Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Zusammenfassung

Die Nagetier-Thymektomie ist eine wertvolle Technik in der immunologischen Forschung. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die vollständige Thymektomie bei erwachsenen Ratten unter Verwendung einer Mini-Sternotomie in Verbindung mit nicht-invasiver Intubation und Überdruckbeatmung zur Minimierung der perioperativen Morbidität und Mortalität beschrieben.

Zusammenfassung

Thymektomie bei neugeborenen Nagern ist ein etabliertes und zuverlässiges Verfahren für immunologische Untersuchungen. Doch bei erwachsenen Ratten, Komplikationen von Blutungen und Pneumothorax von pleural Unterbrechung kann zu einer signifikanten Sterblichkeit führen. Dieses Protokoll ist ein einfaches Verfahren zur Ratte thymectomy, die einen Mini-Sternotomie Intubation verwendet. Intubation ist mit einer nicht-invasiv und leicht reproduzierbares Verfahren erfolgen und ermöglicht positive Druckventilation Pneumothorax zu verhindern und eine gesteuerte Luftwege, die ausreichende Zeit für eine sorgfältige Dissektion Thymus pleurale Minimierung von Störungen ermöglicht. Ein 1,5 cm Brustbeineinschnitt nimmt Kontakt mit mediastinale Gefäße und Rippenfell, während immer noch eine vollständige Visualisierung des Thymus. Nach der Belichtung des Mediastinums wird der Thymus stumpf unter Vergrößerung entfernt. Pleuraraum wird dann durch Nahtverschluss der vorge tracheale Muskeln, gefolgt von der Anwendung des chirurgischen Klebstoff abgedichtet. DieBrustkorb wird dann durch Nahtverschluss des Brustbeins, gefolgt von Nahtverschluss der Haut verschlossen. Alle thymectomies abgeschlossen waren, wie durch immunhistochemische (IHC) Färbung der mediastinalen Gewebe und Abwesenheit von naiven T-Zellen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie, und das Verfahren war eine 96% ige Überlebensrate. Diese Methode eignet sich, wenn Sie fertig Thymektomie mit minimalen Komplikationen für weitere immunologische Untersuchungen in athymischen erwachsenen Ratten gewünscht.

Einleitung

Seit den frühen 1960er Jahren hat sich die Thymusdrüse für seine entscheidende Rolle in der Entwicklung der zentralen immunologische Toleranz anerkannt. Nagetier thymectomy hat sich als ein wesentlicher Vorgang bei der Definition der Rolle von Thymus der Lymphozytendifferenzierung Selbsttoleranz und Immuntoleranz in der Einstellung der Allograft Transplantation und Tumormetastasen. Die Entfernung der Ratte Thymus ermöglicht Studien mit T-Zell-Depletion oder adoptiven Transfer von definierten T-Zellpopulationen, ohne das erneute Auftreten von einheimischen naiven T-Zellen.

Thymectomies bei neugeborenen Nagetieren können mit einem Saug-Technik mit zuverlässigen Ergebnissen ¹ durchgeführt werden. In erwachsenen Ratten wird diese Technik mit einer ungefähren 20% Todesrate und führt häufig zu einer unvollständigen thymectomy ^2. Um eine vollständige Thymektomie bei erwachsenen Ratten durchgängig zu erreichen, ist offen Belichtung des Mediastinum über eine mediane Sternotomie erforderlich. Doch diese6% ^{2- 4} - Verfahren ist mit Komplikationen, die Trachea Verletzungen, Blutungen und Pneumothorax, die zu einer Gesamtmortalität von 1,5 sind verbunden.

In den letzten zwei Jahrzehnten Verbesserungen thymectomy Techniken perioperativen Komplikationen vermindert und wurden Überlebensraten verbessert. Intubation so dass für Überdruckbeatmung hat Pneumothorax Raten ⁵ verringert. Methoden der Intubation zuvor aus offenen Exposition beschriebenen Bereich um die Luftröhre zu weniger invasiven Methoden mit direkter Stimmband Visualisierung. Komplikationen im Zusammenhang mit der Intubation Verfahren verbunden sind Luftröhrenverletzung, Stimmbandbruch, unbeabsichtigte Speiseröhre Intubation und Blutungen aus Herzpunktion oder Zerstörung von der oberen Hohlvene resultieren. Außerdem kann die Nähe der unteren thymic Keulen pleuralen Auskleidung Pneumothorax führen.

Hier beschreiben wir eine TechnikThymektomie durch eine minimal-invasive 2 cm Hautschnitt nach einer einfachen Methode der Intubation mit einem stumpfen Ende Angiokatheter und transkutane Luftröhrenbeleuchtung. Die thymectomy beinhaltet eine 1,5 cm Sternotomie und einen dreischichtigen Verschluß mit chirurgischen Leimauftrag auf das Mediastinum abzudichten und die Inzidenz von Blutungen und respiratorische Komplikationen zu minimieren. Dieses Verfahren zuverlässig entsteht lücken thymectomy wie durch das Verschwinden der CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T-Zellen naive folgenden thymectomy und Abwesenheit von Thymusgewebe auf IHC Färbung nachgewiesen. Operative Zeiten und peri-prozedurale Sterblichkeit sind auf ein Minimum reduziert.

Protokoll

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren, die die Verwendung von Ratten wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Duke University genehmigt wurde.

1. Vorbereitung der Intubation Kanüle

1. Schneiden Sie die Nadel Ende einer 2-Zoll-14 G angiocathether Nadel mit einer Zange.
2. Klemmen Sie das Lumen der Nadel geschlossen mit einer Spitzzange.
3. Schneiden Sie den Abschnitt eingeklemmt an den Rand des offenen Lumens Teil mit einer Zange, und dann schneiden Sie die Kanten auf beiden Seiten des verbleibenden Ende bei 30 - 45 ° Winkel zur Nadel Rand.
4. Legen Sie die unteren 3-4 mm der Kanüle in den offenen Bereich des Straight-Schiebe-Zange und nach oben ziehen, bis eine leichte Aufwärtskurve am Ende gebildet.
   Hinweis: das Lenken des Katheters in der Luftröhre (1) zu erleichtern.
5. Verwenden feinem Sandpapier, um am Ende der Kanüle glätten Sie die Kanten.
6. Bringen Sie den abgestumpften Instrument in die Angiokatheter Schläuche. Sicherzustellen, dass der Schlauch ist etwas kürzer als die stumpfe Nadel.

2. Pre-chirurgische Verfahren

1. Richten Sie die Website für die Prozedur, indem ein Operationsmikroskop zu 10-facher Vergrößerung über den Betriebsbereich eingestellt.
2. Legen Sie eine wärmende Unterlage auf den Arbeitsbereich und mit einem sauberen absorbierenden Pad.
3. Richten Sie eine Herzfrequenz und Blutsauerstoffsensors in das Operationsfeld.
4. Wiegen Sie die Ratte für gewichtsbasierte Dosierung von Medikamenten (zB postoperative Analgesie, Antibiotika oder Lymphozyten-abbauende Antikörper).
   HINWEIS: Typische erwachsenen Ratten wiegen zwischen 350 bis 450 g.
5. Sedate die Ratte mit verdampften 3% _Isofluran-O & sub2; (3 l / min) unter Verwendung einer Induktionskammer entlüftet, um einen Abfallanästhesiegas System Aktivkohle enthält. Lassen Sie 5 Minuten für die Narkoseeinleitung zu tiefe Narkose für Intubation erforderlich sind.
6. Verabreichen Carprofen oder Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutan in die Ratte vor der Anwendung mit Intubation und Operation fortfahren.
7. Verwenden elektrischen Haarschneider, um den Hals und Brust des narkotisierten Ratten vor der Intubation zu rasieren.

3. Intubation

1. Bereiten Sie die Intubation Setup durch Reiben einer kleinen Menge von Schmier (zB KY Gel) auf das Ende des Intubationskanüle. Drehen an dem Beatmungsgerät, um den Fluß von Isofluran Gas durch die Rohrverbinder beginnen.
2. Übertragen der Ratte zur Intubation Vorrichtung und die Ratte an der Metallleiste zu suspendieren mit seinem oberen Schneidezähne (2A).
   ANMERKUNG: Bestimmte Intubation Vorrichtungen können online erworben werden. Die hier gezeigte Modell ist mit einer Acrylplatte um Abschnitte einer 2 x 4 Zoll Lendenstück mit einer Butanbrenner Formhausgemacht, und Verstärkungen mit Chloroform befestigt. Die Bar (oder Metalldraht) wird durch Bohren von Löchern über Kreppband an der s an diesem befestigtide der Acryl zu Absplitterungen oder Risse zu verhindern.
3. Trans beleuchten Nacken der Ratte, indem eine flexible hochintensive Lichtquelle 1-2 cm von der Bauchseite des Halses (2B).
4. Verwenden Sie ein Paar Studenten Standardmuster einer Pinzette, um die Zunge leicht nach oben und an der Seite der unteren Zähne zu ziehen. Fassen Sie die Lasche zwischen Daumen und Zeigefinger einer Hand beim Aufsetzen der flachen Innenfläche der einen Seite der Zange gegen das untere Ende der Zunge. Press ventral den Kehldeckel und der Öffnung des Kehlkopfs (2C) zu belichten.
5. Visualisieren Sie die Stimmbänder und führen die umgedrehten, abgestumpft Ende des Intubationskanüle nach vorn durch die offene Stimmritze in die Luftröhre, bis die Nabe des Angiokatheter berührt die Schneidezähne.
6. Entfernen Sie die Metallführungsstab, und befestigen Sie den Schlauch mit dem Narkose Angiokatheter Öffnung zur Belüftung mit Isofluran beginnen.
   HINWEIS: Die typische Sauerstoff flow Rate an das Beatmungsgerät 3 L / min mit 3% Isofluran.
   1. Gesetzt den Ventilator mit einer Geschwindigkeit von 60 Atemzügen / min in einem Volumen gesteuert Beatmungsmodus, der einen Druck von ~ 12 erreicht - 14 mmHg. Verwenden Sie einen positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 3 cm H ₂ O.
7. Beobachten bilateralen Brustwand Expansion synchron mit dem Beatmungsgerät, um eine ordnungsgemäße Plazierung des Endotrachealtubus zu gewährleisten.
8. Bewerben Tierarzt empfohlenen Augensalbe die Augen der Ratte zur Trockene, während der Narkose zu verhindern.
9. Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen der Ratte zur Trockene, während der Narkose zu verhindern.
10. Sichern Sie den Tubus auf den Kopf der Ratte mit einem Streifen aus Gewebeband. Achten Sie darauf, eine feste Verbindung zwischen dem Endotrachealtubus und dem Narkose Zufluss Schläuche.
11. Befestigen Sie die Sauerstoffsättigung des Blutes und Herzfrequenz-Messgerät bis zu den Füßen der Ratte und beginnen Überwachung. Überprüfen Sie die Betäubung durch die Bestätigung erfolgt keine Reaktion aufE-Prise.

4. Thorakotomie und Thymektomie

1. Folgen Sie der üblichen aseptischen Technik für die Gesamtheit des Verfahrens.
   1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich und Operationstisch und desinfizieren mit einer 70% igen Ethanollösung.
   2. Verwenden Sie sterile Handschuhe während des Verfahrens, und Autoklaven alle Instrumente und Materialien während des Verfahrens verwendet.
   3. Bewerben Providon-Jod auf die gesamte Brustbereich und lassen Sie ihn trocknen. Danach die Oberfläche der Haut mit 70% Ethanol auf Gaze. Decken Sie die Ratte mit Klarsichtfolie ein Loch, um das sterile Operationsfeld freizulegen.
2. Identifizieren Sie die Jugulum im oberen Brustbereich. Machen Sie eine 2 cm Mittelschnitt durch die Haut ab 2-3 mm über dem Jugulum und sich distal Mittellinie entlang des Brustbeins mit stumpfen Shea Schere.
3. Führen Sie einen 1,5 cm Längssternotomie vom Jugulum wieder mit stumpfen Shea Schere. KEEP die Unterkante der Schere direkt unter dem Brustbein und Fortschritt langsam.
4. Legen Sie einen kleinen Alm Aufroller knapp unterhalb des Brustbeins getrennt und offen für die Pre-Luftröhrenhalsmuskulatur (M. sternohyoideus und M. sternothyroideus Muskeln) zu offenbaren. Trennen Sie die Pre-Luftröhrenhalsmuskulatur mit stumpfen Graefe Pinzette. HINWEIS: An diesem Punkt kann der Trachea zu sehen ist, und der Intubationstubus sollte innerhalb der Luftröhre sichtbar gemacht werden.
5. Legen Sie die Zinken des kleinen Alm Aufroller unter den getrennt Halsmuskulatur und Brustbein. Öffnen Sie die Rückziehvorrichtung, die überlegene Aspekt der Thymus aus.
6. Verwenden feinen Pinzette Dumont, um die Seitenränder des Thymusgewebe lösen und setzen die unteren Thymus Lappen.
7. Ziehen Sie den Thymus sanft souverän ins Freie Inzisionsstelle, kümmert sich um den Kontakt mit der oberen Hohlvene, subclavia und Halsgefäße zu vermeiden und zu einer Störung der empfindlichen Brustfellfutter zwischen dem Thymus und Lunge zu minimieren.
8. Da ter Thymus Gefäße präpariert und aufgedeckt, verwenden Mikro-Scheren, um sie zu teilen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Druck auf die Gefäße zur Blutstillung zu halten, wenn nötig.
9. Liefern Sie die unteren Lappen des Thymus in den Einschnitt und dann scharf lysieren die hinteren Anbaugeräte. Entfernen Sie die intakten Thymus und sorgfältig inspizieren entfernt Thymus nach fehlenden Abschnitte.
   HINWEIS: Kleine Brust-Lymphknoten rund um den Thymus sichtbar gemacht werden und sind oft nur schwer von Thymusgewebe unterscheiden. Diese werden diskrete runde Knoten mit einer ähnlichen Erscheinung Thymusgewebe, wird jedoch nicht in Kontinuität mit der Thymus sein.
10. Entfernen Sie die Alm Aufroller und schließen Sie die M. sternohyoideus und sternothyoid Muskeln mit zwei unterbrochen 5-0 Maxon Nähten.
11. 2 Tropfen von chirurgischer Qualität Cyanoacrylatkleber über die Nähte, die Mediastinum unter Überdruckbeatmung zu versiegeln.
    Hinweis: das wird die Häufigkeit von Pneumothorax und Hämatome zu verringern.
12. Schließen Sie die sternum mit zwei unterbrochen 4-0 Seidenfäden auf ein Schneide Nadel. Führen Sie die Nadel durch die Lücken zwischen den Rippen, kümmert sich um die Nadel direkt unter dem Brustbein zu führen, um die darunter liegende Muskelschicht zu vermeiden.
13. Schließen Sie die Hautschicht mit einer Lauf 4-0 Nylonnaht. Unterbrechen Sie die Isofluran an dieser Stelle auf die postoperative Anästhesie Erholungszeit zu verkürzen.
14. Reinigen Sie die Inzisionsstelle und der umgebenden Haut mit Kochsalzlösung angefeuchtet Gaze.
15. Mehrere Tropfen Bupivicain (0,25%) zur Lokalanästhesie, gefolgt von 1-2 Tropfen Sekundenkleber auf den Schnitt, um den Einschnitt zu versiegeln.
16. Weiter zu belüften, bis die Ratte Anzeichen von unabhängigen Atemanstrengung und fängt an, seine Gliedmaßen zu bewegen. Extubieren die Ratte und lassen Sie ihn unter Beobachtung in einem Käfig auf eine wärmende Unterlage platziert erholen.
17. Verwalten Buprenorphin (0,01 bis 0,05 mg / kg) subkutan in die Ratte unmittelbar nach der Operation, und wiederholen Sie alle 8-12 h 48 h post operativ (in der Regel 5 Gesamtdosen). Nach 24 und 48 Stunden nach der Operation, Administration Carprofen oder Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutan (3 Gesamtdosen einschließlich der präoperativen Dosis).
18. Weiter zu überwachen, bis die Ratte um den Käfig zu bewegen. Bei Anzeichen von Atemnot, führen Sie Re-Intubation und Wieder Erforschung der Brust.
    1. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten.
    2. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
19. Entfernen Sie die Hautschicht Nähte 1 Woche nach der Operation.

Ergebnisse

Dieses Verfahren wurde zur Erwachsenen Lewis-Ratten (n = 26) durchgeführt. Die mittlere Operationszeit betrug 15 ± 3 min. Es gab keine intraoperative Mortalität. Die mittlere Intubation Zeit - von Platzierung von Ratten auf der Intubation Gerät zur Gründung der Belüftung - betrug 45 ± 5 sec. 24 Ratten hatten eine vollständige Genesung von der Operation ohne Anzeichen von Atembeschwerden oder Blutungen durch postoperativen Tag (POD) 14. Eine Ratte entwickelten Atemnot auf POD 4 und unterzog Re-Operation, um das Mediastin...

Diskussion

Die vorliegende Protokoll für die komplette Thymektomie eine minimal-invasive Ansatz mit einem Drei-Schicht Einschnitt Verschluss mit chirurgischen Klebstoff Anwendung entwickelt, um Komplikationen zu minimieren. Die vollständige Entfernung des Thymus wurde durch den Verlust von naiven T-Zellen und durch IHC Färbung mediastinaler Lymphgewebe Zytokeratin demonstriert.

20% aufgrund von perioperativen Komplikationen, von denen die meisten der auf die enge Verbindung der unteren Lappen des Thymu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 Zoll 14 G Angiokatheter
Operationsmikroskop	Zeiss
Warmhaltekissen
Herzfrequenz- und Blutsauerstoffmessgerät für Nagetiere mit Fußsensoren	Harvard-Gerät	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rattenfußsensor)
Intubationsgerät (Kunststoff mit Metallstange oben)			Siehe Abbildung 2
Anästhesiesystem für Kleintiere mit Induktionsbox, Isoflurantank und O2Tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Kleintierbeatmungsgerät mit Schläuchen	CWE	12-02000 (Beatmungsgerät) und 12-04000 (externe Ventilbaugruppe für Mäuse/Ratten)
Hochintensiver faseroptischer Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Zange für Studenten mit Standardmuster	Fine Science Tools	91100-16
Feine gerade Schere	Fine Science Tools	14060-09
Shea-Schere mit stumpfer Spitze	Fine Science Tools	14105-12
Kleiner Alm-Retraktor (für Brustbein)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe Zange	Fine Science Tools	11050-10
Feine Dumont-Zange	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon-Nähte	Ethicon
4-0 Seidennähte (mit Schneidenadel)	Ethicon
6-0 Nylon-Nahtmaterial	Ethicon
Cyanacrylat-Kleber (Endermil)
Schmiergel	Akorn Animal Gesundheit	NDC 17478-162-35