Methodenartikel

Verwendung von Stopped-Flow-Fluoreszenz und markierte Nukleotide ATP, um die Umsatz-Zyklus von Kinesine Analysieren

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DOI:

10.3791/52142

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17. Oktober 2014

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Nottingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert.

Zusammenfassung

Die Kinesin-Superfamilie der Mikrotubuli-assoziierten Motorproteine ​​teilen einen charakteristischen Motordomäne, die sowohl hydrolysiert ATP und bindet Mikrotubuli. Kinesinen anzuzeigen Unterschiede innerhalb der Superfamilie sowohl in Umsatz und ATP in Mikrotubuli-Interaktion. Diese Unterschiede anpassen spezifischen Kinesinen, um verschiedene Funktionen wie Luftfrachtbeförderung, Mikrotubuli-Gleiten, Mikrotubuli-Depolymerisation und Stabilisierung von Mikrotubuli. Um den Mechanismus der Wirkung eines Kinesin verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie der chemischen Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Zyklus der Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Um den ATP Umsatz-Zyklus zu sezieren, ist ein Ansatz, um fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu nutzen, um einzelne Schritte des Zyklus zu visualisieren. Bestimmung der Kinetik der Übergang jedes Nukleotid in der ATP-Umsatz Zyklus ermöglicht die geschwindigkeitsbestimmende Schritt oder Schritte zur vollständigen Zyklus zu identifizieren. Für Kinesin, ist es wichtig, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt zu kennen,die Abwesenheit von Mikrotubuli, da dieser Schritt im allgemeinen beschleunigt mehrere Tausendfache, wenn das Kinesin Wechselwirkung mit Mikrotubuli. Der Zyklus in Abwesenheit von Mikrotubuli wird dann zu der in Gegenwart von Mikrotubuli zu einer Kinesin ATP Umsatz Zyklus verstehen verglichen. Die Kinetik der einzelnen Nucleotid-Übergänge sind in der Regel zu hoch, um durch manuelles Mischen von Reaktanten, insbesondere in Anwesenheit von Mikrotubuli zu beobachten. Eine schnelle Mischvorrichtung, wie einer Stopped-Flow-Fluorimeter, die Kinetik auf Zeitskalen von nur wenigen Millisekunden beobachtet werden kann, kann verwendet werden, um solche Übergänge zu beobachten. Hier beschreiben wir Protokolle, in denen eine schnelle Vermischung der Reagenzien durch stopped-flow in Verbindung mit Fluoreszenz-markierten Nukleotiden verwendet werden, um die ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin sezieren.

Einleitung

Die Kinesin-Superfamilie sind für Proteine, die durch eine stark konservierte Motordomäne 1. Die Kinesin Motordomäne in Wechselwirkung mit Mikrotubuli in einer Nukleotid-abhängige Weise. Mitglieder der Kinesin-Familie zeigen eine Reihe von Funktionen aus translozierenden Kinesinen, die Fracht in einem gerichteten Art und Weise entlang von Mikrotubuli zu tragen, nicht-Translokation Mikrotubuli-bindenden Ende Kinesinen, die die Dynamik der Mikrotubuli 2,3 regulieren.

Kinesinen verwenden Sie den Umsatz von adensosine-5'-Triphosphat (ATP), um ihre Interaktion mit dem Mikrotubuli-Zytoskelett 4-6 regulieren. Die Konformation des Kinesin-Motordomäne und somit seine Affinität für Mikrotubuli hängt von ihrer Nukleotid Zustand: ATP, ADP kann, ADP.Pi oder keine Nucleotid gebunden werden (Abbildung 1). Den molekularen Mechanismus eines Kinesin verstehen, ist ein Verständnis der Beziehung zwischen der ATP-Umsatz und die Mikrotubuli-Wechselwirkung erforderlich sind. DieDaher liegt ein Hauptziel in der Kinesin-Feld, um die funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Nukleotid Zustände und die Kinetik der Übergänge zwischen diesen beiden in der Gegenwart und Abwesenheit von Mikrotubuli zu charakterisieren.

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Abbildung 1. Die einfachste ATP Umsatz Zyklus für eine Kinesin besteht aus vier möglichen Zuständen: Nukleotid-freie (Φ), ATP-gebundenen ADP.P i -gebundenen und ADP-gebundenen Jeder der vier Übergänge von einem vorderen und charakterisiert. Rückwärtsgeschwindigkeitskonstante (k x und k x beziehungsweise).

Um zu verstehen, wie sich die chemische Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Kreislauf der Mikrotubuli-Interaktion gekoppelt, muss man die Stufe in der ATP-Umsatz Zyklus zu bestimmen, ist Ratenbegrenzung in der Abwesenheit von microtubModule und dann bestimmen, wie der Zyklus wird durch die Anwesenheit von Mikrotubuli verändert. Die einfachste ATP Umsatz-Zyklus besteht aus vier einzelnen Chemikalien Schritten: (1) ATP-Bindung an die leere Stelle (Φ bezeichnet das leere Seite, dh, Nukleotid-freien Kinesin); (2) ATP-Spaltung; (3) phosphat Dissoziation und (4) ADP-Dissoziation (Abbildung 1). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt setzt die Geschwindigkeitskonstante für die komplette ATP Umsatz-Zyklus. Deshalb, um zu bestimmen, welche geschwindigkeitsbestimmende Schritt jedes der einzelnen Übergänge müssen gemessen und verglichen, um die Geschwindigkeitskonstante für den gesamten Zyklus ist. Methoden, um die Gesamt ATP Umsatz Taktrate konstant werden hier nicht beschrieben zu messen, kann aber in Bezug 7. hier gefunden werden, beschreiben wir Methoden, mit denen Geschwindigkeitskonstanten für einzelne chemische Schritte bestimmt werden kann. Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, um individuelle Übergänge in dem Umschlagszyklus eines Nukleotids hydrolysierende Protein zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden nehmen Advantage der Eigenschaften der Nucleotide mit dem Fluorophor markierten methylanthraniloyl, die üblicherweise als mant, die eine Änderung in der Fluoreszenzintensität nach der Bindung an Protein 8 Anzeige bezeichnet. Mant der Gruppe verwendet wird, da seine geringe Größe bedeutet, dass, wenn sie auf die Ribose (2A) gekoppelt ist, hat es im allgemeinen wenig oder keine Wirkung auf die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​oder Hydrolyse 9-12. Hier stellen wir Protokolle beschreiben die Verwendung von mant-markierten Nukleotiden in Verbindung mit der Stopped-Flow-Fluoreszenz, um die Beobachtung der Bindung und Dissoziation Nukleotidsequenz der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin ermöglichen.

Protokoll

1. Bestimmung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von Mant-markierten Nucleotide.

  1. 1 uM mant-markierte Nukleotid zu 1 uM Kinesin (Endkonzentrationen) in einem geeigneten Reaktionspuffer. Typischerweise ein Puffer, der Mikrotubuli-Wachstum und Stabilität profitiert verwendet wird (siehe Diskussion). Eine häufig verwendete Puffer 80 mM Piperazin-bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) enthält pH6.9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM Ethylenglykol-bis-2-Aminoether-tetraessigsäure (EGTA).
    Anmerkung: Die Konzentration von Kinesin in alle Protokolle angegeben, bezieht sich auf die Konzentration der Nukleotid-Bindungsstellen (dh Motordomänen). Verschiedenen Kinesine existieren als Monomere, Dimere oder Tetramere und so können mehr als ein Nukleotid-Bindungsstelle pro Molekül enthalten.
  2. Nach einer Inkubationszeit (1-3 min) und mit einem Standard-Fluorimeter, messen Sie den Emissionsspektrum für die mant-markiertes Nukleotid-Kinesin-Komplex. Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 365 nm undMaßnahme emittierte Licht von 400 bis 500 nm in 1 nm-Schritten.
  3. Einen Lösung von 1 mM mant-markierte Nukleotid in der in Schritt 1.1 verwendet gleichen Reaktionspuffer.
  4. Messung des Emissionsspektrums für die mant Nukleotid nur Probe, wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 1.2).
  5. Normalisierung der Spektren des Signals bei der Wellenlänge der Spitzenfluoreszenzintensität des Spektrums mant Nucleotid in Lösung (dh ohne Kinesin) von durch Dividieren dieses Wertes.
  6. Zeichnen Sie die normierten Spektren (zB 2B), um Fluoreszenzintensität Unterschiede zwischen dem mantATP gebundenen und / oder mantADP gebundenen Kinesin und mant Nukleotid in Lösung beobachten.

2. Messung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantATP

  1. Zu einer Lösung von bis zu 20 uM Kinesin (siehe Diskussion) in jeder geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), fügen Sie 1mM (Endkonzentration) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM (Endkonzentration) Dithiothreitol (DTT). Hinweis: Die Zugabe von Tween 20 in den Puffer wird empfohlen, da es reduziert / verhindert den Verlust von Kinesin-Protein auf der für Pufferaustausch verwendete Säule (Schritte 2.3 und 3.3)
  2. Inkubieren der Lösung bei 25 ° C für 15 min.
  3. Separate kostenlos Nukleotid-und EDTA aus der Kinesin mit einem Schwerkraft G-25 Sephadex Gelfiltrationssäule nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Liste der Materialien).
    1. Äquilibrieren die Säule mit mindestens 3 Säulenvolumina eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (siehe Schritt 2.1). Laden Sie das Kinesin-haltigen Lösung auf die Säule. Vorbereiten einer Sammelröhrchen durch Zugabe eines geeigneten Volumens von 100 mM Magnesiumchlorid-Lösung zu der leeren Hülse, so dass die endgültige Konzentration von Magnesiumchlorid von 1 mm nach dem Sammeln der Kinesin-Lösung. Sofortige Zugabe von Magnesiumchlorid hilft StAbILISE Die Nukleotid-freien Kinesin.
    2. Eluieren die Kinesin unter Verwendung eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer. Kinesinen instabil sind, wenn sie frei von Nukleotid-so ist es wichtig, schnell zu arbeiten. Bewahren Sie die Nukleotid-freien Kinesin auf Eis und innerhalb von 1-2 Stunden.
  4. Während oder vor der Herstellung von Nukleotid-freien Kinesin, bereiten eine mantATP Konzentrationsreihe in der gleichen Reaktionspuffer als die endgültige Lösung von Nukleotid-freien Kinesin. Bestimmen Sie den Bereich von Konzentrationen der mantATP nach den vorliegenden Konzentration von Kinesin mit einer typischen Serie im Bereich von 0,1 bis 50 um (siehe Schritt 2.5 und Diskussion) erforderlich.
  5. Bereiten Sie eine Konzentrationsreihe von Nukleotid-freien Kinesin. Für jede Konzentration der mantATP (Schritt 2.4), sollte eine Konzentration von Nukleotid freien Kinesin hergestellt, daß die mant-markierte Nukleotid in 5 bis 10-fachen molaren Überschuß über Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen bestehen.
  6. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-flow Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei> 400 nm mit einem Langpassfilter.
  7. Beginnend mit der niedrigsten Konzentration von mantATP, mischen mantATP mit einer geeigneten Konzentration von Nukleotid freien Kinesin in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (3A und 3B Inset). Anmerkung: Die Reaktanten werden 50% beim Mischen verdünnt. Notieren Sie sich die Nukleotid-Konzentration sowohl vor und nach Durchmischung (dh, 3,0 / 1,5 uM), um Verwechslungen zu vermeiden.
  8. Passen die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei jeder Konzentration von mantATP einer Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung gemessen, um Photobleaching der mant-Gruppe ausmachen (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m. t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 3B und Diskussion). Aus diesen Anfällen bestimmen einKonstante (k obs) bei jeder Konzentration von mantATP. Jeder k obs ist eine Faltung der Vereinigung und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1 und K -1).
  9. Entfalten, die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten durch Auftragen k obs gegen mantATP Konzentration (zB 3C). Passen diese Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1), um die Steigung und die y-Achsenabschnitt zu erhalten. Die Steigung stellt die Geschwindigkeitskonstante für mantATP Verein (Abbildung 1, k 1) mit den Einheiten M -1 s -1. Der Schnitt stellt die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion). Hinweis: Diese Vorgehensweise kann auch angewendet werden, um die ADP Assoziation und Dissoziation bestimmenGeschwindigkeitskonstanten (1, k und k -4 4) unter Verwendung mantADP als Nukleotid.

3. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP

  1. Zu einer Lösung von 2 uM Kinesin in einem geeigneten Reaktionspuffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20) werden 50 uM mantADP (Endkonzentration).
  2. Inkubieren bei 25 ° C für 30 min.
  3. Entfernen Sie überschüssiges mantADP und andere freie Nukleotid durch Puffer Austausch des Kinesin in der gewählten Reaktionspuffer mit einem G-25-Sephadex-Säule (siehe Liste der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Kinesin-Motordomäne sollte nun mit mantADP geladen werden.
  4. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-Flow-Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei> 400 nm mit einem Langpassfilter.
  5. Mischen Sie die mantADP.kinesin Komplex (~ 1 uM) mit einem 50-fach oder mehr Molar Überschuss an unmarkiertem ATP in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (4A und 4B Inset).
  6. Passen die Abnahme der auf eine einzelne Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe entfallen über die Zeit beobachtet Fluoreszenzintensität (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m.t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 4B und Diskussion). Die k obs von dieser Passform bestimmt die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von ADP (Abbildung 1, K 4) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion).

Ergebnisse

Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität des mant Gruppe wird typischerweise bei Bindung mant-markierten Nukleotids zu einer Kinesin beobachtet. Jedoch ist das Ausmaß einer solchen Signaländerung abhängig von der jeweiligen Kinesin in Frage. Daher ist es sinnvoll, Gleichgewichtsmessungen durchzuführen, um sowohl das Vorhandensein und das Ausmaß einer Änderung der Fluoreszenzintensität vor voran kinetische Assays bestätigen. Repräsentative Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP, sowohl in Lösung als auch im Komplex mit der Kinesin-13, MCAK, sind in 2B gezeigt. Diese Daten unterstreichen die Fluoreszenzintensität Anstieg sowohl mantATP und mantADP bei der Bindung an MCAK angezeigt. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von mant Nukleotid zu einem Kinesin wird verwendet, um über die Assoziation und Dissoziation von ATP und ADP-Bericht (Abschnitte 2 und 3). Im Fall von MCAK wird ein Fluoreszenzintensitätsdifferenz zwischen mantATP.kinesin und mantADP.kinesin beobachtet

3A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mit mantATP Nukleotid-freien Kinesin auftritt. Repräsentative Daten, die die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, die bei der Bindung an die mantATP Kinesin-13 auftritt, wird MCAK in 3B gezeigt. Daten des Typs in 3B gezeigt wird in einem Bereich von Konzentrationen mantATP gesammelt. Ein Plot der Geschwindigkeitskonstanten (k obs) ermittelt gegen die mantATP Konzentration ist in 3C gezeigt. Montage dieser Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1) können Dekonvolution der Geschwindigkeitskonstanten, die obs (Schritt 2.8) k beitragen. Deshalb, so dass die Bestimmung sowohl des Vereins und der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantATP (Abbildung 1, K 1 und K -1 beziehungsweise).

4A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mantADP.kinesin mit einem Überschuß von unmarkiertem ATP stattfindet. Die Daten in Abbildung 4B zeigt die für mantADP bei der Dissoziation von Kinesin-13, MCAK beobachtete Abnahme der Fluoreszenzintensität. Durch den Einbau dieser Daten an einer e-Funktion (Schritt 3.6) die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von mantADP direkt bestimmt wird.

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Abbildung 2. Die Nukleotide mit dem Fluorophor methylanthraniloyl (mant) markiert werden verwendet, um einzelne Schritte in der ATP-Umsatz-Zyklus zu isolieren. (A) Struktur des mantATP, die die Position des Fluorophors mant entweder die 2 'oder 3' Position der Ribose gebunden ist. (B) Normalisierte Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP in Lösung (MaxP) und eine mantATPd mantADP im Komplex mit dem Kinesin MCAK (MATP + MCAK und MADP + MCAK). Die mantATP Spektren normiert auf die Fluoreszenz bei max für mantATP in Lösung und der mantADP Spektren normiert auf max für mantADP in Lösung Fluoreszenz. Die Spektren der mant Nukleotide mit MCAK vermischt werden zu 1 min nach dem Mischen gesammelt. Die Konzentration von Reagenzien und Fluorimeter Einstellungen werden als in Protokoll beschriebenen Schritte 1.1 und 1.2.

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Abbildung 3. Die Messung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante von mantATP. (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: mantATP (MATP) bindet an Nukleotid-freien Kinesin. Die Fluoreszenzintensität bei der Bindung an das Protein die mant-Gruppe steigt. (B) Fluoreszenzsignaländerung (schwarz) beim Mischen mantATP (25 M) mit MCAK (5 M nu beobachtettid-frei,). Diese Daten sind fit (rot gestrichelt) auf eine einzige Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung, die für die Photobleaching der mant Fluorophor-Konten (siehe Diskussion). Einschub: Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf der Stopped-Flow-Fluorimeter. (C) Geschwindigkeitskonstanten (k obs) für die Reaktion von mantATP mit Nukleotid-freien MCAK bestimmt aufgetragen gegen die Konzentration von mantATP. Dieses Grundstück wird eine lineare Region mit der Gradient der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1) mit Einheiten der M -1 s -1 und die y-Achse als die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) haben Einheiten von s -1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


. Abbildung 4. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: Kinesin mit mantADP vorgespannt ist in einen Überschuss von unmarkiertem ATP verdünnt. Distanziert mantADP durch unmarkierte ATP ersetzt, wodurch die Rückreaktion von mantADP Verein (siehe Diskussion) zu verhindern. Die Intensität der Fluoreszenz des mant-Gruppe nimmt bei der Dissoziation aus dem Protein. Nach der Dissoziation von mantADP vom Kinesin MCAK beobachtet (B) Fluoreszenzabnahme. Das Fluoreszenzsignal (schwarz) ist fit (rot gestrichelt) zu einem einzigen exponentiellen zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe (siehe Diskussion) zu berücksichtigen. Die Geschwindigkeitskonstante bestimmt ist, die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation mantADP (1, k4). Einschub:. Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf einem Stopped-Flow-Fluorimeter Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Hier stellen wir Protokolle zur Beobachtung und Analyse der Kinetik der Übergänge zwischen den Zuständen für eine Nukleotid-Kinesin. Diese Protokolle nutzen die schnelle Vermischung Stopped-Flow-Methode in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Verfahren dieser Art haben ausgiebig genutzt worden Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation für eine Vielzahl von Kinesinen 9-11,13-16 zu studieren. Die beschriebenen Beobachtung der Phosphatfreisetzung (Abbildung 1, Schritt 3) nicht erlauben Methoden. Jedoch kann Stopped-Flow-Fluoreszenz verwendet wird, um diesen Übergang unter Verwendung eines Phosphat Sensorprotein zu koppeln, die Produktion von Phosphat zu einem Fluoreszenzintensitätsänderung 17 zu beobachten. Die Methoden vorgestellt Verwendung Nukleotide mit kleinen Fluorophor methylanthraniloyl (mant) gekennzeichnet, die in der Regel zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, wenn an Proteine ​​gebunden. Weiterhin mant Fluorophor konjugiert, wenn entweder die 2 'oder 3'-Position an der Ribose, hat oft eine geringe oder keine Wirkung auf die Bindung, Dissoziation oder Hydrolyse des Nukleotids 9-12. Mant-markierte Nukleotide sind leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich (siehe Liste der Materialien) und Mischungen der 2 'und 3'-Konjugat, wie sie schnell wieder ins Gleichgewicht, wenn auf ein einziges Isomer 8 gereinigt ist. Mant-markierte Nukleotide sind ausgezeichnete Reportermolekülen, durch die die Kinetiken der Nukleotid-Bindung und Dissoziation beobachtet werden.

Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bedeutet, dass das Auslesen der beschriebenen Tests ist eine Echtzeit-Veränderung der Fluoreszenzintensität. Dies macht diese ideal für Assays Stopped-Flow-Fluoreszenz, die schnelle Vermischung der Reagenzien und Echtzeit-Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenz mit der anschließenden Reaktion verbunden werden können. Die Kombination der Stopped-Flow als Mischtechnik und Fluoreszenz als Verfahren zur Detektion erzeugt ein System, das relativ Probe efreichend. Um beispielsweise die in Figur 3C gezeigten Daten erwerben erfordert 0,8 bis 1,0 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK, und die in 4B gezeigten Daten erwerben erfordert ~ 0,3 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK. Ein Nachteil der Verwendung von mant als Fluorophor ist, dass sie anfällig für Photobleichung ist. Dies kann getrennt von Kinesin Reaktionskinetik durch Mischen einer Lösung von mant-markierte Nukleotid mit Reaktionspuffer, in Abwesenheit von Kinesin in der Stopped-Flow zu beobachten. Eine langsame Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wie die mant-Gruppe wird gebleicht. Über den Bereich der Zeitskalen in den beschriebenen Photobleaching der mant-Gruppe Protokolle verwendet wird, auch durch eine lineare Funktion beschrieben. Daher ist ein einfacher Weg, um Daten für Photobleaching zu korrigieren, um zu einer exponentiellen Funktion mit einer durch eine lineare Funktion (dh mt + c) eher als die gemeinsame Grundlinie flach, durch einen einzigen Parameter beschrieben beschriebenen Grundlinie passen.

mantATP verbindlich

Bei der Messung von Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation und Dissoziation mantATP (Abschnitt 2) die ADP, die mit der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstelle in der Abwesenheit von Mikrotubuli verbunden bleibt, müssen entfernt werden. Dies ermöglicht mantATP Assoziation und Dissoziation (Abbildung 1, Schritt 1) isoliert von ADP Dissoziation beobachtet werden. Um dies zu erreichen Kinesin mit mindestens einer 50-fachen Überschuß an EDTA mehr Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.1) inkubiert. Die EDTA-Mg 2 +-Ionen maskiert verursacht Mg 2 + aus der Nukleotid-Bindungstasche, die bei der Freisetzung von dem Nukleotid 11 Ergebnisse distanzieren. Deshalb, wenn die Durchführung Schritte 2,1-2,3, ist es wichtig, einen Puffer frei von Mg 2 + zu verwenden. Das Nukleotid-kostenlos-Kinesin-Protein-Puffer ausgetauscht, um sich sowohl aus freien Nukleotid und von EDTA zu trennen. Um diese Trennung, eine Wegwerfgravitationsströmungs ge volll Filtrationssäule ist ausreichend und ist einfach und schnell zu bedienen (siehe Liste der Materialien). Das Zusammenspiel von mantATP mit Nukleotid kostenlos Kinesin wird bei einer Reihe von mantATP Konzentrationen (Schritt 2.4) durchgeführt, um Entfaltung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten (Schritt 2.8) zu ermöglichen. Die Theorie hinter Experimente dieser Art ist auch in Bezug 18 beschrieben Bei der Durchführung dieser Experimente mit der niedrigsten Konzentration von mantATP beginnt. Dies beseitigt die Notwendigkeit für die Waschschritte zwischen verschiedenen Konzentrationen. Wird es wahrscheinlich notwendig sein, die Empfindlichkeit der Stopped-Flow-Fluorimeter einzustellen als die mantATP Konzentration erhöht wird. Die mantATP Konzentration muss immer mindestens 5-fachen Überschuß über die Konzentration der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen auf Pseudo Bedingungen erster Ordnung aufrecht zu erhalten. Da jedoch die Konzentration von mantATP erhöht wird, die Signaländerung kann als Anteil der Nucleotidsequenz, die abnimmt Kinesin bindet überschwemmt zu werden. Therefore wird die Konzentration des Kinesin auch für jedes neue Konzentration mantATP erhöht, so dass die Konzentration des mantATP ist niemals mehr als 10-fachen molaren Überschuß über Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.6).

mantADP Dissoziation

Obwohl Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantADP kann durch das gleiche für mantATP (Abschnitt 2) beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Dissoziation von ADP aus einem Kinesin kann direkt durch Vorspannen der Nukleotid-Bindungsstelle mit mantADP (Schritte 3.1-3.3) Die mantADP.kinesin Komplex wird dann mit einem Überschuss von unmarkiertem ATP (Schritt 3.5) gemischt beobachtet werden. Der Überschuss unmarkierten ATP verhindert erneute Bindung von mantADP auf die Kinesin und ermöglicht die Spaltungsreaktion (Abbildung 1, K 4) isoliert von Verband der mantADP beobachtet werden, wodurch. In diesem Assay wird die Konzentration von unmarkiertem ATP mindestens einem 50-fachen molaren Überschuß von Nuk seinleotide Bindungsstellen. Die Theorie hinter diesem Test ist gut in Bezug 18 beschrieben Diese direkte Methode gibt einen genaueren Wert für die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante als die Hochrechnung auf das in Schritt 2.8 beschrieben y-Achse.

Einbeziehung der Mikrotubuli

Die beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation in Gegenwart von Mikrotubuli zu bestimmen. Mikrotubuli sind an das Nukleotid enthaltenden Spritze vor dem Mischen in der Stopped-Flow eingeführt: die untere Spritze in 3B und 4B (Einlagen). In dieser Konfiguration wird die Kinesin die Nukleotidsequenz gleichzeitig erfüllen, da sie die Mikrotubuli erfüllt. Mikrotubuli stabilisiert werden verwendet, wo die Lebensdauer des Tubulin-Polymer durch die Verwendung entweder einer chemischen Stabilisierung, verlängert, wie Taxol oder einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, wie Guanosin-5 '- [(α, β) -methyleno] Triphosphat (GMPCPP, siehe Liste der Materialien). Es ist möglich, zwei Zyklen der Tubulin-Polymerisation mit GMPCPP verwenden, um Mikrotubuli, für viele Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden 9,19 tätigen. Die Verwendung von vorgefertigten Mikrotubuli reduziert deutlich die praktischen Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Tests. Mikrotubuli in den Assays schließen, ist es wichtig, einen Reaktionspuffer für die Mikrotubuli Stabilität zu verwenden. Der Puffer der Wahl ist PIPES basiert, mit dem am häufigsten verwendeten Puffer, der 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM EGTA (als BRB80 bekannt) 20,21.

Die beschriebenen Verfahren sind nicht darauf beschränkt, mit Kinesin, sondern kann angepasst und einem Nukleotid-Bindungsprotein verwendet werden. Zum Beispiel wurden ähnliche Verfahren wie die ATP Umsatz Zyklus von Mitgliedern der Familie von Myosin molekularen Motoren 12,22 und die Verwendung von markierten mant Guanosinnukleotiden erstreckt sich weiter angewendetVerfahren dieser Art GTP hydrolysierende Proteine ​​23,24.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wird von der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC), der Royal Society und der Universität von Nottingham unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2'/3'-(N-Methylanthraniloyl)adenosin-5' Triphosphat Jena Biosciences# NU-202mantATP
2'/3'-(N-Methylanthraniloyl)-adenosin-5'-diphosphat Jena Biosciences# NU-201mantADP
Mg-ATPRoche# 10519979001Das Dinatriumsalz von ATP wird in einer Konzentration von 100  mM in 100  mM MgCl2. Die Konzentration sollte durch Resorption bei 260  nm (e = 15.400  M-1cm-1). Lösung, die in Aliquoten bei -20  gelagert wird oC.   
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Fisher ScientificBP120-5000,5  M Stammlösung in Wasser, pH 8,0. GEFAHR: Pulver schädlich beim Einatmen.
Dithiothreitol (DTT)MelfordMB10151  M Stammlösung in Wasser, frisch für den Gebrauch am selben Tag gemacht. GEFAHR: Pulver schädlich beim Einatmen oder bei Berührung mit der Haut.
NAP-5-SäuleGE Healthcare# 17-0853G-25 Sephadex-Harz-Schwerkraft-Gel-Filtrationssäule
GMPCPPJena Biosciences# NU-405nicht hydrolysierbares Analogon von GTP
Stopped-Flow-Fluorimeter Applied PhotophysicsSX20Ein Fluorimeter mit einigen angeschlossenen Rohrleitungen, das ein schnelles Mischen von Reagenzien in der Beobachtungsküvette ermöglicht. Dadurch wird die Kinetik von Reaktionen auf Zeitskalen von ~0,1 -  ermöglicht 100  Sekunden, die überwacht werden sollen.

Referenzen

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