Introduction
효모 proteinopathy 모델은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 파킨슨 병 (PD) 1-3 포함한 단백질 미스 폴딩 장애 개발되어왔다. ALS 환자에서 misfold 단백질 TDP-43 및 FUS,의 발현은, 효모 1, 2에서 세포질 응집체를 형성하는 독성 및 mislocalize 있습니다. 마찬가지로, PD에 연루되어 α - 시누 클레인 (α-SYN)의 표현은, 독성 및 mislocalizes 효모 3 세포질 응집체를 형성 할 수 있습니다. 이러한 기능은 이러한 장애 4,5 환자의 표현형을 요점을 되풀이. 따라서, 효모 모델을 방지하거나 이러한 표현형 2,6-13 역 단백질이나 작은 분자 스크리닝을위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 저자들은 TDP-43, FUS 및 α-SYN에 집계 및 독성을 반전 할 수있는 단백질의 개발에 관심이 있습니다. 우리는 Hsp104, 모두 FR 단백질을 disaggregating의 고유 할 수있는 효모에서 AAA + 단백질에 초점효모에서 톰 비정질 단위 및 아밀로이드는 아직 더 인간의 상동 (14, 15)이 없습니다. Hsp104 미세 내생 효모 프리온을들을 분해하도록 조정하고 일반적으로 16, 17가 발생하지 인간의 신경 퇴행성 질환에 연루 기판을들을 분해하는 제한된 능력을 가지고 있습니다. 따라서, 우리는 efficaciously이 인간의 기판을들을 분해 할 수있는 Hsp104의 향상된 버전을 설계하는 것을 목표로하고 있습니다. Hsp104는 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용하여 변형이를 위해, 우리는 큰 라이브러리를 구성; 이 라이브러리는 효모 proteinopathy 모델 (17)를 사용하여 검사를 할 수 있습니다. Hsp104 (17) 매우 큰 것처럼 우리는 라이브러리를 구성하고 심사에 도메인 타겟 접근 방식을 채택했습니다. 유사한 접근법이 다른 도메인을 선별하기 위해 사용될 수 있지만 우리는 처음, 중간 도메인 Hsp104 17 (MD)에 집중했다. 예컨대, 나머지는 표면 디스플레이, 같은 대체 기술과 반대로 이러한 모델은, 직접적 disaggregase 활성 스크리닝 에이블18 바인딩 모니터링을위한 사용하기 ricted.
우리의 프로토콜은 두 심사 단계 (그림 1)을 기반으로합니다. 첫째, 효모 질병 기판의 독성을 억제 Hsp104 변이체가 선택된다. 이렇게하려면 Hsp104 변종과 질병 관련 기판은 Δ의 hsp104 효모에 cotransformed된다. 우리는 야생 형의 부재 (WT) Hsp104 17 Hsp104 시퀀스 공간을 탐험 Δ의 hsp104 효모를 사용합니다. 중요한 것은, Hsp104의 삭제는 효모의 α-SYN, FUS, 또는 TDP-43 독성에 영향을주지 않으며, Hsp104 (WT)의 표현은 최소한의 구조 1,13,17을 제공합니다. 효모는 양쪽 단백질의 발현을 유도하는 유도 배양액에 도금된다. 식민지의 질병 관련 기판 협의 성장의 독성을 억제 Hsp104 변종을 품고 효모. 식민지 독성 다이를 억제하지 않는 변종을 유지하면서 이러한 변형은, 추가 분석을 위해 선택됩니다. 그러나,오탐 (false positive)이 화면에 상당한 문제가 있습니다. TDP-43, FUS 및 α-SYN의 식으로 표현되는 Hsp104 변형과 관련이없는 독성의 자발적인 유전자 억제의 모양에 대한 강력한 선택적 압력을 생성하는, 매우 독성이 있습니다. 따라서, 우리는 이러한 비특이적 독성 억제 (17)를 제거하기 위해 상대적으로 높은 처리량입니다 보조 화면을 사용했다. 이 보조 화면에서 선택 효모 Hsp104 플라스미드 (19)에 대한 선택에 대응하기 위해 5 Fluorootic 산 (5-FOA)로 처리된다. 균주 후 기판의 독성 Hsp104 플라스미드의 손실 후 복원 될 수 있도록 분석을 통해 안보 (TDP-43, FUS, 또는 α-SYN) 독성 기판에 대한 평가된다. 따라서, 독성이 보조 화면에 복원되는 효모는 아마도 원래 인해 Hsp104 변종의 존재에 대한 독성 억제를 표시. 이러한 효모 '히트'로 표시되고 Hsp104 플라스미드는되어야회수 Hsp104 유전자 17 (도 1)의 변이를 식별하는 서열. 모든 히트 곡은 다음 독성 억제에 대한 재검사 후 독립적으로 돌연변이를 구성하는 부위 특이 적 변이를 사용하여 재확인해야한다. 이 프로토콜에 대한 잠재적 인 응용 프로그램은 광범위하다. 이러한 방법을 이용하여 단백질의 임의의 타입의 라이브러리가 효모의 독성 어떤 기질 단백질의 독성을 억제하는 변형에 대해 스크리닝 될 수있다.
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Protocol
1. 도서관 생성
- 도메인 별 오류가 발생하기 쉬운 PCR 사용 Hsp104의 라이브러리를 구성하려면 먼저 오류가 발생하기 쉬운 DNA 중합 효소 (20) 관심의 영역을 증폭.
- 겔을 추출하여 PCR 생성물을 정제 하였다.
- 표준 부위 지정 돌연변이 유발 프로토콜을 사용 megaprimer 확장 단계를 수행하여 PCR 완충액 50 ng의 템플릿 플라스미드 250 겨 megaprimer, 200 μM의 dNTPs 및 고성능 DNA 중합 효소를 결합하고, PCR 등급의 물 (20)과 50 ㎕의 총 부피로 희석 . 표준 PCR 프로그램을 실행합니다.
NOTE : 증폭되는 유전자의 특정 지역에 따라 달라질 사용될 특정 프라이머.- PCR에 이어, 37 ° C에서 2 시간 동안 1 ㎕의 DPN I 제한 효소로 부모 주형 DNA를 소화.
- ultracompetent E.에서 전기 또는 다른 수단에 의해 라이브러리 변환 대장균 미니 프렙하여 정제하고.
참고 : 라이브러리 생성실질적으로 주어진 실험의 목적에 따라 달라집니다. Hsp104 매우 큰 단백질이므로 우리가 특정 도메인 에러 유발 PCR을 이용하는 이유는 전체 유전자를 랜덤 비실용적이다. 또한 Hsp104의 구조는 저조한 21 도전 관한 라이브러리 디자인을 이해 남아. 라이브러리 유일한 제한은 템플릿 플라스미드 백본 스트로스 미디어 -5- FOA 카운터의 선택을 허용하는 URA3 유전자를 포함해야한다는 점 이외에는, 돌연변이 유발에 관한 랜덤 접근 방식을 사용하여 구성 될 수있다.
Hsp104 도서관 2. 변환
- 표준 리튬 아세테이트 / PEG 변환 프로토콜 (22)를 사용하여 W303aΔ의 hsp104 효모에 질병 관련 기판을 통합 할 수 있습니다. 하나의 식민지를 선택하고, 기판 (23)을 관련 질병의 높은 독성을 가진 균주를 분리 독성을 화면.
참고 : 통합 변형 및 솔라를 사용하여모든 셀에 동일한 발현을 보장하기 위해 단일 콜로니 테. pAG416GAL 플라스미드 (우라실 마커) (24)로 우라실 이외 마커 (우리는 히스티딘 사용) Hsp104 라이브러리 하에서 유전자의 통합을 허용하는 플라스미드로 질병 기판을 복제. 5-FOA의 counterselection을 허용하기 위해 라이브러리가 우라실 마커와 플라스미드로부터 발현되어 있는지 확인합니다. 다른 효모 균주도 사용될 수있다. 우리는 W303a 모두 WT와 Δ hsp104 배경에 BY4741 효모 균주 (MEJ과 JS, 관찰되지 않은)을 사용하여 유사한 독성 억제 표현형을 언급했다. - 동일한 리튬 아세테이트 / PEG 변환 프로토콜 (22)을 사용하여이 균주에 Hsp104 라이브러리 변형. 라이브러리의 시퀀스 공간을 유지하고 예측 된 라이브러리 크기를 유지하기 위해 적절히 변형 배율 확대.
- 충분히 판을 사용하여 noninducing, 선택적 플레이트 상에 변환 혼합물 (예 : SD-그의 우라)를 플레이트콜로니 다수의 성장을 보장한다. 필요한 접시의 수를 최소화하기 위해 큰 배양 접시 (150mm)를 사용합니다. 플레이트를 사용하여 형질 전환 체를 복구하는 것은 변환 효율을 평가 할 수 있습니다.
- 병렬 Hsp104 WT 및 벡터 음성 대조군 변환.
Proteotoxicity의 억제를위한 3. 심사
- 피노 오스 보충 드롭 아웃 미디어 (예 : SRaff-그의 우라)를 사용하여 판 오프 식민지를 씻으십시오. 접시에서 식민지를 풀어 혈청 학적 피펫 멸균 나무 어플리케이터를 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브와 소용돌이에 액체 세척을 이동하는 것은 철저히 세포의 덩어리를 분리합니다. 약간 흐린 문화, OD 600 ~ 0.025로 희석.
참고 : 여기 라 피노 오스 따라서 갈락토스 매개 유도 세포를 프라이밍, 유도의 포도당 매개 억압의 세포를 완화하는 역할을한다. - 3에서 진탕 피노 오스 드롭 아웃 미디어에서 하룻밤 희석 문화를 성장0 ºC. 병렬 Hsp104 WT 및 벡터 제어를 성장.
- 다음날 아침, 개인 갈락토스 위에 농도의 범위를 판 (예 SGal-그의 우라) 판 (400 μL 총 볼륨 문화를 집중 2 ml의 1 μL). 농도의 넓은 범위를 도금하는 것은 접시가 하나의 식민지있을 것이라는 점을 보장합니다. 필요한 실제 농도는 관심있는 질병 기판의 독성에 의존한다.
- 라이브러리의 OD 600 벡터 및 Hsp104 WT 문화를 정상화하고 컨트롤 라이브러리 상대적인 성장을 비교하는 같은 부피를 접시.
- 선택의 엄격 성을 평가하기 위해, 미디어 (억압) 포도당에 라이브러리를 접시. 식민지 (그림 2) 나타날 때까지, 30 ºC 2-3 일 동안 번호판을 품어. 그 결과 식민지를 평가하고 컨트롤에 비교합니다.
NOTE : 종종 모두 크고 작은 콜로니가 수득되지만, 콜로니 크기와 행동 사이에 상관 관계의 ivity가 관찰된다. 시퀀싱 이월 가양 최소화 -5- FOA 카운터 선택 기술 (단계 4)를 사용하여 이러한 잠재적 히트 화면.
4. 5-FOA Counterselection 스포팅는 오판 가능성을 제거하기 위해
- 단일 및 이중 드롭 아웃 매체에 중복 된 단일 콜로니 (예 : SD-그의 우라과 SD-그의 판) 30 ºC에서 하룻밤 성장 밖으로 행진. 벡터 및 Hsp104 WT 컨트롤을 반복합니다. 도금 SD-그의 종래 5-FOA들은 5-FOA에 도금되는 경우 세포 Hsp104 플라스미드를 상실한 가능성을 증가시켜 5-FOA 단계의 효율을 증가시킨다.
- 5 FOA 화면을 수행하는 동안 마르지 판을 방지하기 위해, 4 ºC에서 SD-그의 우라의 파라 필름에 접시와 저장소를 포장. 이 판은 결국 시퀀싱에 사용됩니다.
- 행진에서 식민지 SD-그의 5-FOA 플레이트에 하나의 식민지 판 (YPD 미디어 + 1g / L 5-FOA) 및 (30)에서 1~2 일 동안 배양# 186; C는 하나의 식민지가 나타날 때까지. 여기서, 5-FOA는 URA3 유전자를 포함하는 세포에서의 독성 생성물 (5-fluorodeoxyuridine)로 변환된다. 따라서, 여전히 Hsp104 플라스미드를 보유하는 모든 세포는 죽을 것이다.
- 행진 SD 우라과 SD-그의 접시 위에 중복의 5-FOA 판에서 하나의 식민지. 각 테스트 3 식민지는 각각의 히트에 대해 적어도 하나의 식민지가 Hsp104 플라스미드를 상실 할 가능성을 증가했다. 30 ° C에서 1~2 일 동안 품어. SD-번호판하지만 SD 우라 판에 성장합니다 Hsp104 플라스미드를 잃은 식민지.
- 분석을 안보에 대한 Hsp104 플라스미드를 잃은 균주를 성장. 진탕 30 ºC에서 하룻밤 (96) DeepWell 2 ml의 판에 (예를 들어 SRaff-그의) 라 피노 오스 드롭 아웃 미디어에서 포화 균주를 성장. 5 FOA 처리 제어 계통을 포함해야합니다.
- 분석을 안보에 대 한 번호판을 준비합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 나누어지는 200 μL 피노 오스 드롭 아웃 미디어 (예 : SRaff-그의) 당96 웰 플레이트의 잘, 예약 열 깔끔한 문화 1, 7. 나누어지는 250 열 1에 16 포화 문화의 각 μL 및 플레이트 7.
- 직렬 멀티 채널 피펫 철저하게 혼합, 플레이트의 각 열에 문화 5 배 희석. 각 웰의 최종 부피를 위해 컬럼 (6) 및 (12)로부터 희석 배양의 50 μl를 제거하여 200 μL이다. 이것은 심지어 안보 보장하기 위해 필수적이다.
- 96 볼트 복제 도구 (Frogger와)를 사용하여 SD-그의 및 SGal-그의 판에 중복의 문화를 발견. 2~3일 30 ºC에서 번호판을 품어.
- 컨트롤 유사한 SGal-그의 플레이트에 독성을 나타내는 균주를 시퀀싱을 위해 선택한다. 컨트롤로 유독하지 않음으로 오탐 (false positive) 균주를 폐기하십시오. 5-FOA는 그 자체로 종종 독성, 그래서 혼자 질병 기판보다 SD-그의 접시에 성장 결함 또는 전시 실질적으로 더 큰 독성을 나타내는 균주를 (폐기
5. 식민지 PCR에 의해 Hsp104 변종을 시퀀싱
- 다 쳤어요 ~ 10 μL의 PCR 스트립 관에서 3 μL 20 mM의 NaOH를에서 SD-그의 우라 판에서 효모와 동결 - 해동하여 세포를 용해. 다음 10 분 동안 열 순환기에서 99 ºC에서 부화, 10 분 동안 또는 액체 질소 -80 ºC 냉동고에서 스트립 튜브를 놓습니다. PCR 등급 물 100 μL에 균주를 희석.
- PCR 반응 준비 : 5 μL PCR 템플릿, 0.5 μL 100 μm의 각 프라이머, 0.5 μl의 10 mM이의 dNTPs, PCR 버퍼 0.25 μL DNA 중합 효소를, 그리고 PCR 등급 물 25 μL 총 볼륨으로 구성한다. 디자인 프라이머는 무작위 지역 플러스 양쪽 끝에서 약 100 bp의 증폭합니다. 성공적인 증폭의 가능성을 증가시키기 위해 증폭 된 영역의 크기를 최소화한다. 표준 PCR 프로그램을 실행합니다.
- 적절한 SIZ의 PCR 생성물의 증폭을 확인하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 시료를 분석전자. 어떤 제품이 존재하지 않는 경우 PCR을 반복한다.
NOTE : PCR 장애가 통상적 단계 5.1에서 사용되는 너무 많은 효모 때문이다. - DNA 시퀀싱 샘플을 준비합니다. 이러한 엑소 뉴 클레아 I와 새우 알칼리 포스 파타 아제 효소로 PCR 정화 또는 PCR 제품 정리 시약을 사용하여 하나 PCR 프라이머를 제거 (ExoSAP-IT)의 단일 가닥 DNA를 분해합니다. 이 시약은 효소 높은 처리량을 허용, 비법 인 프라이머 및 dNTPs를 저하됩니다.
- PCR 제품 시퀀싱. 철저하게 돌연변이 염기 서열 크로마토 그램을 분석해야합니다. 종종 여러 플라스미드 항구 효모로 돌연변이는, 특정 사이트 (그림 4)에서 두 개의 뉴클레오티드의 혼합물로 관찰 할 수있다.
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Representative Results
우리는 중간 영역에서 무작위 Hsp104 변종의 라이브러리를 구축하고 TDP-43 독성 억제를 위해 그것을 상영했다. 도서관은 변화와 화면의 엄격 성을 평가하기 위해 포도당과 갈락토스 판 (그림 2)에 도금. 단일 콜로니를 선택하고, 균주 카운터 Hsp104 플라스미드를 제거하기 위해 5-FOA를 사용하여 선정되었다. 이 균주는 그 독성을 확인하기 위해 평가되었다 것은 Hsp104 변종 않고, TDP-43 형 때문. 초기 화면에서 선택한 변형의 부분 집합의 안보 분석이 선택되는 4 식민지, (2) (1) 거짓 양성 반응, Hsp104 매개 TDP-43 독성 억제를 표시하고, (1) 5-FOA 처리 다음과 같은 강화 된 독성을 표시 것으로 나타났다 (그림 3). 이 진정한 히트는 중간 도메인 돌연변이 (도 4)를 식별하기 위해 콜로니 PCR에 의해 서열 분석 하였다. 이러한 돌연변이가 확인 된 후, Hsp104 돌연변이가 건설되었다 새롭게 부위 특이 적 변이에 의해 부모의 Hsp104 플라스미드에 독성 억제를 확인합니다. 이러한 방법을 사용하여 선택한 변형 나중에 효모에서 집계, 생화학 적 분석에서 명확 예비 성형 집계를 억제하고, C에서 도파민 신경 퇴행을 억제하는 것이 확인되었다 PD (17)의 엘레 간스 모델.
그림 1 :. 효력을 더 Hsp104 변종을 분리하는 흐름도 Hsp104 라이브러리 (URA3 마커, GAL1 발기인) 질병 기판 (HIS3 마커, GAL1 프로모터)를 포함하는 효모에 형질 전환 유도 미디어에 도금 독성 억제 상영된다. 잠재적 안타는 다음 비특이적 독성 억제를 제거하기 위해 5-FOA의 counterselection 단계를 사용하여 다시 상영된다. 이 두 번째 단계에서 선택한 변형은 다음 식민지 PCR에 의해 순서가된다. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg"대상 = "_ 빈"HREF>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. pAG303GAL - TDP-43과 pAG416GAL-Hsp104 라이브러리 cotransformed 독성 억제 선별 효모는 포도당에 (억압) 또는 갈락토스는 (유도) 미디어를 도금했다. TDP-43은 매우 독성이므로 거의 Hsp104 변형이 독성을 억제 할 수 있으며,이 스크린은 매우 엄격하다. 5 FOA 보조 화면의 갈락토스 판에서 안타 단일 콜로니를 선택한다. 모두 크고 작은 식민지는 일반적으로 얻을 수있다, 그러나 우리는 식민지의 크기는 활동과 상관 관계 방법을 지시하는 경향을 관찰하지 않았습니다.
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그림 3 :. 5-FOA 보조 화면 효모는 분석을 안보에 의해 평가 된 Hsp104 플라스미드에 대한 선택에 대응하기 위해 5-FOA로 처리 하였다. 균주는 SD-그의 및 SGal-그의 접시에 직렬로 5 배 희석, SRaff-그의 미디어에서 재배, 중복에 발견되었다. Hsp104 A503V는 우리가 이전에 검증 혼자 17 벡터와 함께 제어로 여기에 표시 한 진정한 히트입니다. 3과 4 행 Hsp104 억제 TDP-43의 독성이 다음의 손실을 유지 라이브러리 히트이다. 5 행은 TDP-43는 더 이상 독성이고, 거짓 양성을 보여, 그래서 비특이적 독성 억제가 존재한다. 행 6은 일반적으로 가능성으로 인해 5-FOA의 독성이며, TDP-43보다 더 독성이 변형을 보여줍니다. 이 균주는 여전히 염기 서열을 할 수 있지만, 올바른 히트하지 않을 수 있습니다.
그림 4. 애널시퀀싱 결과 yzing. 선정 된 효모는 종종 여러 플라스미드가 포함되어 있습니다. 따라서 식민지 PCR 제품의 순서에 따라주의가 어떤 돌연변이가 크로마토 그램에서 간과되지 않도록주의해야합니다. 이 크로마토 그램 (*로 표시)이 잠재적 인 돌연변이는 간과 될 수있다. 첫 번째 예에서, 그리고 T의 두 번째의 혼합물, T 및 C.의 혼합물이있다
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Discussion
여기에서 우리는 효모 proteinopathy 모델을 사용하여 질병 관련 기판의 독성을 억제하는 효력을 더 Hsp104 변종을 분리에 대한 우리의 접근 방식을 제시한다. 이 방법을 사용하여, 변형의 큰 라이브러리 만 제한 -5- FOA 보조 스크린을 통과 변이체의 개수 인 상태, 높은 처리량 스크리닝 할 수있다. 96 웰 형식으로 다음 단계를 수행함으로써, 우리는 정기적으로 1-2주의 과정을 통해 5-FOA 단계에서 한 번에 200 안타까지 화면. 초기 스크리닝 단계에서 얻어진 히트 수는 크게 기판 독성 및 각 특정 라이브러리의 구성에 따라 달라질 것이다. 안타 시퀀싱 때 플라스미드의 혼합물은 일반적으로 각 셀에 존재하기 때문에주의 깊게 시퀀싱 크로마토 그램을 분석하는 것이 필수적이다.
우리는 때때로 Hsp104 WT의 큰 비율은 '히트'로 고립되는 지적했다. 이는 자발적 유전자의 존재 가능성억제 또는 매우 약한 활동. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 높은 온도 (예 : 34 ° C에서)에서 선별 검사 Hsp104 WT이다 '히트'의 비율을 감소시킬 수 있음을 발견했다. 그것은 다시 클론 어느 조의 히트 독립적 신규 한 변이체의 활성을 평가하는 플라스미드 순도를 보장하는 것도 중요하다. 새로운 히트가 확인되면, 그들은 효모에서 집계의 억제에 대한 평가 및 생화학 적 특징으로 할 수있다.
우리는 Hsp104는 TDP-43, FUS 및 α-시누 클레인에 대해 변형 효력을 더 분리하기 위해 이러한 방법을 사용하고 순수 단백질 생화학 분석 (17)를 사용하여 자신의 활동을 확인했습니다. 궁극적으로, 이러한 방법은 효모에서 유독 관심의 기판에 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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