Den Hühnerembryo während der Entwicklung zu betrachten und darauf zuzugreifen, kann eine Herausforderung sein. Wir haben eine Ex-Ovo-Methode entwickelt, die einfach und kostengünstig ist und problemlos in einem Klassenzimmer oder in der Forschung eingesetzt werden kann. Diese Methode ermöglicht den Zugang zum Embryo bis in die späten Stadien der Embryonalentwicklung (HH 40).
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Methodenartikel
Optimierte Ex-ovo Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Forschung in Anatomie, Embryologie und Entwicklungsbiologie hat sich weitgehend auf die Verwendung von Modellorganismen verlassen. Um die Entwicklung an lebenden Embryonen zu untersuchen, werden häufig Modellorganismen wie das Huhn verwendet. Das Huhn ist aufgrund seiner geringen Kosten und seines minimalen Wartungsaufwands ein ausgezeichneter Modellorganismus, stellt jedoch eine Herausforderung für die Beobachtung dar, da es in einer undurchsichtigen Eierschale eingeschlossen ist. Um den Embryo während seiner Entwicklung richtig sehen zu können, muss die Schale mit einem Fenster versehen oder entfernt werden. Sowohl Fenster- als auch Ex-Ovo-Techniken wurden entwickelt, um Forscher bei der Erforschung der Embryonalentwicklung zu unterstützen. Jede der Methoden hat jedoch Grenzen und Herausforderungen. Hier stellen wir eine einfache, optimierte Ex-Ovo-Kulturtechnik für Hühnerembryonen vor, die es ermöglicht, die Embryonalentwicklung vom Stadium HH 19 bis in die späten Entwicklungsstadien (HH 40) zu beobachten, wenn sich viele Organe entwickelt haben. Diese Technik ist sowohl in Bachelor-Kursen als auch in fortgeschritteneren Forschungslabors, in denen Embryonenmanipulationen durchgeführt werden, leicht anzuwenden.
Einleitung
Die Ex-Ovo-Kultivierung hat eine wichtige Rolle bei der Erforschung der Entwicklung des Huhnsgespielt 1, 2. Diese Kultivierungsmethode wurde zur Untersuchung neurologischer Erkrankungen, der Entwicklung der Gliedmaßen, der kraniofazialen Entwicklung und als Modell zur Untersuchung von Fehlbildungen im Zusammenhang mit Diabetes verwendet 3, 4, 5.
Es gibt viele Variationen der Ex-Ovo-Technik. Der gebräuchlichste Ansatz ist die Verwendung eines Styroporbechers6,7,8 oder einer Glasschale5. Bei diesen Methoden wird der Becher oder die Schale mit Plastikfolie ausgekleidet, um den Embryo zu wiegen, ein Deckel wird auf den Becher gelegt und der Embryo wird dann in einen Inkubator mit entsprechender Luftfeuchtigkeitgelegt 6. Diese Einrichtung kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen. Die erste Herausforderung ist die Plastikfolie, mit der der Embryo gewiegt wird. Dieses Tuch ist schwer zu verarbeiten und haftet oft nicht sehr gut auf dem Körbchen. Um dieses Problem zu lösen, wird ein Gummiband um den Becher gelegt, um das Tuch an Ort und Stelle zu halten. Trotzdem kann das Tuch verrutschen, was für den Embryo tödlich ist. Die Plastikfolie kann reißen oder von Pinzetten oder Nadeln durchstochen werden, die bei Manipulationen und Beobachtungen von Embryonen verwendet werden können. Schließlich ist dieses Setup nicht sehr stabil und die Schüler können die Becher leicht umwerfen. Die Höhe der Körbchen macht es auch sehr schwierig, den Embryo unter ein Stereomikroskop zu setzen, das ein begrenztes Ziel für die Stadienhöhe hat. Diese Herausforderungen erschweren es für Studenten im Grundstudium, mit lebenden Kükenembryonen in Lehrlaboren zu arbeiten, wie z. B. in fortgeschrittenen Kursen zur Entwicklungsbiologie.
Die oben genannten Herausforderungen in der Ex-Ovo-Methode haben dazu geführt, dass Forscher sich der Fenstermethode 9,10 zuwenden, um die Entwicklung embryonaler Küken zu betrachten. Bei dieser Technik wird ein Loch oder "Fenster" in die Eierschale über dem Embryo gebohrt. Das Loch kann mit Klebeband oder Wachs9 wieder verschlossen werden, um die weitere Embryonalentwicklung zu ermöglichen. Obwohl die Windowing-Methode einige Vorteile hat, wie z. B. die Möglichkeit, die Embryonalentwicklung zu verfolgen und die einfache Wartung, hat diese Methode auch einige Einschränkungen. Der erste ist, dass das Fenster ziemlich groß sein muss, um den gesamten Embryo zu sehen (insbesondere in späten Stadien). Zweitens sind große Fenster schwer abzudichten; Eine unsachgemäße Versiegelung führt zu Sterilitäts- und Überlebensproblemen. Die Verwendung von geschmolzenem Wachs als Versiegelung fügt dem Protokoll einen weiteren unbequemen und unordentlichen Schritt hinzu. Obwohl die Windowing-Methode ideal für Hühnerembryonen in jungen Stadien (HH 11 – HH 27) sein kann, ist es daher nicht einfach, den gesamten Embryo in späten Stadien zu betrachten.
Hier beschreiben wir eine verbesserte und einfache Ex-Ovo-Kultivierungstechnik 11, die die Notwendigkeit von High-Tech-Geräten vermeidet, unter einem Stereomikroskop leicht zu handhaben ist, dem Embryo genügend Unterstützung gibt, um mikroskopische Manipulationen durchzuführen, und es Forschern ermöglicht, das Wachstum des Embryos in seiner Gesamtheit bis weit in die späteren Entwicklungsstadien (bis HH 40-41) zu verfolgen. Mit diesen Fortschritten in der Ex-Ovo-Technik erhalten Individuen Zugang zu einem umfassenderen Verständnis der Embryonalentwicklung. Zum Beispiel ermöglicht das Wachstum in späteren Stadien dem Individuum, Entwicklungsprozesse zu beobachten, die erst zu diesem Zeitpunkt stattfinden, wie z. B. Verknöcherung, Federentwicklung und fortgeschrittene Entwicklung von Gliedmaßen und Augen. Der gesamte Embryo sowie die extraembryonalen Membranen und Gefäße sind deutlich sichtbar. Es können auch weitergehende Forschungen durchgeführt werden, wie z. B. embryonale Manipulationen (d. h. das Implantieren von mit Inhibitoren getränkten Kügelchen oder das Einfügen von Barrieren zwischen Gewebeschichten), und die Forscher sind dann in der Lage, die Auswirkungen der Manipulationen in späteren Stadien von Embryonen zu beobachten.
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Protokoll
Hinweis: Alle Lieferungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Speichern der Hühnerembryonen
- Inkubieren Hühnereier des Stammes Gallus gallus horizontal bei 37 ° C mit ca. 40% Luftfeuchtigkeit und schalten Eier einmal oder zweimal täglich. Drehen Eier ist wichtig, den Embryo aus auf die Eierschale haftet.
- Sie nicht, das Ei in den 24 Stunden vor der Einrichtung der Kultur, da sonst der Embryo ventral der Dottermasse entfernt werden und wird beim Öffnen der Eier in Schritt 3 Zusätzlich beschädigt schalten, halten Sie die Eier bei 4 o C Grad für nicht mehr als eine Woche vor der Inkubation auf "halt" Entwicklung, aber das ist nicht ideal.
2. Staging Hühnerembryonen
- Stufe die Hühnerembryonen mit dem Hamburger und Hamilton 12 Staging-Tabelle. Die ideale Bühne für die Einrichtung des Ex-ovo-Kultivierung ist HH Stadium 19-20 (ca. 3 Tagen Inkubation) because dies kurz nach der Kopf dreht sich mit 53 HPF.
Hinweis: HH Stadium 19-20 wird durch folgende morphologische Merkmale gekennzeichnet: Somiten in die Mehrheit der Schwanz verlängert, aber die ganz am Ende der Schwanz bleibt unsegmentierten die Schwanzknospe gewellt ist, ist die Allantois klein und hat Gefäßsystem beschränkt, die Beinknospen sind größer als die Flügelknospen und die Augen sind nicht pigmentierten oder haben eine gräuliche Farbe.
3. Entfernen der Embryo von der Shell
- Vor dem Entfernen der Embryo aus der Schale, sprühen die Shell mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. Das Ei Schalten Sie nicht schnell, da dies den Embryo schädigen.
- Darauf achten, daß die Ausrichtung des Eier verändern, vorsichtig knacken das Ei an der Unterseite (dh der Seite, die während der Inkubation ventralen war) und lassen den Embryo in eine sterile wiegen Boot (88 x 88 x 23 mm). Wischen Sie wiegen Boote mit 70% Ethanol. Untersuchen Sie den Embryo, um sicherzustellen, dass der Dottersack nicht beschädigt wird. Wenn das Eigelb hgebrochen, entsorgen Sie den Embryo, da es nicht überlebt.
- Beachten Sie die Embryos zu gewährleisten, dass es machbar ist; das Herz schlägt, erscheint Gefäßsystem normal und keine offensichtlichen Anomalien vorhanden sind. Sicherzustellen, dass die Ränder des Wägeschiffchen trocken sind.
- Mit einer Pipette fallen 40 ul Penicillin / Streptomycin (5.000 Einheiten Penicillin, 5 mg Streptomycin pro ml) auf der Oberseite des Albumin zur Verhinderung einer Infektion.
4. Vorbereiten der Feuchtekammer
- Eine kleine Stapel von Kim-Wipes und / oder ein absorbierendes Kissen aus Baumwolle in den Boden einer sterilen Kunststoffbehälter (12 x 12 x 6 cm) abgewischt und mit 70% Ethanol.
- In sterilem destilliertem Wasser, um die kim-Wischtücher und / oder Baumwolle (ca. 150 ml Wasser) befeuchten.
5. Montage der Ex Ovo Kultur
- Legen Sie die wiegen Boot, das die Embryos auf der Oberseite des feuchten Polsterung. Dann Ort Hälfte eines quadratischen sterile Petrischale (9.5 x 9.5 cm) oben auf ter Boot wiegen, um eine lose Deckel zu bilden.
- Decken Sie die Kunststoffbehälter mit Deckel. Drücken Sie zwei Ecken des Deckels, eine Teildichtung, die noch ermöglicht eine gute Luftzirkulation in der Kammer gewährleistet.
- Legen Sie das Setup in das 37 ° C-Inkubator, bis die gewünschte Stufe.
- Platzieren Behälter Wasser in den Inkubator zur Kontrolle der Feuchtigkeit, wenn ein kontrollierter Luftfeuchtigkeit Inkubator nicht verfügbar ist. Sterilisieren Sie das gesamte Wasser in den Feuchtekammern und in den Inkubator und füllt als während der Inkubationszeit benötigt. 40% Luftfeuchtigkeit ist ideal.
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Ergebnisse
Diese ex ovo Verfahren erlaubt die Beobachtung von Embryonen aus einem frühen Entwicklungsstadium (HH 19/20) zum fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung (HH 40-41) (1A und 1B). Einrichten der Kultur bei HH 19-20 erhöht die Überlebensfähigkeit der Embryonen in der Kultur. Vor dem Drehen des Kopfes (vor 53 HPF) Überlebensfähigkeit in Kultur und nach der Stufe 21 sehr niedrig ist, neigt der Embryo mehr an die Shell auf Entfernung bleiben so weniger intakte Embryonen gewonnen wer...
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Diskussion
Ex Ovo Kultivierung und Fenster beide haben Vorteile und Herausforderungen. Hier vergleichen wir die Vorteile und Herausforderungen der Styroporbecher ex ovo-Methode und der Fenster Methode, um unsere verbesserte ex ovo Methode angezeigt. Unsere Methode ermöglicht Manipulation und einfache Beobachtung des Hühnerembryos in späten Entwicklungsstadien und unsere Verbesserungen der traditionellen ex ovo Verfahren 1, 2, 3 machen es zudem sehr einfach, in grundständigen Lehre Lab...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen in Bezug auf die in diesem Manuskript bereitgestellten Informationen.
Danksagungen
Wir möchten Paul Poirier, der Medienproduzent, am Mount St. Vincent Universität für seine Arbeit in Filmen und Bearbeiten der Videoteil des Manuskripts danken. Wir sind uns der Naturwissenschaft und Technik Research Council of Canada für die Finanzierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Machen Sie kleine Aliquots, um Einfrier-/Auftauereignisse |
| zu vermeiden Quadratische Petrischale | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Wiegen | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock-Behälter | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
