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Methodenartikel

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

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DOI:

10.3791/52100

⸱

12. Dezember 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Reinigung von Photorezeptor-Fragmenten des äußeren Segments (POS) durch Ultrazentrifugation aus Schweine-/Rindernetzhaut unter Verwendung von Homogenisierung und Saccharosegradientenzentrifugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Vorbereitung großer Bestände an POS-Aliquoten, etikettiert oder unbeschriftet, die dann bei -80 °C gelagert werden können.

Zusammenfassung

Analyse eines der lebenswichtigen Funktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) -Zellen, die Phagozytose von verbrauchtem gealtert distalen Fragmente Photorezeptor äußeren Segmente (POS) kann in vitro durchgeführt werden. Photorezeptoraußensegmente mit Stapeln von membranöse Scheiben die Phototransduktion Maschinen, die kontinuierlich in der Netzhaut erneuert. Gesamte POS werden täglich von RPE-Zellen eliminiert. Nagetier, Schwein / Rind und humanen RPE-Zellen erkennen POS verschiedener Spezies in einer ähnlichen Weise. Zur Erleichterung der Durchführung von großen Versuchsreihen mit geringer Variabilität kann ein großes Lager an POS aus Schweineaugen isoliert und gelagert werden in Aliquots eingefroren werden. Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaft des Photopigmente, die eine orange Farbe an, wenn im Dunkeln gehalten. Unter schwachem Rotlicht, Netzhaut werden in einem Puffer aus geöffneten Augenmuscheln halbieren gesammelt. Das Retinazellsuspension homogenisiert, filtriert und auf einem kontinuierlichen Saccharosegradienten geladen. Nach centrifugation, POS in einer diskreten Bande im oberen Teil des Gradienten, der eine charakteristische orange Farbe hat entfernt. POS werden dann gesammelt, zentrifugiert, resuspendiert nacheinander in Waschpuffer, gezählt und aliquotiert. POS auf diese Weise erhalten wird, kann für die Phagozytose-Assays und Analyse von Protein-Aktivierung, Lokalisierung oder Wechselwirkung zu verschiedenen Zeiten nach POS Herausforderung verwendet werden. Alternativ kann POS mit Fluorophoren markiert werden, e. G., FITC, bevor Aliquotieren für nachfolgende Fluoreszenz Quantifizierung POS Bindung oder Phagozytose. Weitere mögliche Anwendungen umfassen die Verwendung von modifizierten POS oder Kassen Herausforderung verbunden mit Stressbedingungen, um die Wirkung von oxidativem Stress oder Alterung auf die RPE-Zellen zu untersuchen.

Einleitung

In der Netzhaut ist das Sehvermögen durch Isomerisierung von lichtempfindlichen Moleküle, so genannte Opsine, bevor es in ein Signal, das zwischen den Nervenzellen bis zu den bildenden Bereiche im Gehirn übertragen werden können, verwandelt ausgelöst. Diese Moleküle werden in Stapeln von membranöse Scheiben ähnlich Pfannkuchen, die die äußeren Segmentieren von Teilen der Photorezeptorzellen (PRs) bilden eingebettet. An ständige Exposition gegenüber Licht und damit erhebliche Mengen an oxidativen Stress ausgesetzt, PRs kontinuierlich erneuern ihre äußeren Segmente auf mögliche oxidative Schäden zu begrenzen. Photorezeptoraußensegmente sind in engem Kontakt mit apikalen Mikrovilli der benachbarten retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen. RPE-Zellen bilden den äußeren Teil der Blut-Retina-Schranke und gewährleisten eine Vielzahl von Aufgaben, die entscheidend für Photorezeptoren Gesundheit und Funktion 1 sind, wie beispielsweise Abschrecken Lichtstrahlen über die Melaninpigmente Rückisomerisierung der photoreaktiven Komponente Opsin Retinal, Bereitstellung von Nährstoffen und gACHSTUM Faktoren, die Teilnahme an PR-Metaboliten zur Verfügung.

Außerdem RPE-Zellen eliminieren verbrachte POS und recyceln ihre Komponenten, eine tägliche Beschäftigung, die durch die zirkadianen Rhythmus in Säugernetzhaut 2,3 geregelt ist. Die Clearance von Schuppen POS ist für PR Überleben absolut notwendig. Wenn es vollständig außer Kraft gesetzt wird, POS Schmutz ansammeln und PRs degenerieren raschem Sehverlust 4,5. Wenn die rhythmische Profil verloren geht und durch eine konstante Aktivität ersetzt, PR und RPE-Defekte zu akkumulieren mit 6 Jahren. Daher ist es sehr wichtig, die molekularen Regulierung der RPE Phagozytose in vitro um Phänotypen seiner Dysfunktion verknüpft verstehen charakterisieren. Interessanterweise ist die molekulare Maschinerie in RPE-Zellen sehr ähnlich dem von Makrophagen verwendet, um apoptotische Zellen zu löschen, und beide sind von der Anerkennung der exponierten Phosphatidylserin auf phagozytischen Trümmer 7-9. Dennoch RPE-Zellen und Makrophagen regulieren phagocytosis verschieden Makrophagen sich für sofortige Beseitigung apoptotischer Zellen bei Begegnung Zeit während RPE Zellen rhythmisch verschlingen POS nur einmal am Tag trotz dauerndem Kontakt mit äußeren Segmenten. Dies legt nahe, spezifischen Regulationsmechanismen, die noch nicht vollständig verstanden sind.

Viele der Moleküle in der RPE phagozytischen Maschinen gebracht wurden identifiziert oder bestätigt durch die Verwendung von isolierten POS und Zellkulturassays Phagozytose. Die alphavbeta5 Integrin-Rezeptor an der RPE apikalen Zelloberfläche lokalisiert, in Abstimmung mit seinem Liganden MFG-E8, bindet spezifisch an POS-10-12, die dann über die MerTK Tyrosinkinase-Rezeptor 13-15 internalisiert. Die CD36-Scavenger-Rezeptor wurde gezeigt, dass im POS Aufnahme teilnehmen und sie beeinflussen die Geschwindigkeit 16,17 und könnte als Sensor von oxidierten Phospholipiden am POS Fläche 18 dienen. Internalisierung muss die Einstellung von F-Aktin-Zytoskelett-associated Proteine ​​wie Annexin 2 19, Myosin II 20 und Myosin VIIA 21,22. Einheimische oder oxidierte POS in vitro auch genutzt werden, um Alterungs Phänotypen der RPE-Zellen in vivo, um die Ansammlung von schlecht verdauten oxidiert POS 23-28 verbunden zu verstehen. Die Erzeugung von RPE-Zellen aus Stammzellen hat eine neue Anwendung für isolierte POS, die verwendet werden, um die Funktionalität der Zellen nachweisen, bevor sie an Tieren oder Patienten transplantiert 29,30,27 eingeleitet.

Zuerst von Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 beschrieben, das Protokoll für die Isolierung von Rinder POS kombiniert eine Ultrazentrifugationsschritt retinaler Homogenate auf kontinuierliche Saccharosegradienten mit Beobachtung der charakteristische orange Aussehen ungebleichtem retinalen Photopigment (Buch 11-cis Retinal). In den letzten 10 Jahren, aufgrund Vorsichtsmaßnahmen, um das Risiko von Rinderwahnsinn zu minimieren, die Verwendung von Schweineaugen geworden increasingly prominent. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie man große Mengen von POS vom Schwein oder Rind Augen, aliquotiert und für längere Zeiträume gelagert werden können, zu erhalten. Dies beseitigt die Notwendigkeit, POS Nagetier Augen, die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren pro POS Aufbereitung und Analyse 32,33,21,22 erfordert vorzubereiten. Zusätzlich werden Informationen über POS Kennzeichnung vor der Lagerung unter Verwendung von fluoreszierenden Molekülen gegeben, zu quantifizieren und zu visualisieren POS in einer vereinfachten und vergleichbarer Weise für einige Anwendungen im Vergleich zur Kennzeichnung POS nach dem Phagozytosetest 32,10. Daher sind diese große Bestände ermöglichen Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit in vielen verschiedenen Arten von Experimenten.

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Protokoll

Das POS-Isolationsexperiment ist zeitaufwendig und kann bis zu 12 Stunden benötigen, um abzuschließen, wenn POS sind vor der Lagerung gekennzeichnet. Das Protokoll wurde von einem Papier von RS Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 1997 10 veröffentlicht und von SC Finnemann und Kollegen geändert angepasst.

Die Tiere wurden nach der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt. Protokolle wurden überprüft und von der Charles Darwin Ethikkommission der Universität Pierre und Marie Curie-Paris 06 und der Fordham University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Allgemeine Set Up

  1. Erhalten 80 frische Schwein oder Kuh Augen so frisch wie bald nach der Schlachtung wie möglich und halten sie gekühlt im Dunkeln. Geben Sie Anweisungen an den Provider, damit das Unternehmen geht auf die gleiche Weise. Dieses Protokoll wird für 80 Augen optimiert. Bisgehen Sie mit den Augen und größer werden Aktien (zB aus 160 Augen), das Doppelte der Lösungsmengen und führen 2 Runden Ultrazentrifugation; Poolproben später an der Sammelschritt (siehe Schritt 2.2.2).
  2. Auf die Bank gesetzt die rote Dunkelkammerleuchte, absorbierende Kissen, Tücher (Material Tabelle). Bereiten Sie 15 cm Geschirr und Biohazard-Beutel für die Abfallsammlung (unbenutzt Augenteile, Glaskörper, ...). Tragen Sie eng anliegende Laborkittel, Handschuhe, Ärmelschoner und Schutzbrillen.
  3. Vorsichtsmaßnahmen:
    1. Pre-Chill alle Lösungen dann kalt halten sie in allen Phasen. Halten Sie die Augen und Farbverläufe auf Eis so viel wie möglich gekühlt.
    2. Halten Sie die Augen und abgeleitete Gewebe in der Dunkelheit so viel wie möglich, bis der Sammelschritt nach der Ultrazentrifugation zu vermeiden Bleichen der visuellen Pigmente und Verlust der Orange-rosa Farbe der aktiven Form der Photopigmente.

2. Protokoll Aktionen

  1. Werden die Lösungen und Steigungen:
    1. Thaw Taurin Lager komplett mit einem 37 ° C Wasserbad.
    2. Bereiten Sie alle Lösungen aus Stammlösungen (Tabelle 1, Stammlösungen) und mischen Sie die Saccharose mit anderen Inhaltsstoffen mit einem Magnetrührer für jede Lösung.
      1. Vorbereitung 15 ml der Homogenisierung Lösung auf eine Endkonzentration von 20% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 2 mM MgCl 2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin.
      2. Bereiten Sie die 25% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 25% Saccharose (unter Verwendung von 70% Saccharose stock), 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin.
      3. Bereiten Sie die 60% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 60% Saccharose (unter Verwendung von Saccharose-Pulver), Tris 20 mM Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin.
      4. Die Waschlösung 1 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin.
      5. Bereiten Sie die Waschlösung 2bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin.
      6. Die Waschlösung 3 bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2 und 5 mM Taurin.
    3. Beruhigen die Steigung Macher auf einen Magnetrührer und legen einen Rührstab in der Kammer in der Nähe der Ausfahrt, wo die 60% ige Lösung wird eingefügt. Verwenden Sie einen Cut-off-P200 Pipettenspitze am Ausgang des Rohres platziert, um eine ordnungsgemäße Gießgeschwindigkeit zu erzielen.
    4. Guss linearen Gradienten zart durch Verdünnen und Rühren der 60% Saccharose-Lösung mit 25% eine mit 12 ml von jeder Lösung (dh insgesamt 6 Röhrchen für 80 Augen) in vorgekühlte Ultrazentrifugenröhrchen. Rühren Sie die allmählich-Verdünnung 60% Saccharose-Lösung gut. Beruhigen die Geschwindigkeit Gradientenfluss, Eingießen der Lösung reibungslos und nicht zu schnell.
      HINWEIS: Um einen kontinuierlichen, linearen Gradienten zu erhalten, halten Sie die Pipettenspitze Öffnung direkt an der Oberfläche der Lösung für den gesamten Gradienten Formation.
    5. Lassen Sie die Gradienten sitzen auf Eis für etwa 1 Stunde zur Stabilisierung. Halten Sie die Steigungen gekühlt, bis geladen. Die Röhrchen nicht schütteln, um eine Unterbrechung des Gradienten zu vermeiden.
  2. Tissue Sammlung:
    1. Sammeln Gewebe unter dim rotes Licht. Nehmen Sie ein Auge in der einen Hand und stecken Sie die Front mit Rand Rasierklinge, während das Auge weg halten (um Spritzer zu vermeiden; Abbildung 1). Verwenden die Rasierklinge an der vorderen Augapfel in 2 Hälften (Kornea plus mindestens 5 mm in die Sklera) geschnitten. Entfernen Sie das Objektiv und drehen Sie die Augenmuschel von innen nach außen, so dass es über die Spitze eines Fingers damit Freilegen der Netzhaut kann stattfinden.
    2. Mit der Rasierklinge in einem Winkel, sanft kratzen die Netzhaut, Abnehmen leicht und als rosa Schicht erscheinen, vor der Tapetum Oberfläche und an der Sehnervenkopf (Abbildung 1) zu schneiden. Sammeln Sie alle Netzhaut in 2 x 50 ml Röhrchen jeweils mit 15 ml der Homogenisierung Lösung auf Eis.
    3. Retina homogenisierung:
      1. Schütteln Sie die Suspension kräftig von Hand für 2 Minuten, um die verschiedenen Zellschichten unterbrechen, brechen POS aus dem Rest der PR-Zelle, Fragment POS und homogenisieren die Netzhaut Federung.
      2. Filter 3x durch eine Doppelschicht von sauberen Gaze, um große Gewebestücke entfernen und die Durchströmung in saubere 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1). Die Netzhaut-Suspension ziemlich dick, um den Ertrag zu maximieren, drücken Sie vorsichtig auf die Gaze, um die verbleibenden fragmentiert Gewebe nach jeder Filtration lösen.
  3. Photorezeptoraußensegment Fragment (POS) Isolierung:
    1. Legen Sie vorsichtig das rohe Netzhaut prep, um 6-7 ml pro Röhrchen, über 6 x 30 ml Ultrazentrifugenröhrchen mit jeweils 24 ml frisch, gekühlt kontinuierlichen 25-60% Saccharose-Gradienten (Abbildung 1). Gleichen Sie die gegnerischen Rohre entsprechend der Rotor verwendet werden. Ultrazentrifuge bei 106,000 × g für 50 min bei 4 ° C.
    2. Verringert sich die Lösung über der orangerosa Band im oberen Drittel des Gradienten durch Aspiration (2A). Sammeln Sie die orange rosa Band mit einem Cut-off-P1000 Spitze in ein Becherglas. Entsorgen Sie die Ruhe nach dem Neutralisieren mit Bleichmittel (Biomüll).
    3. Verdünnen mit ~ 4-5 Volumina eiskaltem Wash 1 Lösung. Trennen in so viele 30-ml-Röhrchen nach Bedarf. Zentrifuge bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen.
    4. Resuspendieren Pellets in 10 ml Waschlösung 2 und Schleudern bei 3.000 × g für 10 min wie oben beschrieben. Resuspendieren Pellets in 15 ml waschen 3 und Spin wieder bei 3.000 × g für 10 min. Kombinieren Suspensionen aus mehreren Pellets, um die Anzahl der Rohre vor dem Zentrifugieren benötigt in Wash 2 zu reduzieren und waschen 3 Lösungen.
  4. POS Aliquotierung ohne Etikettierung:
    1. Resuspendieren POS in 10 - 20 ml DMEM. Vorverdünnungsvertiefung 10 ul in 490 ul DMEM (1:50) und zählen als auch länglich wie wirbelte POS in eineZellzählung Kammer (2B). Berechnen Ausbeute und Konzentration im POS Partikel pro ml.
      HINWEIS: Die Ausbeute variiert in Abhängigkeit hauptsächlich vom Alter und der Stamm des Schweine / Kühen und Größe der Augen, beispielsweise eine gute Vorbereitung Bereiche 5-8 x 10 9 POS 80 Schweineaugen.
    2. Entscheiden über die endgültige DMEM Volumen (typischerweise 10 - 20 ml) und füge Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 2,5% Saccharose zu ergeben.
    3. Bereiten Aliquots der gewünschten Größe, beispielsweise 5 x 10 7 POS pro Röhrchen für eine 2 ml Resuspensionsvolumen für eine 96-Well-Experiment bei 40 & mgr; l / Vertiefung. Spin 1 Aliquot für 5 min bei 2.300 × g bei RT und auswerten Pelletgröße. Bereiten verschiedenen aliquoten Größen für unterschiedliche Anwendungsmengen wie POS sollte nicht eingefroren und aufgetaut werden zweimal.
    4. Gefriert POS Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
      HINWEIS: Aliquots werden für viele Monate stabil. In unseren Händen können unmarkierten oder markierten POS für mindestens ein Jahr gelagert werden.
  5. POS-Kennzeichnung und Aliquotierung:
    HINWEIS: Wir verwenden typischerweise FITC POS zur Quantifizierung der Phagozytose Assays zu markieren, aber auch andere Farbstoffe, können ebenfalls verwendet werden, je nach Bedarf.
    1. Resuspendieren 1 10 mg FITC Ampulle bei einer 2,5 mg / ml Konzentration in 0,1 M Na-Carbonat-Puffer pH 9,5 hergestellt, indem 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3, pH 8,4, mit 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabelle 2, Stock-Lösungen). Drehen Sie für 1 Stunde bei RT während der Schutz vor Licht und Spin für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zu pelletieren, nicht suspendiert FITC Feststoffe.
    2. Resuspendieren POS Pellet in 10 ml Wash 3 -Lösung (oder DMEM) und 2 ml FITC-Lösung für 80 Augen. Bewahren Sie übrig gebliebenen FITC gefrorenen bei -80 ° C. Drehen für mindestens 1,5 h bei RT. Vor Licht mit Aluminiumfolie.
    3. Wie in Abschnitt 2.3.4 beschrieben waschen beschriftet POS zweimal mit Waschlösung 3, dann ein- oder zweimal in DMEM, bis fast keine freien FITC im Überstand f gesehenraction. Resuspendieren POS in DMEM und gehen Sie wie bei nicht markierten POS zum Zählen und Aliquotierung (Abschnitt 2.4).
  6. Mit POS in Experimenten:
    1. Thaw POS bei RT, und halten Sie sie in der Dunkelheit so viel wie möglich, wenn sie fluoreszenzmarkierten sind. Spin für 5 min bei 2300 × g bei RT. Saugen Sie den Überstand.
    2. Sofort in geeigneten Volumen Assay-Lösung zu resuspendieren, wie durch das Experiment bestimmt. Bei verschiedenen Zeiten des POS Herausforderung, resuspendiert Shop POS bei RT im Dunkeln zwischen Zeitpunkten für mehrere Stunden.

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Ergebnisse

Die Kombination aus der linearen Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation ermöglicht die Trennung der verschiedenen Komponenten des retinalen Suspension durch Dichtegradientenzentrifugation. Schwer größeren retinalen Trümmer und RPE Zellen sinken auf oder nahe dem Boden des Gradienten (2A). Feuerzeug POS und leichter einzelne Zellen oder Zelltrümmer von der Netzhaut wandern als separate Bänder, um die obere Hälfte des Gradienten, der durch das Ende der Zentrifugationsdauer erreichen. Indem die Augen...

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Diskussion

Drei Schritte und Bedingungen sind von entscheidender Bedeutung für eine optimierte Reinigung: Qualität der Guss Gradienten und zarte Farbverlauf Rohre Manipulation, wobei Gewebe gekühlt und im Dunkeln, bis die Sammlung Schritt, Stärke Schütteln von Netzhaut Homogenate die richtige POS Isolation vom Rest der PR zu erhalten Zelle. Wenn einige Probleme in richtig sehen Sie die orange Band auftreten, sind sie sehr wahrscheinlich auf einer der drei oben genannten Gründen (siehe auch den zweiten Absatz des Abschnitts

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Offenlegungen

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs zu EFN), Fondation Voir et Entendre und Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Zuwendungen EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, Festanstellung für EFN) unterstützt und das National Eye Institute der National Institutes of Health (R01-EY13295 zu SCF). Darüber hinaus ist das Institut de la Vision by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique und Kauf de Paris finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Spezifisches Material/Ausrüstung
2-Kammer-GradientenmacherGradientenmacher mit 30-ml-Kammern
Silikonschlauchfür das Gradientengießen
Kleiner magnetischer RührstabRührstab, der in die Gradientenmacherkammer passt
Rote Safelight-LampeInaktinische Lampe zum Sezieren in der dunkel
Ultra Clear 25 x 89 cm RöhrchenBeckman344058Ultrazentrifugationsröhrchen
PP Oak Ridge RöhrchenNalgene3119-005030 ml Zentrifugationsröhrchen
Optima LE-80KBeckman Coulter365668Ultrazentrifuge
SW 32Ti AusschwingrotorBeckman Coulter369694Ausschwingrotor für Ultrazentrifuge
Avanti J-26 XPBeckman Coulter393124Zentrifuge
JA-25.50 RotorBeckman Coulter363058Rotor für Avanti J-26 XP Zentrifuge
FITC Isomer ILife TechnologiesF-1906Fluoreszierender Farbstoff
Sonstiges Material/Ausrüstung
Zählkammer (z.B.
Dunkle Eiskübel mit Deckel
Waagen
Magnetrührer und Haltepol
Gekühlte Mikrozentrifuge
37 &°; C Wasserbad-80
° C gefrierschrank
Verbrauchsmaterialien
Laborkittel Gesundheits-und Sicherheitshandschuhe
Ärmelschützer
Schutzbrillen
Saugeinlagen
Biohazard Müllsäcke und Mülleimer
Weck-Prep KlingenDissektion60 mm/2,25 Zoll breite Rasierklingen
15 cm Kunststoffschale
Sterile Mullblätter
15 und 50 ml RöhrchenGängige Verbrauchsmaterialien
Mikroröhrchen
Aluminiumfolie
mit 3 mm Durchmesser Neubauer oder Malassez)

Referenzen

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