Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Hochdurchsatz-Sequenzierung basierte Methoden sind weit verbreitet, viele biologische Proben in den letzten Jahren erheblich erweitern unser Verständnis der molekularen Komplexität biologischer Systeme ^3,4 angewendet. Allerdings Vorbereitung RNA-Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung oft vermittelt spezifische Vorurteile inhärent angewandten Methode, die Begrenzung der potenziellen Nutzen dieser mächtigen Techniken. Diese Methode bestimmte Vorurteile sind gut für die Ligation-basierten, kleine RNA-Bibliothek Vorbereitungen ^1,2,5,6 dokumentiert. Diese Vorspannungen ergeben 1.000-fache Variation liest Nummern äquimolaren synthetische miRNAs, wodurch Inferenz miRNA Fülle von Sequenzdaten wild variable und fehleranfällig.

Studien, die sich auf die Eigenschaften des Phagen T4 abgeleitetes RNA Ligasen haben dokumentiert, dass die Enzyme weisen Nucleotid-basierte Präferenzen ^7, die als vorgespannte Bibliotheken in Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimenten manifestieren 9, Randomisierung der Nukleotidsequenz des Adapters, die proximal zu der Ligationsstelle ⁶ ist, und unter Verwendung hoher Konzentrationen von Ligations Adapter ^2. Durch eine Kombination dieser drei Ansätze haben wir einen Arbeitsablauf für unvoreingenommene Herstellung von kleinen RNA-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung (Abbildung 1) kompatibel entwickelt. Für direkte Vergleiche zwischen aktuellen Protokolle und unser optimiertes Verfahren entnehmen Sie bitte unserem aktuellen Bericht ² beziehen. Diese optimierte Verfahren ergibt Ligationsgrade von mehr als 95% an beiden 3 'und 5' Schritte und ermöglicht die unvoreingenommene Ligation von kleinen RNA-Molekülen aus synthetischen und biologischen Proben ^2.

Hinweis: Es ist wichtig, RNase-freien Bedingungen während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten.

1. Adenylierung 3 'Linker

1. Verdünnte DNA-Oligonukleotid 3 'Ligationsreaktionen bis 100 & mgr; M in Nuklease-freiem H ₂ O ausgebildet
   Hinweis: Das Oligonukleotid sollte eine 5'-Phosphatgruppe, eine randomisierte Dinukleotid am 5'-Ende und ein 3'-Didesoxycytosin haben. Die 5'-Phosphatgruppe ist eine Anforderung des Mth Enzym für effiziente 5'Adenylierungs ^10. Das Phosphat kann durch Vorbehandlung des Oligonukleotids mit einer Polynucleotid-Kinase mit der Modifikation direkt zugegeben werden, oder geordnet. Die randomisierte Dinukleotid am 5'-Ende ist wichtig für die Minimierung der Sequenz Bevorzugung, die RNA Ligasen weisen bestimmte End-End-Verbindungsreaktionen über andere ^6. Das 3'-Didesoxycytosin stellt ein Sperrelement an dem 3'-Ende des Oligonukleotids to hemmen die Bildung von Linker-Linker Concatemeren während der anschließenden Ligationsschritte und auch dazu dient, das 3'-Ende des miRNA-Linker-Molekül am Ende der 3 'ausgebildet Ligationsreaktion ¹¹ blockieren. Die Oligonukleotid-Linker-Sequenz für die unvoreingenommene miR-Seq Methode gewählt ist wie folgt: 5'PO ₄ NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '.
2. Montieren Sie das folgende Reaktions Adenylierungs: 200 pmol 3'-Linker-Oligonucleotid, 4 ul 10x 5 'DNA Adenylierungs Puffer, 4 & mgr; l 1 mM ATP, 4 & mgr; M-ten RNA-Ligase, Nuklease-freiem H ₂ O auf ein Endvolumen von 40 ul.
3. Inkubieren Reaktion bei 65 ° C für 1 Stunde. Beenden Reaktion durch Erhitzen auf 85 ° C für 5 min.
4. Auszufällen adenylierte Linker durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und 1/3 Volumen von 10 M Ammoniumacetat, um Rest ATP zu entfernen und um unvorhergesehene Ligationen in zukünftigen Reaktionen zu vermeiden.
   1. Kurz gesagt, mischen die alkohol, Salz und Oligo-Lösung bis zur Homogenität, Spinnen bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (~ 15.000 xg) bei 4 ° C für 20 min. Waschen des Pellets in 70% Ethanol, an der Luft trocknen, und resuspendieren in dem entsprechenden Volumen Nuklease-freies H ₂ O auf 50-100 uM adenylierte Oligo ergeben.
5. Adenylierung bestätigen, indem Sie einen 18% Polyacrylamid-Gel.
   1. Vorbereitung des Gels durch Vermischen der folgenden zusammen: 6,3 g Harnstoff, 6,75 ml 40% Acrylamid und 1,5 ml 10x TBE. H In ₂ O auf 15 ml.
   2. Mischen, bis der Harnstoff vollständig gelöst und mit 150 ul 10% (w / v) Ammoniumpersulfat (APS) und 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED).
   3. Sobald Gel, Vorlauf für 30 min mit 1x TBE-Laufpuffer bei Raumtemperatur eingestellt, bei 24 V / cm Gel Breite. Nachdem 30 min ist bündig Wells mit Laufpuffer.
   4. Mischungs 5 ​​pmol der Oligonukleotide mit adenylierte und gleichen Volumen 2x denaturierenden RNA-Ladepuffer (95% (v / v) Formamid,0,02% (w / v) SDS, 0,02% Bromphenolblau (w / v), 0,01% (w / v) Xylencyanol, 1,0 mM EDTA), kurz erhitzen auf 75 ° C und rasten auf Eis gekühlt. Dispense gesamte Probe in die Vertiefung des Gels. Auch eine identische Menge an nicht-adenylierte Kontrolle und niedrige Standards Molekulargewicht Größe.
   5. Die Elektrophorese bei 24 V / cm, bis das Bromphenolblau auf ¾ der bis zum Boden des Gels. Zerlegen Gerät, post-Fleck-Gel mit 1x SYBR-Gold-Lösung in 1x TBE und visualisieren auf UV-Transilluminator Feld (Abbildung 2).
      HINWEIS: Gel zur Reinigung des adenylierte oligo in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben, wenn "kein Eingangs RNA" Kontrollen, was zu einer hohen Menge an PCR-Produkt im Vergleich zu Proben, die mit Eingangs RNA.

2. Linker-Ligation, um 3'-Ende des miRNA

1. 3 'Die Ligation
   1. Montieren Sie folgende Komponenten auf Eis in der aufgeführten Reihenfolge: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x RNA-Ligase-Puffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl _2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenylierte 3'-Linker (100 & mgr; M), 0,5 ul RNase-Inhibitor, 0,5-8,0 & mgr; g Gesamt-RNA, 0,5 & mgr; l T4-RNA-Ligase 2, Nuklease-freiem H ₂ O auf ein Endvolumen von 5 & mgr; l.
   2. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren, wenn die Lösung zu viskos, um Wirbel aufgrund der hohen Konzentration von PEG 8000. Nachdem gründlich gemischt, legen die Reaktion in einem Thermocycler mit einem beheizbaren Deckel. Stellen Sie den Block auf 16 ° C, und Inkubation für 4 h.
      HINWEIS: Die Reaktion kann bis zu einem Endvolumen von 20 & mgr; l ohne Verlust der Ligationseffizienz skaliert werden. Reaktion 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C, um im wesentlichen identische Ligationseffizienz zu erhalten.
2. Gel Purification
   1. Folgende 3 'Ligation, mischen die Reaktion mit einem gleichen Volumen 2x RNA-Ladepuffer. Hitze bis 70 ° C für 5 min, und Schnapp kühl auf Eis. Führen Sie das Beispiel auf einem 15% Polyacrylamid-Gel für PAGE Reinigung.
      1. Vorbereiten einer 15% igen Polyacrylamidgel, enthaltend 7 M Harnstoff, in einer Weise ähnlich zu der zuvor in Schritt 1.5 beschrieben.
      2. Vorlauf das Gel bei 24 V / cm Gel Breite für mindestens 30 min. Schalten Sie Stromversorgung, bündig Brunnen, Lastprobe und Lauf Gel bei gleichen Spannung wie Vorlauf.
      3. Laden Sie die Probe und führen Sie den PAGE, bis die Bromphenolblau hat gerade das Gel verlassen. Das gewünschte Produkt migrieren wird in der Nähe des Xylencyanol.
3. Färbung, Visualisierung und Excision
   1. Zerlegen Sie Gel-Apparatur und Ort Gel in sauberen Tablett mit 1x Laufpuffer (TBE), 1x SYBR-Gold, und Rock für 15 min.
   2. Entfernen Gel aus Färbeschale und visualisieren auf UV-Transilluminator Box mit sauberen Plastikfolie abgedeckt. Das Ligationsprodukt sollte etwa 45 Nukleotide lang sein.
   3. Auszuschneiden die Region mit dem Ligationsprodukt mit einem sauberen razor Klinge und in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Produkt Isolierung und Niederschlag
   1. Pierce unten von 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 30 G-Nadel und legen Sie die durchbohrten Rohr in einem zweiten sauberen, Low-Retention, 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge 5 min bei ~ 15.000 x g.
   2. Visuell zu bestätigen, dass die gesamte Gelscheibe hat durch das Loch in der inneren Röhre bewegt. Falls erforderlich, verwenden Sie ein sauberes Pipettenspitze, einige Gelfragmente näher an das Loch zu schieben.
   3. Entsorgen Sie die leere 0,5-ml-Röhrchen und fügen 400 ul Hochsalzsäulenpuffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) an die Acrylamid Gülle. Rockröhre (n) bei 4 ° C über Nacht.
   4. Übertragen Aufschlämmung auf einen 0,22 Mikron Zelluloseacetat-Spin-Säule unter Verwendung einer großen Bohrung Pipettenspitze. Zentrifuge für 3 min bei Raumtemperatur bei ~ 15.000 xg, um weg von Acrylamid-Gel-Matrix sammeln alle Flüssigkeit.
   5. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine saubere, Low-Retention, 1,5-ml-Röhrchen enthaltening 1 ul 20 mg / ml Glykogen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und ^1/10 Volumen Natriumacetat. Mix-Lösung durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals dem Niederschlag in -80 ° C Gefrierschrank für 20 min.
   6. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit bei 4 ° C für 20 min, um die Nukleinsäure zu pelletieren. Überstand entfernen und waschen in 70% Ethanol. Luft trocknen Pellet für 10 min bei Raumtemperatur und direkt zum 5 'Ligationsschritt.

3. Linker-Ligation zu 5'-Ende der miRNA-3 'Linker Hybrid

1. Zu pelle Nukleinsäure, fügen die folgenden Komponenten: 2 & mgr; l PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul 10x-RNA-Ligase-Puffer, 0,5 ul ATP (10 mM), 0,5 & mgr; l N, N-RNA-Oligo (100 & mgr; M) und H ₂ O auf ein Endvolumen von 4 & mgr; l.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung der "NN-RNA-Oligo" ist wie folgt: 5'-invertierte Didesoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 'und wurde von dem Hersteller über HPLC gereinigt.
2. Mischendiese Probe durch Auf- und Abpipettieren wiederholt. Dies für einige Zeit (bis zu 5 min), um zu gewährleisten, dass das Pellet wurde vollständig neu solubilisiert worden. Wenn erneute Solubilisierung ist problematisch, erwärmen die Probe kurz (3-5 min) bis 37 ° C und wieder Pipettieren gemischt.
3. Sobald das Pellet wieder in Lösung gebracht, wird der Inhalt in einen sauberen PCR-Röhrchen, enthaltend 1 & mgr; l einer 1: 1 Mischung von RNase-Inhibitor und T4 RNA Ligase 1 (5 Einheiten). Wieder mischen und Abpipettieren.
4. Inkubieren der Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 4 Std. Gehen Sie sofort zum cDNA-Synthese.

4. Reverse Transkription / cDNA Synthesis

1. Fügen Sie die folgenden Komponenten in den 5 'Ligation-Reaktion: 2 ul 5x RT-Puffer, 0,75 & mgr; l 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT Primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 & mgr; M) und 0,5 ul dNTPs (10 mM).
2. Mischen durch Pipettieren und Wärme auf 65 ° C für 5 min. Dann langsam auf der Bank t abkühlenop.
3. Sobald Reaktion auf Raumtemperatur, das Röhrchen auf Eis gekühlt und mit 0,5 & mgr; l jeweils von Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor. Mischen durch Pipettieren und in Thermocycler für die Erweiterung Schritt in den Anweisungen des Herstellers angegeben.
4. Sobald vollständige Add 5 ul Nuklease-freies H ₂ O, um das Endvolumen der cDNA-Bibliothek bis zu 15 & mgr; l zu bringen.

5. Bibliothek Vorbereitung

1. Zur Indexierung PCR, montieren die folgende Reaktion auf Eis: 6 ul 5x Phusion Puffer, 1 ul dNTPs (10 mM), 0,9 & mgr; l DMSO, 0,75 & mgr; l 5'-Primer (25 uM), 0,75 & mgr; 3 'Primer (25 uM), 3 & mgr; l cDNA-Bibliothek (variabler Konzentration in Abhängigkeit von der Menge der Eingabe), 0,5 ul Phusion Polymerase (1 Einheit), Nuklease-freiem H ₂ O auf ein Endvolumen von 30 ul. Wähle die Primer-Sequenzen, um die Kompatibilität mit der Schablone und der Sequenzierungsplattform gewährleistenWahl.
   1. Führen Sie die PCR-Reaktion mit den folgenden Einstellungen: anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 3 min, für die ersten 4 Zyklen Denaturierung 98 ° C für 15 sec, Temperung bei 50 ° C für 15 sec, erstrecken sich bei 72 ° C für 15 sec .
      HINWEIS: Je nach der Menge des Ausgangsmaterials, variieren die Gesamt PCR-Zyklus-Nummern. Typischerweise ist für einen Eingang 1-2 ug Gesamt-RNA, sind insgesamt 13 PCR-Zyklen ausreicht, um die miR-Seq-Bibliothek zu erzeugen.
   2. Durchführung nachfolgenden Zyklen, beispielsweise Zyklen 5-12, in einem Zwei-Schritt-Weise, wo die Hybridisierung und Verlängerung Zyklen werden vereinigt und bei 70 ° C für 30 sec und der Denaturierung wieder 98 ° C für 15 sec.
      HINWEIS: Das Reaktionsvolumen beträgt 30 ul Pausieren der PCR-Programm zu ermöglichen, und nehmen Sie die 10 ul Aliquot in vorbestimmten Zykluszahlen für Aussehen des gewünschten Produkts zu überwachen. Typischerweise Zyklen 10, 13 und 16 sind für die Prüfung von einer RNA-Probe ausgewählt.
2. Vorbereiteneine 8% nicht-denaturierenden Acrylamid-Gel durch Mischen von 2 ml 40% Acrylamid, 1 ml 10x TBE, und H ₂ O auf 10 ml. Dann fügen Sie 100 ul 10% APS und 10 ul TEMED. Gießen Gel und lassen Set.
   1. Vorlauf das Gel bei 12 V / cm Gel Breite für 30 min. Flush Brunnen. 1 ul 10x-Ladepuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) Bromphenolblau), mit 10 ul Probe in jede Vertiefung der Abmessungen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typischerweise kann jeder Vertiefung bis zu 30 & mgr; l-Proben zu laden. Ausführen des Muster Gel bei 10 V / cm Gel Breite in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff läuft gerade aus dem Boden des Gels.
   2. Färben und Visualisieren Gel wie in Schritt 2.3 beschrieben.
   3. Verbrauchsteuern Das 146 Basenpaar-Band und eluieren über Nacht in 0,25 ml HSCB in einer Weise ähnlich dem, was in Abschnitt 2.4 beschrieben. Auszufällen DNA in einem gleichen Volumen an Isopropanol und ^1/10 Volumen Natriumacetat. Wash Pellet in 70% Ethanol und Resuspension in TE-Puffer.
   4. Quantifizieren Sie die Bibliothek mit PicoGreen nach den Empfehlungen des Herstellers.

Die erwarteten Ergebnisse für die vorstehenden Verfahren sollte zunächst Beobachtung einer einzelnen Nukleotid-Verschiebung (Anstieg) in der Größe der DNA-Oligonukleotid, das unter Adenylierung von Mth RNA-Ligase (Abbildung 2). Nach 3 'Ligation, Visualisierung des Acrylamid-Gel zeigt (siehe Abbildung 3) scharfe Gewichtsbändern mit hohem Molekular deutlich in der 100-300 Nukleotidbereich des Gels. Dies zeigt, dass die RNA-Probe verwendet wird ist von hoher Qualität (nicht degradiert). Zweitens sollte ein sehr helles Signal am 25. Nukleotid Bereich des Gels, der Überschuss, ligierten 3'-Linker zu beobachten. Es kann auch hilfreich sein, eine RNA kein Eingangskontrolle in der 3'-Ligation aufzunehmen. Dies zeigt die Reinheit des 3'-Linker, und kann auch durch an den PCR-Schritt für die Anzeige von der Zykluszahl durchgeführt, wenn nicht-spezifisches Signal wird problematisch werden. Es gibt keine diagnostisch für das 5 'LigationJedoch in 4 gezeigt ist, eine Reaktion identisch mit dem beschriebenen radioaktiv markierten RNA durchgeführt, die die Bedeutung der hohen Konzentration von PEG8000 eingesetzt zeigt. Schließlich, nach der PCR und native PAGE, ein DNA-Produkt von 146 Basenpaaren, die mit der Größe der Adaptersequenzen, einer miRNA Einsatz und zusätzliche Sequenz der PCR-Primer verlängert beobachtet werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn die richtige Anzahl von PCR-Zyklen (die empirisch ermittelt wird) überschritten wird, kann das keine miRNA Einsatz Produkt die gewünschte Fragmentlänge verschleiern. Dargestellt in Figur 5 ist ein Ergebnis von 5 pMol synthetischer miRNA, typischerweise 2 & mgr; g der gesamten RNA 13-18 PCR-Zyklen erforderlich sind.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe für 2-Schritt-Ligation kleinen RNA-Bibliothek Vorbereitung. Shown sind die allgemeinen Schritte für die Herstellung einer unvoreingenommene miR-Seq-Bibliothek. Dargestellt in schwarz 3 'DNA-Ligation-Adapter, der über Adenylierungs in Schritt 1 eingeschaltet ist, wird miRNA in grün dargestellt und wird mit dem 3 ligiert Adapter in Schritt 2, und 5' RNA-Ligation-Adapter ist in blau, die zu den ligierten Chimäres Molekül in Schritt 3 Nummerierte Schritte sind ausführlich in dem Protokoll beschrieben, Kursiv gedruckte enzymatischen Schritten.

Abbildung 2 Adenylierung 3 Ligationsreaktion. Linker mit Mth RNA-Ligase 18% PAGE-Gel, das aus Harnstoff Adenylierung DNA-Oligonukleotid, um die anschließende 3 'verwendet werden, (+) zeigt an Probe, die mit M-ten RNA-Ligase inkubiert wurde, (- ) zeigt Probe ohne Enzym inkubiert und (m) zeigt die Größenstandards (gezeigt Zahlen at rechts in Basenpaaren). Links ist eine schematische Darstellung der vorliegenden Oligonukleotid Arten. Sternchen zeigt größere DNA-Produkte durch aberrante Oligonukleotidsynthese erzeugt.

Abbildung 3. 3 'Ligation von synthetischen mit Gesamt-RNA-Proben. A) 15% PAGE-Gel von 3 Urea "Ligationsreaktionen (m) zeigt Größenstandards (Zahlen links zeigen Basenpaare), zeigt (Nr RNA) eine Reaktion ohne Eingangs RNA und 3'-Linker, der nicht gel-gereinigt wurde (+) zeigt die Ligation mit 5 pmol der synthetischen miRNA und 3 durchgeführt 'Linker, gelgereinigt wurde, (2 und 1 & mgr; g) zeigen die Menge an Gesamt-RNA der Maus bis 3 unterworfen' Ligation mit dem gleichen, gelgereinigt Linker , Stern zeigt überschüssige 3 'Linker. B) Autoradiogramm von ähnlichen 3' Ligationsreaktion mit P 32 durchgeführt 5'-Ende markierten synthetischen miRNA. Nummer oben zeigt die Zeit (h) wurde die Reaktion ablaufen gelassen, und im Grunde gibt die Menge als Prozentsatz der Summe der nicht-ligierten und ligiert ligiert.

Abbildung 4. 5 'Ligation von radioaktiv markiertem miRNA-3'Linker Hybrid. Autoradiogramm von 5' Ligationsreaktion mit P 32 5 durchgeführt 'Ende markierten synthetischen miRNA-3' Linker Hybrid. Nummer oben zeigt PEG-Menge in der Reaktion verwendet, und die Anzahl an Boden zeigt die Menge als Prozentsatz der Summe der nicht-ligierten und ligiert ligiert. Zeilen links sind eine schematische der ligierten Moleküle wo miRNA ist in grün, 5 'und 3' Adapter sind blau und schwarz sind.

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Abbildung 5. PCR-abgeleitete Klein RNA DNA-Bibliothek. 8% native PAGE der PCR-Produkte von miR-Seq Ligationsverfahren erzeugt. Zahlen oben zeigen PCR-Zyklen, Zahlen an der Seite zeigen Molekulargrößenstandards. Jede DNA-Spezies aus der PCR im rechten identifiziert. Gittermuster ist auf Autofluoreszenz der Probe Gericht.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.