Methodenartikel

Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der Helicobacter pylori Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

DOI:

10.3791/52122

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21. November 2014

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der onkogenen Bakterienorganelle, die als Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS) bekannt ist. Wir stellen fest, dass das Cag-T4SS auf der Oberfläche von H. pylori als Reaktion auf unterschiedliche Bedingungen der Eisenverfügbarkeit unterschiedlich produziert wird.

Zusammenfassung

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Helicobacter pylori ist ein helikalförmiges, gramnegatives Bakterium, das die menschliche Magennische der Hälfte der menschlichen Bevölkerung besiedelt1,2. H. pylori ist die Hauptursache für Magenkrebs und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit3. Ein Virulenzfaktor, der mit einem erhöhten Risiko für Magenerkrankungen in Verbindung gebracht wurde, ist die Cag-Pathogenitätsinsel, eine 40 kb große Region innerhalb des Chromosoms von H. pylori, die für ein Typ-IV-Sekretionssystem und das verwandte Effektormolekül CagA4,5 kodiert. Das Cag-T4SS ist für die Translokation von CagA und Peptidoglykan in Wirtsepithelzellen verantwortlich5,6. Die Aktivität des Cag-T4SS führt zu zahlreichen Veränderungen in der Wirtszellbiologie, einschließlich der Hochregulierung der Zytokinexpression, der Aktivierung proinflammatorischer Signalwege, des Umbaus des Zytoskeletts und der Induktion onkogener Zellsignalnetzwerke5-8. Der Cag-T4SS ist eine makromolekulare Maschine, die aus Baugruppen besteht, die die innere und äußere Membran überspannen und sich von der Zelle in den extrazellulären Raum erstrecken. Der extrazelluläre Teil des Cag-T4SS wird als "Pilus"5 bezeichnet. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Cag-T4SS-Pili an der Wirt-Pathogen-Grenzfläche gebildet werden9,10. Die Umweltmerkmale, die die Biogenese dieses wichtigen Organels regulieren, bleiben jedoch weitgehend im Dunkeln. Kürzlich berichteten wir, dass Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit die Cag-T4SS-Aktivität und die Pilus-Biogenese erhöhten. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, um H. pylori unter unterschiedlichen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit vor der Co-Kultur mit menschlichen Magenepithelzellen zu züchten. Des Weiteren stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Visualisierung des hyperpiliierten Phänotyps vor, der unter eisenbeschränkten Bedingungen durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie-Analysen gezeigt wird.

Einleitung

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H. pylori-Infektion ist ein signifikanter Risikofaktor für Magenkrebs1. Die Krankheitsverläufe variieren jedoch und hängen von zahlreichen Faktoren ab, wie z. B. der Wirtsgenetik, der genetischen Vielfalt der H. pylori-Stämme und Umweltfaktoren wie der Ernährung des Wirts11. Frühere Berichte haben gezeigt, dass eine Korrelation zwischen einer H. pylori-Infektion, Eisenmangel (gemessen an verringerten Ferritin- und Hämoglobinkonzentrationen im Blut) und einer erhöhten proinflammatorischen Zytokinproduktion, einschließlich der IL-8-Sekretion, besteht, die letztendlich zu einem verstärkten Fortschreiten der Magenerkrankung führt12. Eine akute H. pylori-Infektion ist auch mit einer Hypochlorhydrie verbunden, die die Fähigkeit des Wirts, den Nährstoff Eisen aufzunehmen, beeinträchtigt und letztendlich zu Veränderungen der Eisenhomöostase führt13. Diese klinischen Befunde deuten darauf hin, dass die Verfügbarkeit von Eisen in der gassistischen Nische ein wichtiger Faktor für den Krankheitsverlauf sein könnte. Tatsächlich haben Tiermodelle der H. pylori-Infektion gezeigt, dass ein geringer Eisenkonsum über die Nahrung die Magenerkrankung verschlimmert14. Die reduzierten Eisenwerte bei diesen Tieren machen es erforderlich, dass H. pylori eine Eisenaufnahmereaktion induziert, um das für die bakterielle Replikation benötigte Eisen zu erhalten. H. pylori hat die Fähigkeit, den Eisentransport innerhalb der Wirtszellen zu stören, um die bakterielle Replikation auf CagA-abhängige Weise zu erleichtern15. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Cag-Pathogenitätsinsel durch den eisenresponsiven Transkriptionsfaktor Fur16,17 reguliert wird. Darüber hinaus werden Cag+-Stämme mit vermehrten Entzündungen und Magenerkrankungen wie Krebs in Verbindung gebracht1. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, bei dem H. pylori die Cag-T4SS-Expression verändert, um Eisen aus Wirtszellen zu gewinnen, die sich in einer eisenarmen Umgebung befinden, was zu verschlimmerten Krankheitsergebnissen führt.

Zwei Faktoren, die Entzündungen und Morbidität erhöhen, sind die Cag-Expression und die geringe Eisenaufnahme über die Nahrung. Diese Fakten stützen die Hypothese, dass eine verminderte Eisenverfügbarkeit die Produktion von Cag-T4SS-Pili an der Schnittstelle des Wirtserregers erhöht, was zu einer Verschlechterung der Magenerkrankung führt11-14. Das Ziel der in diesem Manuskript vorgestellten Methode ist es, die Rolle des Mikronährstoffs Eisen bei der Regulation der Cag-T4SS-Pilus-Biogenese zu etablieren. In früheren Arbeiten haben wir zwei Ansätze verwendet, um einen eisenabhängigen Anstieg der Cag-T4SS-Expression zu beobachten. Zunächst wurden Ausgangsstämme von Tieren analysiert, die mit hoher und niedriger Eisendiät gehalten wurden, und zeigten, dass eisenarme Diätstämme mehr Cag-T4SS-Pili produzierten als eisenreiche Diätstämme14. Zweitens führte die Züchtung des Stammes H. pylori 7.13 in vitro unter eisenhaltigen Bedingungen zu einer reduzierten Pili-Bildung, während Zellen, die in Gegenwart eines Eisenchelators gezüchtet wurden, signifikant mehr Pili produzierten.

Wir haben die eisenabhängige Regulation des Cag-T4SS-Pili-Phänotyps weiter untersucht und bieten das folgende optimierte Protokoll und repräsentative Ergebnisse an, die mit einem zusätzlichen Helicobacter pylori-Stamm, PMSS1, durchgeführt wurden. Der Grundgedanke hinter der Entwicklung dieser Technik bestand darin, eine erhöhte Cag-T4SS-Aktivität unter Bedingungen der Eisenlimitierung mit einer erhöhten Cag-T4SS-Pilusbildung zu korrelieren. Die breitere Implikation und Anwendung dieser Technik wird optimierte Kulturbedingungen bieten, die zu einer erhöhten Produktion der Cag-T4SS-Pili führen. Dieser Assay wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, die Zusammensetzung und Architektur des Cag-T4SS durch Anreicherung für dieses wichtige bakterielle Oberflächenmerkmal zu bestimmen. Die Probenvorbereitung und -visualisierung mittels Feldemissions-Kanonenelektronenmikroskopie hat zahlreiche Vorteile gegenüber alternativen Techniken, wie z.B. lichtmikroskopischen Methoden zur Visualisierung des Cag-T4SS, und ist für Forscher geeignet, die daran interessiert sind, die Regulation dieser Organellezu untersuchen 10.

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Protokoll

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1. H. pylori Wachstum bei unterschiedlichen Bedingungen von Iron Verfügbarkeit und Co-Kultur mit Menschen Magenepithelzellen

  1. Wählen H. pylori-Stamm PMSS1 für diese Untersuchungen, weil es ein intaktes cag Pathogenität Insel und drückt eine IV-Sekretionssystem Funktionieren Typ. Auch verwenden einen isogenen Cage Mutante (PMSSI Δ Cage) als Negativkontrolle. Wachsen Bakterien auf TSA-Platten mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten) für 24 h ergänzt war, bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2.
    HINWEIS: Bereiten Reagenzien und montieren Materialien wie in der Materialien und Geräte Tabelle skizziert. Endkonzentrationen für jedes Reagenz ist in Klammern aufgeführt.
  2. Kratzen Bakterien von der Platte mit einem sterilen Wattestäbchen und impfen in modifizierte Brucellabrühe aus den Komponenten (siehe Materialien und Geräte Tabelle) und mit Cholesterin ergänzt. Kulturen über Nacht bei 37 inkubieren° C in Raumluft mit 5% CO 2, ergänzt mit 200 Umdrehungen pro Minute (rpm) schüttelt.
    HINWEIS: Cholesterin anstelle von fötalem Rinderserum auf die Tatsache zurückzuführen, dass Serum-Komplex verwendet; mit zahlreichen Quellen von Nährstoffen Eisen wie Häm, die Variabilität der Ergebnisse verursacht.
  3. Am Tag der Kultivierung bakterieller, Samen AGS menschlichen Magen-Epithelzellen (ATCC CRL-1739) auf Poly-D-Lysin-behandelten Deckgläschen in 12-Well-Platten (ca. 1 x 10 5 Zellen pro Vertiefung).
  4. Am folgenden Tag, verdünnte Bakterienkulturen bis zu einer OD600 von 0,3 in modifizierten Brucellabrühe allein oder mit 100 & mgr; M FeCl 3, 200 & mgr; M Dipyridyl (ein synthetisches Eisen-Chelator) oder 200 uM Dipyridyl plus 250 & mgr; M FeCl 3 ergänzt. Diese Kulturen für 4 Stunden bei 37 ° C inkubieren in Raumluft mit 5% CO 2, ergänzt mit Schütteln bei 200 Upm.
  5. Zentrifuge Bakterien bei 1.000 xg, um Zellen zu sammeln und die Überstände zu entfernen, bevor Resuspendieren in ein gleiches Volumen frischer modifiziert Brucella-Brühe, ergänzt mit Cholesterin. Maßnahme OD600 der Kultur (OD 600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 Zellen / ml) und Bakterien in den Epithelzellen in einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1. Führen serielle Verdünnungen und Platte Bakterienzellen auf Blutagarplatten, um bakterielle Zelllebensfähigkeit zu beurteilen.
  6. Inkubieren H. pylori und AGS menschlichen Magen-Epithelzellen Co-Kulturen für 4 Stunden bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 in statischen Bedingungen vor dem Durchführen der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Probenvorbereitung.

2. SEM Probenvorbereitung zur H. Visualisieren pylori Cag-T4SS Pili

  1. Entfernen H. pylori und AGS Co-Kulturen aus dem Inkubator und dekantieren Kulturüberstand (außer für IL-8 ELISA). Vorsichtig mit 0,05 M Natriumcacodylat-Puffer (pH 7,4), drei Mal waschen. Fix Proben für 2-4 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von 2,0% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 0,05 M Natriumcacodylatpuffer. Nach der primären Fixierung, waschen Proben dreimal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer.
  2. Zuführen Sekundärfixation mit 0,1% Osmiumtetroxid in 0,05 M Natriumcacodylatpuffer in zwei aufeinanderfolgenden 10 min Fixierungsschritte. Nach sekundäre Fixierung, waschen Proben dreimal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer.
  3. Nach der primären und sekundären Fixierung, Dehydratisierung Proben durch aufeinanderfolgende Waschen mit steigenden Konzentrationen von Ethanol gemäß Tabelle 1.
  4. Nach Ethanol-Dehydratisierung, führen drei sequentielle Wasch von flüssigem Kohlendioxid. Dann trockenen Proben an einem kritischen Punkt mit einem kritischen Punkt Trockner bei einer Temperatur von 31,1 ° C und einem Druck von 1073 PSI.
  5. Berg Deckgläser auf Aluminium SEM Proben Stubs und malen Sie mit einer dünnen Linie von kolloidalem Silber an der Probenkante geeignete Erdung zu erreichen und zu vermeiden Lade während SEM-Bildgebung.
  6. Coat Proben mit 5 nmGold-Palladium mit einem Sputter-Mantel Maschine Probe Sekundärelektronensignal und Kanteneffekt zu erhöhen.

3. Imaging Parameter für die hochauflösende SEM Analysen

  1. Ansicht Proben mit einem Feldemissions-Gun Rasterelektronenmikroskop (FEG-SEM).
  2. Bild in einem Hochvakuumbetrieb bei einem Arbeitsabstand von 5-10 mm.
  3. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung bis 5 kV.
  4. Stellen Punktgröße auf 2-2,5.
  5. Kippen Sie die Probe zwischen 15-25 Grad, um eine bessere Sicht auf die Wirt-Pathogen-Schnittstelle zu erreichen.
  6. Priorisieren Abbilden Bakterien haft zu den Kanten der Epithelzellen bei hoher Vergrößerung Betrachtung, da diese Bereiche der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen sind für die Pili-bildenden Bakterien angereichert.

4. Statistische Analysen zu Pili Quantifizierungen auswerten

  1. Analysieren H. pylori CAG T4SS Pili mit ImageJ Software Anzahl von Pili / Zelle sowie Prozent der Zellen zu quantifizieren zeigt die piliated pheNOTYPE pro Erklärung unten.
  2. Offene mikroskopische Aufnahme Dateien in ImageJ Software. Identifizierung Pili als Strukturen zwischen der Bakterienzelle und Wirtszelle mit einheitlicher Breite (10-13 nm) und Länge (60-150 nm) gebildet.
    HINWEIS: Die Pilus Struktur auf WT Bakterienstämme vorhanden, aber abwesend isogenen Stämme wie Δ Cage Mutantenstämme, die eine Inaktivierung des Gens die Haupt ATPase, die Befugnisse Typ IV Sekretion Pilus-Zusammenbau kodiert Hafen ist.
  3. Kalibrieren Sie das Messwerkzeug durch Ziehen einer Linie mit der Geraden Werkzeug und dann auf der Registerkarte "Analysieren". Wählen Sie "Scale" aus dem Dropdown-Menü und geben Sie den Vergrößerungs bar Wert in das Feld "bekannte Strecke" und stellen Sie die Einheit der Länge in der entsprechenden Einstellung (nm). Klicken Sie auf "OK".
  4. Messen Sie Cag-T4SS Pili mit der geraden Linie Werkzeug, um über die Länge oder Breite des Pilus ziehen und drücken Sie "Strg-M", um jeden Pilus messen. Beachten Sie eine Dialogbox mit den gemessenen Werten. Notieren Sie diese Werte oder Kopieren und Einfügen in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
  5. Verwenden Sie die Länge und Breite Parameter vorher festgelegten 24, Missachtung Features, die passen nicht in das Profil der Cag-T4SS. Dann quantifizieren die Anzahl der Pili basierend auf Werten, die in den 10 bis 13 nm Breite und 60 bis 150 nm Länge Cutoffs sind.
  6. Analysieren Sie den Quantifizierung von Pili statistisch durch zweiseitigen Student t-Test mit GraphPad Prism Software.

5. Optional: Auswertung der IL-8-Sekretion mit Pilus Produktion Korrelieren

  1. Mit Überstände aus Schritt 2.1, führen Sie eine IL-8 ELISA gemäß den Herstellerangaben mit dem Kit (siehe Materialien und Ausstattungstabelle).
  2. Analysieren Sie den IL-8 durch Wirtszellen sezerniert und berechnen die prozentuale IL-8 Induktion nach WT PMSS1 allein im Medium gezüchtet. Statistische Analysen mit zweiseitigen Student t-Test mit GraphPad Prism software.

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Ergebnisse

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In diesem Bericht haben wir gezeigt, dass die Bedingungen der unterschiedlichen Eisenverfügbarkeit die Fähigkeit, H. modulieren pylori Cag-T4SS Pilus-Biogenese im Wirt-Pathogen-Schnittstelle. Wenn in Medium allein, H. kultiviert pylori bildet einen Durchschnitt von 3 Pili / Zelle. Wenn H. pylori ist in Eisen gewachsen erschöpfen Bedingungen (unter Verwendung des synthetischen Chelator Dipyridyl), die Unter hemmend auf das Bakterienwachstum (Abbildung 1) sind,...

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Diskussion

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Eisen ist ein wesentliches Spurenelement für die meisten Lebensformen, einschließlich bakterieller Pathogene. In dem Bemühen, die Lebensfähigkeit der eindringenden Mikroorganismen zu beschränken, Wirbeltierwirten maskieren Nährstoff Eisen in einem Prozess als "Ernährungs Immunität" 18 bekannt. In Reaktion darauf wurden bakterielle Pathogene entwickelt, um Eisen als globales Signal-Molekül zu verwenden, um die Umgebung zu erfassen und zu regeln für die Ausarbeitung von Virulenz-Eigenschaften, wie Eis...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde unterstützt durch den Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 und den CTSA Award UL1TR000445 vom National Center for Advancing Translational Sciences. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Center for Advancing Translational Sciences oder der National Institutes of Health dar. Rasterelektronenmikroskopie-Experimente wurden zum Teil mit Hilfe der VUMC Cell Imaging Shared Resource durchgeführt, die durch NIH-Zuschüsse CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 und EY08126 unterstützt wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Modifizierte Brucella-Brühe
Pepton aus Kasein (10 g/L)Sigma70172
Peptischer Verdau aus tierischem Gewebe (10 g/L)Sigma70174
Hefeextrakt (2 g/L)Sigma92144
Dextrose (1 g/L)SigmaD9434
Natriumchlorid (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Cholesterin (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018
Eisenchlorid (100 oder 250 μM)Sigma157740-100G
Dipyridyl (200 μM)SigmaD216305-100G
modifiziertes RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Fötales Rinderserum ( 100 ml/L)Life Technologies10438-026
Elektronenmikroskopie-Vorbereitung
Paraformaldehyd (2,0 % wässrig)Elektronenmikroskopie15713
Gluteraldehyd (2,5 % wässrig)Elektronenmikroskopie16220
Natriumcacodylat (0,05 M)Elektronenmikroskopie12300
Osmiumtetroxid (0,1 % wässrig)Elektronenmikroskopie Sciences19150
Ethanol (absolut)SigmaE7023
Kolloidale SilberfarbeElektronenmikroskopie Sciences12630
REM-ProbenstummelElektronenmikroskopieSciences 75220
DeckgläserThermo Fisher08-774-383
IL-8 Sekretionsbewertung
Quantikine IL-8 ELISA KitR& D SystemsD8000C

Referenzen

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Schlagwörter

RasterelektronenmikroskopieWirts Pathogen SchnittstelleVisualisierung von Piligastrische EpithelzellenEisenrestriktionFeldemissionskanoneKritischer Trockner

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