Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Zusammenfassung

Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode zur langfristigen Zeitraffer-Bildgebung von lebenden embryonalen Maus Cochlea Explantate. Das Entwicklungsprogramm für den Bau des hochgeordnete, komplexe Struktur der Säuger Cochlea Erlös für rund 10 Tage verantwortlich. Um Veränderungen in der Genexpression in diesem Zeitraum, und ihre Reaktion auf pharmazeutische oder genetische Manipulation zu untersuchen, ist die Langzeitabbildungs ​​notwendig. Zuvor wurde die Bildgebung in der Regel durch die Lebensfähigkeit von explantierten Gewebes in einer feuchten Kammer auf einem Standardmikroskop beschränkt. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung optimaler Bedingungen für das Kulturwachstum in Bezug auf Feuchtigkeit und Temperatur hat Grenzen für die Länge des Abbildungsexperimente platziert. Ein in einen modifizierten Gewebekultur-Inkubator integrierten Mikroskop bietet ein hervorragendes Umfeld für langfristig-Live-Bildgebung. Bei dieser Methode zeigen wir, wie die embryonale Maus Cochlea Explantate zu etablieren und wie man einen Inkubator Mikroskop verwenden, um Zeitraffer Imagi leitenng unter Verwendung sowohl Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie, um das Verhalten eines typischen embryonalen Tag (E) 13 Cochlea Explantat und Sox2, einem Marker der prosensory Zellen der Cochlea, über 5 Tage zu untersuchen.

Einleitung

Die Säugetier Cochlea ist eine hochgeordnete komplexes Organ. Bei der Maus zwischen der Entstehung des primitiven Innenohr aus dem Ohrbläschen am Tag E11 und die Fertigstellung des Entwicklungsprogramms der frühen postnatalen Stadien, mehrere Wellen der Zellsignalisierung und koordinierte Veränderungen in der Genexpression statt. Laufen von der Basis bis der Ductus cochlearis Apex ist die Geräuscherfassungs Sinnesepithel oder Corti-Organ. Entwicklung des Corti-Organ ist vorzüglich so gesteuert, dass am Ende der Entwicklung, wird es aus einer einzigen Reihe von inneren Haarzellen bestehen, drei Reihen von äußeren Haarzellen mit fünf Reihen von Stützzellen (zwei Reihen von Säulenzellen, drei setzt Reihen von Deiters 'Zellen) ^ein. Abweichung von dieser genauen Reihenfolge ergibt Hörverlust, heighlighting die Bedeutung der studye OFTHE Entstehung und Strukturierung der sensorischen epithemlium ^2.

In-vitro-Kultivierung von embryonalen Maus cochlea ist ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung der Mechanismen der Entwicklung des Corti-Organ. Diese Technik wurde 1974 gegründet und in den letzten 40 Jahren verwendet worden, um viele der Mechanismen, mit denen die sensorische Epithel angegeben ist und der Corti-Organ gegründet ³ aufzuklären. Die Cochlea ist ein komplexes Organ mit dynamischen Entwicklungsprozesse; eine Manipulation kann so lange wie sieben Tage manifestieren ^1. Zum Beispiel, wenn das Hinzufügen GSK 3β-Inhibitoren zu einer Cochlea Explantatkultur in E13 die optimale Inkubationszeit zu beobachten, eine robuste Wirkung der Verbindung sechs Tagen ^4.

Echtzeit-Bildgebung des Entwicklungs Cochlea ermöglicht Untersuchung Veränderungen in der Morphologie des Corti-Organ, Veränderungen in der Genexpression, Verfolgung von Tierwanderung, wuchernden oder sterbenden Zellen und ermöglicht Echtzeit-Beobachtung der Ergebnisse von pharmazeutischen Wirkstoffen und die Störung der Signal Wegen. Bisher leben Bildgebung der Cochleawurde hauptsächlich durchgeführt unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um Bild kleine Bereiche des Corti-Organ über kurze Zeiträume ^5-8, aber diese Technik hat Einschränkungen aufgrund Explantat Lebensfähigkeit. In Abbildung der Auswirkungen von Langzeitmanipulationen an langsame Entwicklungsprozessen ist die Abbildungsumgebung entscheidend. Typischerweise verwendet ein konfokales Live-Bildgebungssystem einen befeuchteten Kunststoffbox, die am Mikroskop sitzt. Hitze und Feuchtigkeit kann durch die Lücken in dem Inkubieren Feld trifft dort auf den Mikroskoptisch, durch den Zugriffsfenstern, durch die Scharnieröffnungen und durch die Lücken um verschiedene Teile des Mikroskop- wie dem Ziel oder der Lichtquelle entweichen. Dies ist nicht optimal für die Gesunderhaltung der Explantate für mehr als zwei oder drei Tage.

Wir definieren "Inkubator Mikroskops als invertiertes Mikroskop in einem Standard-CO ₂ -Inkubator abgedichtet, anstatt einem Inkubator auf der Mikroskop aufgebaut. Ein Inkubator Mikroskop exneigt die Lebensdauer des Experiments, dass anstatt Abbildungs ​​über zwei oder drei Tage, können die Proben für bis zu zwei Wochen abgebildet werden. Ein Inkubator Mikroskop eine ausgezeichnete Umgebung für das Zellwachstum und Differenzierung, mit minimaler Störung zu Kulturen und Standard kontrollierten Bedingungen Explantation. In Studien, die über mehrere Tage stattfinden, ist es üblich, den Abbildungsproben auf einer täglichen Basis, indem sie aus dem Inkubator entfernt und trägt sie zu einem invertierten Fluoreszenzmikroskop greifen. Während dieser Ansatz funktionieren kann, das Entfernen der Gerichte aus dem Inkubator zufügt Belastung der empfindlichen Entwicklungs Gewebe. Änderungen der Säuregehalt des Kulturmedium und Temperaturschwankungen aufgrund der Entnahme aus dem Inkubator in suboptimalen Entwicklung und ungesunden Gewebes führen. Abbilden der gleichen Region auf der gleichen Brennebene und in der gleichen Orientierung zu jedem Zeitpunkt ist eine große Herausforderung. Durch die Verwendung eines automatisierten Systems in einem Inkubator ist es möglich gesund zu haltenGewebe, um Bilder bei mehreren Zeitpunkten zu sammeln und um sicherzustellen, dass derselbe Bereich in jedem Rahmen erfasst. In den letzten Jahren mehrere integrierte Mikroskop Gewebe Brut entwickelt, diese nicht nur in der klinischen Praxis ⁹ aber auch in Stammzellen und Krebsforschung ^10,11 nützlich.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für langfristig Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Cochlea-Explantate. Wir verwenden eine automatisierte Mikroskopie System innerhalb einer Standard CO ₂ Inkubator, die die Fähigkeit, Bilder von mehreren Proben in festgelegten Zeitpunkten zu erfassen hat. Das System besteht aus einem inversen Mikroskop innerhalb Inkubator gesetzt. Proben werden in einem rotierenden Podest, das Bildgebung mehrerer Proben ermöglicht zu jedem Zeitpunkt platziert. Beleuchtung, Bildaufnahme und Drehung des Podiums werden durch ein automatisiertes System durch Metamorph-Software betrieben gesteuert. Durch das Setzen eines bilderzeugenden Routine mit der Bediensoftware können wir einen Versuchsaufbau für bis zu tw laufeno Wochen mit minimaler menschlicher Intervention. In diesem Beispiel verwenden wir sowohl Hellfeld und Fluoreszenz zu großen Wachstum und Umlagerung der Cochlea, und insbesondere die prosensory Region zeigen. In diesem Experiment wird cochleae von Sox2 ^EGFP Reportermäuse an embryonalen Tag E13 seziert werden. In vitro-Kulturen wird aufgebaut und dann über fünf Tage abgebildet.

Protokoll

Mausgewebe wurde von Sox2 ^EGFP -reporter Mäusen ¹² gehalten und in Übereinstimmung mit Canadian Council on Animal Care Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingeschläfert geerntet.

1. Die Kultivierung embryonaler Cochleae

1. Ergänzung Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) durch Mischen 8.89 ml DMEM, 1 ml fötales Rinderserum (FBS), 100 & mgr; l 100x N2 ergänzen, und 10 ul 10 mg / ml Ciprofloxacin. Ergänzung Hank Balanced Salt Solution (HBSS), die durch Mischen von 495 ml HBSS mit 5 ml 100% HEPES.
2. Bereiten Glasboden Kulturschalen:
   1. In einem Abzug mit laminarer Strömung, resuspendieren 200 ul Basalmembran Extrakt Substrat in 5 ml DMEM. Bereiten 35 mm Durchmesser Glasboden Kulturschalen mit 10 mm-Vertiefungen. Je 150 ul Substrat / DMEM in die Mitte eines jeden Glasbodenschale. Diese Gerichte werden nach 40 min Inkubation verwendet werden, oder kann in einem CO ₂ gespeichert Inkubator bei 35 ° C für mindestens eine Woche.
      HINWEIS: Glasbodenplatten sind aus den folgenden Gründen verwendet: um sicherzustellen, dass der Boden der Schale ist transparent und eignet sich für die Bildgebung, um einen Brunnen in der Mitte der Schale, die die Explantate in einer leicht lokalisiert Bereich absetzen und schließlich ermöglicht erstellen so daß nach einem Versuch die Probe für eine nachfolgende Analyse und Immunfärbung verarbeitet werden.
3. Bereiten Sie die Arbeitsstation und Werkzeuge:
   1. Schalten Sie die laminare Strömung Sterilbank und abspritzen mit 70% EtOH, um eine saubere Arbeitsfläche zu erstellen. Soak Zangen, Löffel und eine schwarze 184 Siliconelastomer-Spiegel (eine Mischung aus 184 Silikon-Elastomer (10 Teile), Härter (1 Teil) und Holzkohlepulver (2,5 g)) in 70% EtOH.
4. In der sauberen Arbeitsstation, Ernte Embryonen für das Experiment. Sammeln Embryonen des entsprechenden Schwangerschafts in eiskaltem HBSS ergänzt mit 1% HEPES.
   1. Bestimmen Sie eine externe oder sichtbare Organ, das zeigen wirdReporteraktivität und untersuchen die Embryonen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop. Sammeln Sie die Embryonen, die Reporteraktivität zeigen in eiskaltem HBSS mit 1% HEPES da diese ergänzt sind Gegenstand des Experiments.
5. Sammeln Schläfenbeine:
   1. Schnell arbeiten, mit einem kühlen Lichtquelle und einer feinen Pinzette, sammeln die Köpfe der Welpen. Achten Sie darauf, an der Halswirbel und unter dem Kiefer Clip um eine Beschädigung der Schläfenbeine zu vermeiden.
   2. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel. Entfernen Sie das Gehirn, schneiden Sie die Vorderseite des Kopfes, und übertragen Sie die hintere Schädel frisches eiskaltes HBSS mit 1% HEPES in einem sauberen Teller ergänzt. Sorgfältig sezieren Sie die Erdnussförmigen Schläfenbeine darauf achten, dass das Gleichgewichtssystem in Takt zu halten.
6. Präparieren Sie die Cochlea:
   1. Übertragen Sie die Schläfenbeine zu einem schwarzen Silikonelastomer beschichtete Schale in eiskaltem HBSS ergänzt mit 1% HEPES, die vestibulären Bereich des Knochen Pin. Legen Insektenstifte aneinem schrägen Winkel zur Stabilisierung des Schläfenbeins und schaffen Raum für die Zange. Pinning ist ein entscheidender Schritt im Prozess, als ob das Schläfenbein ist erlaubt, zu viel ist es sehr schwierig, eine intakte Cochlea ernten zu bewegen.
   2. Den Knorpel rund um das Cochlea vorsichtig entfernen. Stecken Sie ein Zinken der Zange in den Knorpel an der Außenkante der Basis der Cochlea und Clip ein Loch in den Knorpel.
   3. Clip eine Klappe an der Seite, legen Sie die Zinken der Zange und sanft trennen das Dach des Kanals aus dem Knorpel. Horizontal Clip über der Spitze und diagonal, und heben Sie den vorderen Teil der Kapsel. Legen Sie eine Zinke der Zange zwischen den verbleibenden Knorpel und den Kanal und sanft Clip aus dem letzten Abschnitt. Die apikale Oberfläche der Cochlea wird nun ausgesetzt.
   4. Beginnend an der Basis, fangen die Gegend, wo das Dach des Kanals trifft das Cochlea-Epithel und öffnen Sie den Schneckengang. Ziehen Sie leicht vom Dach, Trimmenwenn notwendig, bis es vollständig entfernt ist. Schneiden Sie alle Teile der Membran nach links auf der medialen Seite des Kanals. Reinigen Sie den Kanal von überschüssigem mesenchymalen Gewebe und lösen Sie den Kanal aus dem Gleichgewichtssystem.
7. Kultur die Explantate:
   1. Ein Explantation, Lumenoberfläche auf, in der Mitte des ein Substrat aufgetragen Glasbodenkulturschale vorsichtig abziehen gesamte Flüssigkeit und lassen Sie für zwei Minuten. In 150 ul ergänzt DMEM tropfenweise zu dem Explantat, kümmert sich nicht um sie zu stören. Sollte der Explantation schweben frei, neu zu positionieren mit einer Pinzette, aber darauf achten, dass das Explantat setzt sich am Boden der Schale, so dass sie auf das Substrat zu befestigen.
   2. Legen Sie die Glasbodenschalen in eine tiefe 12 cm Durchmesser Petrischale mit einer kleinen Schüssel mit sterilem Wasser auf Feuchtigkeit zu halten. Setzen die Kulturen auf eine 35 ° C-Inkubator über Nacht damit das Explantat auf das Substrat anzubringen und zu glätten.

2. Live-Imaging

1. Wählen Explantatproben. Verwenden Sie ein Fluoreszenzstereomikroskop, um den Zustand eines jeden explantiert Cochlea bewerten. Wählen Explantate Nur wo der Kanal ist intakt und vor Glasbasis angebracht bis zur Spitze.
2. Gesetzt den Inkubator bei 35 ° C mit 5% CO ₂ zur Kultur Cochleagewebe. Setzen Sie die Kulturen in den Brutschrank Mikroskop:
   1. Vorsichtig absaugen die ergänzt DMEM und ersetzen mit mindestens 500 & mgr; l frisches Medium. Zur Abbildung von bis zu 6 Tagen ist 1-1,5 ml besser. In Fällen, in denen Explantate lose befestigt, Pipette einen Ring von Medien rund um den Rand der Schale. Diese zusätzliche Flüssigkeit wird eine Miniatur "feuchten Kammer" ohne die Explantation zu stören zu machen, während sie an der Matrix zu befestigen geht weiter.
      1. Alternativ frisch Verwendung Teller abdeckt, die Deckel zu öffnen, während die Schale bleibt in seinem Einbau in das Mikroskop, wenn Reagenzien müssen während der Intervalle zwischen Bildsammlungen ausgetauscht werden. Klappbare Schalenabdeckungen ermöglichen die Deckel zu seingeöffnet, ohne zu stören die Proben oder das Entfernen der Gerichte aus deren Einstellungen. Dies hält ihre exakte Position für die nachfolgende Bildaufnahmen.
   2. Legen Sie die Glasbodenschalen mit entsprechenden Proben in den Probenschalenhalter. Das Mikroskop weist in diesem Beispiel eine sich drehende Plattform, die acht 35 mm Probenschalen hält.
   3. Unter dem Laminarströmungshaube ersetzen die Kunststoffdeckel mit Glasdeckel und legen Sie das Geschirr in die Probenschalenhalter. Platzieren Sie die Probenschale Halter im Inkubator kümmert sich nicht um die Explantate aus dem Boden der Schale zu entfernen oder um die Medien zu stören.
3. Richten Sie die Imaging-Routine:
   1. Schalten Sie das Mikroskop, UV-Lampe und Kamera und öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware.
   2. Suchen Sie die Proben, wählen Sie ein Imaging-Bereich, Fokusebene und die Belichtungszeiten für jedes Gericht in Folge. Wählen Sie die Fokusebene abhängig nicht nur von der Ansicht der Explantation zu der Zeit des Startens, aber also bedenkt, wie das Gewebe bewegen und wie lange der Zeitverlauf ausgeführt werden soll.
   3. Legen Sie einen Z-Stack Zentrierung um den ausgewählten Fokusebene im Fluoreszenzkanal. Legen Sie die Häufigkeit und Länge der Probenahme für das Experiment. Die Häufigkeit der Probenahme wird durch die Zeit, um Bilder zu sammeln nimmt begrenzt werden, so sollte dies nach der Auswahl Sichtfelder und Setzen einer Z-Stack bestimmt werden. In diesem Fall nimmt der Probenahme alle 30 min über fünf Tage. Die Versuchsdauer kann bis zu 14 Tagen.
4. Generieren Sie einen Film:
   1. Am Ende des Zeitablauf Periode öffnen Sie die Bilddateien. In diesem Fall Metamorph-Software, die sequentielle Sammelstellen öffnet verwendet. Bild für Bild wählen Sie die beste Brennebene zur Darstellung der Zellpopulation von Interesse.
   2. Konvertieren Sie diese Bilder zu einer .avi-Datei oder exportieren Sie sie als Montage, um eine Reihe von Bildern, die geöffnet werden können, und analysiert in Bildbearbeitungssoftware oder umgebaut, mehrere forma generierents mit Videobearbeitungssoftware.

Ergebnisse

Hier zeigen wir eine Montage (Abbildung 1) und einen Film (Abbildung 2) zeigt, wie ein typischer organotypischen Cochlea Explantat wird wachsen, wenn auf E13.5 plattiert. A Sox2 Reporter Maus wurde verwendet, um die prosensory Region zu visualisieren. Der Film zeigt, daß die Cochlea erfährt Wachstum und Konvergenz und Ausdehnung, werden die Zellen in dem seitlichen Bereich des grünen Sox2 Domäne scheint wie das umgebende Gewebe dehnt teilen. Dies ist eine Eigenschaft d...

Diskussion

Es gibt mehrere technische Punkte, die bei Kulturen festgelegt und bei der Einrichtung der Zeitraffer-Mikroskop, um für langfristige Bildgebung.

Wir verwenden Basalmembranmatrix als Substrat zum Kultivieren von Cochlea-Explantate, doch sollte das Substrat für den Zelltyp abgestimmt werden. Zum Beispiel, um Bild neuronalen Kulturen, kann es besser sein, eine Fibronectin-Beschichtung bereitzustellen. Inkubation Temperatur und Gaszusammensetzung auch nach Gewebetyp gewählt werden. Wahl des Alte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medien	Gibco	12430	Mehrere Marken stellen diesen
Basalmembran-Extrakt her	Corning	354230	Matrigel. Alternative ähnliche Produkte sind von anderen Anbietern erhältlich. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extrazellulär+Matrix+Proteine+ECMs+und+Bindung+Faktoren%28Biowissenschaften%29|Matrigel+Basement+Membran+Matrix+%28Lifesciences%29
Fötales Rinderserum	Gibco	16000044	Mehrere Marken stellen dies her http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
HEPES	Gibco	5630080	Mehrere Marken stellen dies her http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
100 x N2 Ergänzung	Gibco	17502-048	Mehrere Marken stellen dies her http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850-5G-F	Mehrere Marken stellen dies her http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
Hank's ausgewogene Salzlösung	Gibco	14170161	Mehrere Marken stellen dies her. Sollte vor Gebrauch nachgefummelt werden. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Feine Pinzette	Fine Science Werkzeuge	11254-20	Größennummer 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Kürette	Fine Science Tools	10080-05	Größe 1 mm  http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insektenstifte	Fine Science Tools	26001-35	Muss aus Edelstahl sein http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm Kunststoffschalen	Corning/Falcon	351006	Mehrere Marken stellen diese
Holzkohle	her Sigma Aldrich	05105-250G	Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 Silikonelastomer	Dow/Corning	SYLGARD® 184 SILIKONELASTOMER-KIT	Das Geschirr wird mehrere Wochen im Voraus hausgemacht. Silikonelastomer kann von jedem Lieferanten sein.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Glasbodenschalen	MatTek	P35G-0-10-C	Die Abmessungen der Schale werden durch die Spezifikationen des Bildgebungssystems bestimmt.  35 mm Durchmesser, 10mm Vertiefung, Deckglas Nummer 0 passend für Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2
Stereomikroskop	Zeiss	495101-9804-000	Modell Stemi 2000. Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Kaltlichtquelle	Zeiss	000000-1063-182	Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluoreszierendes Stereomikroskop	Leica microsystems	Kontakt Leica microsystems	Leica M165-FC. Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Inkubator Mikroskop + Bildgebungssoftware	Olympus	Contact Olympus	Inverses Mikrokod, das in einem CO2-Inkubator versiegelt ist. Vivaview FL Inkubatormikroskop mit eigener Metamorpoh-Bildgebungssoftware. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Reinbank	Thermo Scientific	51029701	Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2-Inkubator	Thermo Scientific	3310	Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar-Flow-Haube	Thermo Scientific	51026651	Mehrere Marken stellen ähnliche Artikel her http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html