfischfutter.
HINWEIS: Überfütterung kann die Überlebensraten zu reduzieren. - Entfernen Puppen einzeln von Pasteur-Pipette täglich und Transfer in Plastikschalen (9 cm x 5,5 cm) in kleinen Contain Eimer mit feinmaschigen Deckel und schafft so 24 Stunden Altersgruppen.
- Feed erwachsenen Mücken 10% Saccharose-Lösung mit Wattebausch auf den Bildschirm Wände eines Käfiggehäuse platziert die Mücken in einer Klimakammer ....
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Ergebnisse
Die Trace-Aufzeichnungen von Aktionspotentialen von Ae. aegypti Geschmacks Sensillen (Abbildung 1) zeigen die Wirksamkeit der direkten Stimulation mit einer Reihe von Chemikalien. Diese Technik kann verwendet werden, um Antworten auf jede Stimulierung chemischen durch Zählen Spitzen einer gegebenen Amplitude und Dauer über einen angemessenen Zeitraum (im allgemeinen weniger als 500 ms) zu quantifizieren. Trace-Aufzeichnungen müssen unter einem gegebenen Satz von experimentellen Bedingungen leic.......
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Diskussion
Die größte Herausforderung bei der Aufnahme von Aktionspotentialen von Geschmacks Sensillen ist zu entscheiden, welche Antworten sind "normal". Bei der Verwendung von einzelnen Geschmacks Sensillum Spitze der Aufnahme das erste Mal für eine bestimmte Insektenarten, die Gesamtzahl und die Empfindlichkeiten der Geschmacksrezeptorzellen (KNS) sind wahrscheinlich unbekannt. Viele vorläufigen Aufzeichnungen werden zunächst erforderlich, den Bereich und die Konzentrationen von Chemikalien zu testen, zu entscheiden. .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Bryan T. Vinyard vom USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD für statistische Analysen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss an J.C.D. aus dem Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program unterstützt, das vom Verteidigungsministerium über das Armed Forces Pest Management Board (AFPMB) finanziert wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Glaskapillare | A-M Systems | 628000 | Standard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4" |
| Silberdraht | A-M Systems | 7875.015 | " blanker |
| Wolframdraht | Alfa Products | 369 | 0,127 mm Durchmesser |
| Feine Pinzette | Fine Science Tools | 11252#5SF | Inox |
| Kühltisch | BioQuip Products | 1429 | Chill |
| Tischvorverstärker | Syntech | Taste Probe | Vorverstärker |
| Software für Elektrophysiologie | Syntech | Autospike | Software für Elektrophysiologie |
| TetraMin Fischfutter | Tetra | Tropical Fischfutter Granulat | Fischfutter zu feinem Pulver gemahlen |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA-Isolationsreagenz |
| RNeasy Plus Das Mini-Kit | Qiagen | 74136 | enthält gDNA-Eliminator und RNeasy-Spin-Säulen |
| Nanodrop-Spektralphotometer | NanoDrop-Produkte | , ND-1000 | Tischspektrometer |
| , R-Statistik-Freeware | (erstellt von Robert Gentleman und Ross Ihaka) | www.r-project.org | Verwenden Sie die lm-Funktion des stats-Pakets und die equiv.boot-Funktion des Äquivalenzpakets in der R-Computing-Umgebung. |
| 1,5 ml Röhrchengestell | Evergreen | 240-6388-030 | Gießen Sie flüssigen Stickstoff in einige leere Vertiefungen, um das Gewebe einzufrieren und zu zerkleinern. |
| 1,5 ml Entnahmeröhrchen mit Stößel | Grainger | 6HAX6 | RNasefreie |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Schleudern Sie gefrorenes Gewebe nach unten, um es am Boden des 1,5 ml Röhrchens zu halten. |
| Primer-BLAST Primer Entwurfswerkzeug | NCBI | n/a |
Referenzen
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
