Hier beschreiben wir einen einfachen Assay zur Quantifizierung der Fressreaktion in Hydra, die durch die reduzierte Form von Glutathion induziert wird. Dieser Assay beruht auf der Messung des Abstands zwischen dem apikalen Ende des Tentakels und dem Mund der Hydra.
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Methodenartikel
Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hydra gehört zu den primitivsten Organismen, die ein Nervensystem und eine Chemoempfindung zum Nachweis von reduziertem Glutathion (GSH) zum Fangen der Beute besitzen. Die Bewegung der Beuteorganismen bewirkt eine mechanosensorische Entladung der Nesselzellen, der Nematozysten von der Hydra, die in die Beute eingebracht werden. Die Fressreaktion bei Hydra, die das Einrollen der Tentakel umfasst, um die Beute zum Maul zu bringen, das Öffnen des Mauls und das anschließende Verschlingen der Beute, wird durch GSH ausgelöst, das in der von der verletzten Beute freigesetzten Flüssigkeit vorhanden ist. Um den bisher unbekannten molekularen Mechanismus der Fressreaktion bei Hydra identifizieren zu können, ist es notwendig, einen Assay zur Messung der Fressreaktion zu etablieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fressreaktion, bei der der Abstand zwischen dem apikalen Ende des Tentakels und der Mündung der Hydra gemessen und das Verhältnis dieses Abstands vor und nach der Zugabe von GSH bestimmt wird. Es wurde festgestellt, dass das Verhältnis, das als relative Tentakelspreizung bezeichnet wird, ein Maß für die Fressreaktion liefert. Dieser Assay wurde anhand eines Hungermodells validiert, in dem ausgehungerte Hydra im Vergleich zu täglich gefütterten Hydra eine verbesserte Fressreaktion zeigten.
Einleitung
Hydra ist der primitivste Organismus, der ein Nervensystem und eine Chemoempfindung zum Nachweis von reduziertem Glutathion (GSH) zum Fangen der Beute besitzt1. Er ernährt sich von einer Vielzahl von Tieren wie Fadenwürmern, Krebstieren, Insektenlarven, Kaulquappen und frisch geschlüpften Fischen1. Die Bewegung dieser Beuteorganismen bewirkt eine mechanosensorische Entladung der Nesselkapseln, der Nematozysten von der Hydra, die in die Beute eingebracht werden2. GSH, das in der von der verletzten Beute freigesetzten Flüssigkeit vorhanden ist, aktiviert anschließend die Fressreaktion in der Hydra, die das Einrollen der Tentakel umfasst, um die Beute zum Maul zu bringen, das Öffnen des Mauls und das anschließende Verschlingen der Beute. Es wurde gezeigt, dass mehrere Moleküle wie Dopamin3, Glutamat4, GABA, Glycin5, NMDA-Rezeptoren6 und Allatotropin7 an der Fressreaktion in Hydra beteiligt sind. Es wurde auch gezeigt, dass die durch GSH induzierte chemosensorische Reaktion durch den Fressstatus des Tieres moduliert wird, so dass ausgehungerte Hydra eine verstärkte Fressreaktion zeigten1. Eine solche Erhöhung der GSH-Sensitivität ist biologisch relevant, da Hydra unter Hunger ihre Beute mit höherer Sensitivität finden müssen.
Obwohl die durch GSH induzierte Fressreaktion unter dem Mikroskop deutlich beobachtet werden kann, sind die Methoden, die typischerweise zur Messung der Beobachtungen der Fressreaktion verwendet werden, nicht quantitativ. In den meisten Fällen wurde die Zeit, in der das Maul der Hydra offen bleibt, als Maß für die Fressreaktion genommen8,9; In einem anderen Fall basierte die Quantifizierung auf der Anzahl der Hydra in einer Population, die die Fressreaktion10 zeigte. Die Beobachtung der Mundöffnungszeit der Hydra-Polypen ist jedoch umständlich und unterliegt Variationen, die durch unkontrollierbare Parameter wie die Richtung der Mundausrichtung während der Beobachtungen hervorgerufen werden. Da die Fütterungsreaktion ein quantitativer Parameter ist, unterliegen populationsbasierte Ansätze Variationen/Fehlern, die durch die Meinung oder Beobachtungsverzerrung des einzelnen Beobachters verursacht werden. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine Methode zur relativen Quantifizierung der Fressreaktion bei Hydra (Hydra vulgaris, Ind-Pune11) entwickelt, die auf dem Abstand des apikalen Endes des Tentakels von der Mündung des Hydra-Polypen basiert.
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Protokoll
1. Hydra, Kultur und Messung der Fütterung Antwort
- Aufrechtzuerhalten Hydra Polypen in Kultur durch tägliche Fütterung mit Artemia und halten sie in einem Medium (1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl und 0,1 mM MgSO 4) in ein enthaltenes Glasschale bei 18 ° C unter 12 Stunden Licht-12 h Dunkel-Zyklen wie zuvor 12 beschrieben.
- Zur Messung der Fütterung Antwort übertragen Älterer Hydra Polypen mit 5 bis 6 Tentakeln zu einem einzelnen Well einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie die Restmittel aus dem Brunnen durch Kippen und dann sofort hinzuzufügen 500 ml frisches Medium.
- Bereiten 9 uM Glutathion-Lösung in Hydra Medium. Da die Glutathion-Lösung ist anfällig für Oxidation, immer frisch zubereitet Glutathion-Lösung für jedes Experiment.
- Übertragen Sie die Platte an der Imaging-Plattform eines Mikroskops mit Bestimmungen für die Bildaufzeichnung. Verwenden Sie einen dunklen Hintergrund, so dass das Verhalten of Hydra Polypen deutlich gegen den kontrastierenden Hintergrund abgebildet werden.
- Der Raum für die Beobachtung und Abbildung des Verhaltens von Hydra frei von Lichtern von schwankenden Intensitäten, Luftströmungen und Lärm gewöhnt. Solche Störungen könnten auch dazu führen, die Hydra Polypen zu einer Kontraktion der Tentakeln zeigen - auch in Abwesenheit von Glutathion.
- Lassen Sie die Polypen zu 5 min zu entspannen.
- Sicherzustellen, dass der Polyp ist entlang der zentralen Region der Vertiefung, so daß das Verhalten deutlich abgebildet werden entfernt. Wenn der Polyp ist am Rand des Brunnens, bringen Sie es in die Mitte durch Spülen des Mediums mit einer Pipette und wieder erlauben zu entspannen.
- Aufnehmen eines Bildes von Hydra im entspannten Zustand. Dies wird die Null-Zeitpunkt Beobachtung stehen.
- Hinzuzufügen schnell 9 uM Glutathion-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 & mgr; M in dem Bohrloch zu erreichen. Je nach dem Zweck des Experiments und der Reaktion von Hydra gezeigt, testen eine Reihe von verschiedenen Konzentrationen von Glutathion und ChooSE Die geeignete Konzentration erforderlich.
- Starten Sie den Timer unmittelbar nach dem Hinzufügen Glutathion-Lösung und die Aufnahmen nach jedem 15 bis 30 sec für 4-5 min. Die Vergrößerungseinstellungen während der Zeitraffer-Bildgebung nicht verändern.
- Hinzufügen des Glutathion-Lösung schonend und gleichförmige Strömung, so dass die Position des Tieres in der gut wäre minimal in das Sichtfeld des Mikroskops gestört werden. Allerdings, wenn der Polyp bewegt ausgiebig nach Zugabe Glutathion-Lösung, bewegen Sie die Platte sehr vorsichtig, um die Polypen in das Blickfeld für die Bilderfassung zu bringen.
- Im Kontrollexperiment verwenden Medium ohne Glutathion und gleichzeitig alle anderen Parameter gleich.
- Achten Sie darauf, alle der oben genannten experimentellen Schritte in der ersten Hälfte des Tages durchzuführen - vor 13.00 Uhr, um die möglichen Auswirkungen der zirkadianen Rhythmus auf das Ausmaß der Fütterung Reaktion zu vermeiden.
- Öffnen Sie jedes der aufgenommenen Bilder unter Verwendung der GNU Image Manipulation Program (GIMP). Verwenden Sie die "Messen" Werkzeug von Menü> Extras> Messen Sie den Abstand zwischen apikalen Ende von jedem der Tentakeln und Hypostom bestimmen. Wenn die Mündungsöffnung in einem der Bilder beobachtet, den Abstand zwischen der Mitte des geöffneten Mund und dem apikalen Ende der Tentakel. Beziehen sich auf diese Distanz als die Tentakel Verbreitung.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Tentakel Spread für jeden Polypen vor und nach Glutathion Exposition. Berechnen des Verhältnisses der durchschnittlichen Tentakel Ausbreitung bei Null-Zeitpunkt an, dass an jedem der folgenden Zeitpunkte. Dieses Verhältnis wird relativ Tentakel Spread bezeichnet werden.
- Wiederholungsmessungen für mindestens 20 Polypen.
2. Methodenvalidierung mit Hilfe derStarvation Modell
- Für Hunger, übertragen einige Hydra Polypen zu einer separaten Glasschale und sie nicht für 5 Tage zu ernähren. Führen Sie das Kontrollgruppe von wenigen Polypen täglich mit Artemia in einem ähnlich großen Schüssel. Ändern Sie das Medium aus experimentellen Schalen täglich Pilzwachstum im Medium zu vermeiden.
- Am Tag des Experiments, füttern die Kontrollgruppe von Hydra mit Artemia für 1 Stunde und verwenden Sie diese Hydra für die nachfolgenden Experimente nach dem Entfernen aller uneaten und toten Artemia aus dem Medium.
- Messung der Vorschub Reaktion des Hydra ausgehungert im Vergleich mit der Kontrollgruppe Hydra aus der zuvor in Schritt 1 beschrieben, um jegliche Verzerrungen zu vermeiden Verfahren aufgrund Beobachtungszeit, abwechselnd die Messungen jedes der ausgehungert und steuern Hydra Polypen.
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Ergebnisse
Glutathion bewirkt Hydra, um ein Kräuseln der Tentakeln zur Mündung zum Zwecke der engulfing die Beute zeigen. Solche Curling von Tentakeln bringt apikalen Enden der Tentakeln näher am Hypostom. Dies resultiert in der Reduktion der Tentakel zu verbreiten, oder der lineare Abstand zwischen apikalen Ende des Tentakel und Hypostom (Abbildung 1). Die relative Tentakel Ausbreitung, oder das Verhältnis der durchschnittlichen Tentakel vor verbreitet und nach Zugabe von Glutathion, gemittelt über mehrere Polype...
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Diskussion
Fressverhalten in Hydra stellt eines der Vorfahren chemosensory Systeme der Metazoen. Obwohl die Anwesenheit von GSH in der nach nematocyst gestützte Beutefang freigegeben Krustentier Flüssigkeit wurde schon vor langer Zeit erkannt 1, haben weder die GSHR Proteine noch die mutmaßlichen kodierenden Gens / s von Hydra bisher geprägt. Einige Versuche wurden unternommen, um zu charakterisieren GSH-bindende Proteine in Hydra 8, 14, 15. Jedoch bleibt die Identität dieser putativen Rezeptorproteine ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Die Autoren danken K. P. Madhu, Nita Beliappa und den Mitarbeitern des Medienzentrums des Indian Institute of Science Education and Research, Pune für ihre Hilfe bei der Videoproduktion. Die Arbeit wurde durch eine Finanzierung im Rahmen des Centre of Excellence-Programms des Department of Biotechnology, Government of India an SG, und ein Postdoc-Stipendium des Department of Science and Technology, Government of India, an RK unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gekühlter Inkubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Mikroskop | Leica | S8AP0 | |
| Kamera für das Mikroskop | Leica | EC3 | |
| Reduziertes Glutathion | Sigma | G4251 | Gelagert bei 4 °C. Bringen Sie die Flasche vor dem Öffnen auf Raumtemperatur, um Oxidation zu vermeiden |
| Bildbearbeitungsprogramm | GIMP | Version 2.8 |
Referenzen
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
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