Methodenartikel

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

DOI:

10.3791/52161

⸱

10. Dezember 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine neuartige halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für den Einsatz mit umweltbedingten Geflügelproduktionsproben wurde entwickelt und zeigte Verbesserungen gegenüber einer herkömmlichen mechanischen und enzymatischen Extraktionsmethode in Bezug auf die quantitativen und qualitativen Schätzungen der gesamten Bakteriengemeinschaften.

Zusammenfassung

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Die Wirksamkeit von DNA-Extraktionsprotokollen kann stark abhängig sowohl von der Art der Probe untersucht, und die Arten von Downstream-Analysen durchgeführt werden. In Anbetracht, dass der Einsatz neuer Bakteriengemeinschaft Analysetechniken (zB microbiomics, Metagenomik) wird immer häufiger in den Agrar- und Umweltwissenschaften, und viele Umweltproben in diesen Disziplinen können physikalisch-chemisch und mikrobiologisch einzigartige (zB Fäkalien und Abfall / Bettwäsche Proben aus sein die Geflügelproduktion Spektrum), müssen geeignete und wirksame DNA-Extraktionsmethoden sorgfältig ausgewählt werden. Daher wurde eine neue halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsverfahren, die speziell für die Verwendung mit Umweltgeflügelproduktion Proben entwickelt. Diese Methode ist eine Kombination der beiden wichtigsten Arten von DNA-Extraktion: mechanische und enzymatische. Ein zweistufiges intensiven mechanischen Homogenisierungsschritt (mit Wulst schlag speziell für environmen formuliertental Proben) wurde Anfang der "Goldstandard" enzymatische DNA-Extraktions-Verfahren hinzugefügt für Stuhlproben, um die Entfernung von Bakterien und DNA aus der Probenmatrix und zur Verbesserung der Rückgewinnung von Gram-positiven bakteriellen Mitgliedern der Gemeinschaft. Sobald die enzymatische Extraktion Abschnitt des Hybridverfahren eingeleitet wurde, wurde die restliche Reinigungsverfahren unter Verwendung eines Roboter-Arbeitsstation, um den Probendurchsatz zu erhöhen und Probenbearbeitungsfehler automatisiert. Im Vergleich zu den strengen mechanischen und enzymatischen DNA-Extraktionsmethoden, dieses neue Hybridverfahren vorgesehen die beste Gesamtleistung in Kombination, wenn man quantitativ (mit 16S-rRNA-qPCR) und qualitativen (mit microbiomics) Schätzungen der Gesamtbakteriengemeinschaften bei der Verarbeitung von Geflügel Kot und Einstreu Proben .

Einleitung

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Bei der Analyse komplexer klinischer oder Umweltproben (z.B. Kot, Böden) gibt es zwei Hauptmethoden für die Extraktion von DNA. Der erste ist ein mechanischer Aufschluss der Matrix durch einen intensiven Bead-Beating-Schritt, während der zweite ein enzymatischer Aufschluss der Matrix ist, um Bakterienzellen chemisch freizusetzen und PCR-Inhibitoren gleichzeitig aus der Matrix zu hemmen. Angesichts der unterschiedlichen Wirkungsweise dieser beiden Arten von Extraktionsmethoden ist es nicht verwunderlich, dass frühere Studien gezeigt haben, dass die geeignete DNA-Extraktionsmethode sowohl stark von der Probe als auch von der Analyse abhängt. Vergleichende DNA-Extraktionsstudien zeigten zuvor, dass einige Methoden besser geeignet sind, um die DNA-Qualität und -Quantität aus Umweltproben1-3 zu verbessern, während andere Verbesserungen für Analysen auf Gemeinschaftsebene zeigten, wie z. B. die denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE)4-6, der Polymorphismus der terminalen Restriktionsfragmentlänge (T-RFLP)7, die automatisierte ribosomale intergene Spaceranalyse (ARISA)8 und phylogenetische Microarrays9. Daher müssen je nach Art der Umweltproben und der Art der Analysen, die an diesen Proben durchgeführt werden, geeignete DNA-Extraktionsmethoden verwendet oder entwickelt werden, insbesondere angesichts der jüngsten Fortschritte bei der Analyse der Bakteriengemeinschaft.

Next Generation Sequencing, in Verbindung mit quantitativeren Gemeinschaftsbewertungen (z.B. quantitative PCR (qPCR)), wird in den Umwelt- und klinischen Wissenschaften immer häufiger, jedoch wurde nur sehr wenig Forschung durchgeführt, um die Wirkung von DNA-Extraktionsmethoden auf diese Datensätze zu bestimmen. Die meisten Vergleichsstudien zur DNA-Extraktion befassten sich mit Schätzungen der mikrobiomischen Gemeinschaft von Menschen oder menschlichen Modellproben10,11, nicht mit landwirtschaftlichen Tierproben. Die wenigen auf Geflügel fokussierten Next Generation Sequencing-Studien befassten sich mit spezifischen metagenomischen12, 13 oder mikrobiomischen14 Fragen; Sie diskutierten nicht die Auswirkungen der DNA-Extraktionsmethode auf die resultierenden mikrobiomischen Analysen. In Anbetracht der Komplexität von Umweltproben im Zusammenhang mit der Geflügelproduktion (z. B. Kot, Einstreu/Einstreu, Weideboden) müssen DNA-Extraktionsmethoden sorgfältig ausgewählt werden. Es ist bekannt, dass Geflügelproben eine große Anzahl von PCR-Inhibitoren enthalten, und für die PCR und die anschließende nachgelagerte Analyse waren bis zu 500-fache DNA-Extraktverdünnungen erforderlich15-17. Daher ist es wichtig, dass DNA-Extraktionsmethoden für diese Art von Proben optimiert werden, um nicht nur die Matrix physikalisch zu zerstören, sondern auch die große Anzahl der vorhandenen Inhibitoren reduzieren/eliminieren zu können.

Das QIAamp DNA Stool Mini Kit, eine enzymatische Extraktionsmethode, gilt als "Goldstandard" bei der Extraktion von DNA aus schwierigen Darm-/Stuhlproben1,18,19 und wurde erfolgreich auf Geflügelumweltproben angewendet8,14. Die enzymatische Entfernung von PCR-Inhibitoren durch die Verwendung einer proprietären Matrix ist einer der größten Vorteile dieser Methode für diese Art von Umweltproben, ebenso wie die Möglichkeit, den Durchsatz erheblich zu verbessern (und Fehler bei der Probenverarbeitung zu reduzieren) mit automatisierten Workstations. Ein großer Nachteil ist das Fehlen eines mechanischen Homogenisierungsschritts, um Bakterienzellen physikalisch von der Umweltmatrix zu trennen. Bei der Untersuchung von Darm- und Stuhlproben, die nicht von Geflügel stammen, konnte die Hinzufügung eines Bead-Beating- oder mechanischen Unterbrechungsschritts innerhalb eines DNA-Extraktionsprotokolls die Extraktionseffizienz9, die DNA-Ausbeute/-Qualität1,4,5 und die nachgelagerten Analysen der Gemeinschaft in Bezug auf Reichtum, Diversität und Abdeckung signifikant verbessern5,6,11. In diesen Studien wurden nicht nur mechanische Bead-Beat-Methoden mit der enzymatischen Methode des "Goldstandards" verglichen, sondern einige fügten dem enzymatischen Protokoll auch den mechanischen Bead-Beat-Schritt hinzu, um die Ergebnisse zu verbessern6,9,11.

Gemäß den Ergebnissen aus den oben genannten Studien konnten Analysen der Bakteriengemeinschaft (sowohl qualitativ als auch quantitativ) von Geflügelproben verbessert werden, indem der enzymatischen Methode ein mechanischer Homogenisierungsschritt hinzugefügt wurde. Daher war das Ziel dieser Studie zweierlei: (1) eine neuartige DNA-Extraktionstechnik zu entwickeln, die die wünschenswertesten Aspekte sowohl der mechanischen (leistungsstarker Homogenisierungsschritt) als auch der enzymatischen (PCR-Inhibitorentfernung und Automatisierung) Extraktionsmethoden nutzt, und (2) die quantitativen (via qPCR) und qualitativen (via Mikrobiomik) bakteriellen Community-Bewertungen dieser neuartigen Methode mit repräsentativen mechanischen und enzymatischen Methoden zu vergleichen.

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Protokoll

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1. Mechanische Homogenisierung von Umweltzucht Proben

  1. Vor der Extraktion, setzen Sie ein Wasserbad auf 95 ° C und das Wasser Badezeit, um diese Temperatur zu erreichen.
  2. Abwiegen 0,33 g Boden oder Fäkalien in eine 2 ml Lysismatrix E Rohr.
    1. Sie 0,33 g der Probe in der Röhre nicht überschreiten, da dies die folgenden Lösungen führen, um die Kapazität des Rohres übertrifft.
    2. Eingefrorene Proben auf Raumtemperatur vor dem Wiegen.
    3. Um insgesamt 1 g Boden / Kot zu analysieren, aus 3 wiegen replizieren 0,33 g Proben für jedes einzelne Umweltprobe.
    4. Proben bei -20 ° C innerhalb der konischen Matrixröhren vor der Extraktion, wenn nötig.
  3. Fügen Sie 825 ul Natriumphosphat-Puffer und 275 ul des PLS-Lösung zu einem Probenröhrchen. Mischen auf dem Vortex ~ 15 Sekunden und dann Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 xg für 5 min.
  4. Dekantiert man die supernatant und fügen Sie 700 ul Puffer ASL. Mischen mit einem Vortex für 5 Sekunden.
    1. Sorgen Sie für eine Headspace (~ 10% Volumen) im konischen Rohr an dieser Stelle. Wenn kein Kopfraum, werden die Rohre eine Tendenz, bei der nächsten Stufe der Homogenisierung, die um eine Kreuzkontamination und / oder Probenverlust führen könnte auslaufen müssen.
  5. Die Proben werden in einen FastPrep 24 Instrument und Homogenisierung der Proben mit einer Geschwindigkeit von 6,0 m / s für 40 sec.
  6. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 14.000 xg für 5 min. Den Überstand in ein steriles 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. Um die DNA-Gewinnung aus der Probe zu maximieren, wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.6, die Kombination der Überstände in den gleichen sterilen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

2. Die enzymatische Hemmung der Inhibitoren von Proben Homogenate

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die QIAamp DNA Stool Mini Kit.

  1. Inkubieren Sie dieÜberstand in einem 95 ° C Wasserbad für 5 min zur DNA-Gewinnung aus verbleibenden Zellen in dem Überstand zu maximieren.
    1. Inkubiere bei 70 ° C für Proben, die hauptsächlich aus Gram-negative Organismen. Jedoch, wenn Gram-positive Organismen vorhanden ist (was der Fall mit Geflügel Kotproben ist) sind, Inkubation bei 95 ° C.
    2. Verwenden Sie Kunststoff-Befestigungsklammern auf den Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass die Rohre nicht "Pop" offen und möglicherweise verlieren Probenvolumen als Druck kann in diesen verschlossenen Reaktionsgefäße zu bauen.
  2. Öffnen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen, um die Druck, re-cap die Reaktionsgefäße zu lösen und mischen mit einem Vortex für 15 Sekunden.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 · g für 1 min, entfernen Sie 1,2 ml des Überstandes und legen Sie sie in eine neue sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. 1 Inhibitex Registerkarte zu jeder Probe und mischen mit einem Vortex, bis die Probe wird eine gleichmäßig weiße / Aus-weiße Flüssigkeit.
    1. Vermeiden touching die Registerkarte Inhibitex während des Einsetzens in das Reaktionsgefäß mit der Probe. Um dies zu erreichen, setzen Sie die Blisterpackung auf die Registerkarte, die direkt über dem offenen Mikrozentrifugenröhrchen und drücken Sie auf die Registerkarte vorsichtig aus dem Blister und in das Reaktionsgefäß.
  5. Inkubieren der Probe für 1 min bei RT (ca. 25 ° C) und Zentrifugation bei 14.000 × g für 5 min.
  6. Übertragen Sie die gesamte Flüssigkeit in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 14.000 xg für 5 min.
    1. Vermeiden jegliche verbleibenden Partikel, die am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens am Ende von Schritt 2.5 beim Übertragen der Flüssigkeit sedimentiert haben kann.

3. Automatisierte DNA-Reinigung mit dem QIAcube Robotic Workstation

HINWEIS: Die Anzahl von Kunststoffzusätze, die Anordnung der Probenrotor Adapter innerhalb der Zentrifuge, und die erforderlichen Mengen der Puffer / Lösungen abhängig numzahl der Proben, die ausgeführt wird sind.

  1. Fügen Elutionsgefässe und Filterrohre in die entsprechenden Steckplätze innerhalb der Rotoradaptern. Für jede Probe wird mit 400 & mgr; l zu dem mittleren Schlitz der Rotorteil. Zeigen die Rotoradaptern in der Workstation Zentrifuge in der richtigen Anordnung gemäß der Anzahl von Proben gereinigt wird.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle der Mikrogefäßdeckel ordnungsgemäß innerhalb der Rotorteil gesichert, da ein Ausfall kann es zu in Scheren während einer der Zentrifugationsschritte des Reinigungsprotokoll führen.
  2. Fügen Sie die erforderliche Anzahl von 1.000 & mgr; l und 200 & mgr; Filter-Spitzen auf der Arbeitsstation, und füllen Sie die mitgelieferten Pufferflaschen mit dem erforderlichen Volumen von Puffer.
    HINWEIS: Die für dieses Reinigungsprotokoll (AL, AW1, AW2 und AE) benötigten Puffer sind alle innerhalb des QIAamp DNA Stool Mini Kit enthalten. Der Benutzer braucht, um die 100% Ethanol, die für die AW bu benötigt wird liefernob bietet und als Lösung in dem Reinigungsverfahren verwendet wird.
  3. Fügen Sie das erforderliche Volumen der zugeführten Proteinase K-Lösung in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in Schlitz A auf der Arbeitsstation. Außerdem fügen die erforderliche Anzahl (gleich der Anzahl von Proben gereinigt wird) mit dem Rüttler Abschnitt der Arbeitsstelle 2 ml Safe-Lock-Mikroprobenröhrchen RB.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Deckel der Probenröhrchen fest in die entsprechenden Schlitze auf der Arbeitsstation platziert, da ein Versagen zu tun, wird zu einem Fehler, wenn die Maschine zunächst scannt die Arbeitsstation, um sicherzustellen, dass alle benötigten Kunststoffe und Flüssigkeiten sind für den angeforderten verfügbar laufen.
  4. Verwendung des Touchscreens auf der Arbeitsstation, wählen Sie die DNA Stool - Human Hocker - Nachweis von Krankheitserregern auf Protokoll, und lesen Sie sich die folgenden Parameter, um sicherzustellen, dass die Arbeitsstation richtig eingelegt wurde. Sobald Sie alle Kontrollbildschirme übergeben, wählen Sie Start, um dieses Protokoll ausführen.
    1. Wenn Extrahieren von DNA aus mehr als 12 Proben, beginnen die Homogenisierung (Stufe 1) für den nächsten Satz von Proben, da ein Durchlauf von 12 Proben nimmt ~ 72 min auf der Workstation zu beenden.
  5. Entfernen Sie die Proben aus den Rotor-Adapter, diese abschließen, und statt bei -20 ° C bis zur anschließenden Downstream-Analysen benötigt.
    1. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die 3 replicate Reinigungen für eine individuelle Probe (insgesamt analysierten Betrag = 1 g) unter Verwendung eines Zentrifugations / Verdampfungs-basierten System. Vereinige die Replikate und Wieder Eluats auf ein Endvolumen von 100 & mgr; l Tris-EDTA-Puffer.

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Ergebnisse

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Für diese Studie wurden frisch fäkal Kot und Einstreu Proben von einem kommerziellen Broilerstall (~ 25.000 Vögel) im Südosten der USA gewonnen. Die Masthühner (Gallus gallus) waren Cobb-500 durchquert, und sie waren 59 Tage alt zum Zeitpunkt der Probenahme. Frische Fäkalien und Abfall-Proben wurden von vier verschiedenen Bereiche innerhalb des Hauses gewonnen (in der Nähe von Kühlkissen, in der Nähe der waterer / Zubringerlinien, zwischen den waterer / Speiseleitungen und in der Nähe von Abluftventilatoren) un...

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Diskussion

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Die verwendeten DNA-Extraktionsverfahren erfolgen die quantitativen und qualitativen Gesamtkeim Schätzungen Gemeinschaft sowohl für die fäkale und Wurf-Proben, die Unterstützung der Probenanalysen Abhängigkeit der DNA-Extraktionsverfahren zuvor 1,3,6 gesehen. Sowohl für die fäkale und Wurf Proben war die Reihenfolge der Durchführung der DNA-Extraktionsmethoden verschiedene für die quantitative (Mechanisch> Trekking> enzymatische) und qualitativen (enzymatische> Trekking> Mechanische) Gesamtkeim Sc...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren möchten Latoya Wiggins und Katelyn Griffin für ihre Unterstützung bei der Probenbeschaffung sowie Laura Lee Rutherford für ihre Unterstützung bei der Probennahme und molekularen Analysen danken. Wir möchten uns auch bei Sarah Owens vom Argonne National Lab für die Vorbereitung und Sequenzierung mikrobiomischer Proben bedanken. Diese Untersuchungen wurden gleichermaßen vom Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects "Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems" #6612-41420-017-00 und "Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry" #6612-32000-059-00 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lysing Matrix E TubeMPBio6914-050Verschiedene Größen erhältlich und die letzten 3 Ziffern der Kat. Nein. Größe angeben (-050 = 50 Röhrchen, -200 = 200 Röhrchen, -1000 = 1.000 Röhrchen)
Natriumphosphat-LösungMPBio6570-205Kann einzeln erworben werden oder auch im FastDNA Spin Kit für Kot enthalten sein (Kat. Nr. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 HomogenisatorMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep Adapter (Kat. Nr. 116002527) zur Verdoppelung des Durchsatzes des mechanischen Homogenisierungsschritts
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass QIAcube HT (Kat. Nr. 9001793) kann zur Verbesserung des Durchsatzes verwendet werden, aber es werden andere Verbrauchsmaterialien von dieser Maschine verlangt und es muss mehr Vergleichsarbeit geleistet werden.
Filterspitzen, 1.000 ml (1024)Qiagen990352
Filterspitzen, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotoradapter (10 x 24)Qiagen990394Für 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die im Rotoradapter-Kit enthalten sind, gibt es eine Alternative.  Es handelt sich um Sarstedt Micro tube 1,5 ml Safety Cap, Cat. Nr. 72.690
Probenröhrchen RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok Mikro-Reagenzglas, Kat. Nr. 022363352

Referenzen

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Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

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