Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Zusammenfassung

Alopezie ist eine häufige Form von Haarausfall, die bei vielen verschiedenen Erkrankungen auftreten kann, auch als Nebenwirkung einer Chemotherapie. Wir haben eine Methode zur Quantifizierung des Haarausfalls bei Mäusen entwickelt, indem wir einen Standard-Gel-Imager verwenden, um eine Graustufenanalyse durchzuführen und so die Untersuchung vielversprechender neuer Alopezie-Therapien zu erleichtern.

Zusammenfassung

Alopezie ist eine häufige Form des Haarausfalls, die in vielen verschiedenen Bedingungen, einschließlich der männlichen Haarausfall, Syndrom der polyzystischen Ovarien und Alopecia areata auftreten können. Alopezie kann auch als Nebenwirkung der Chemotherapie bei Krebspatienten auftreten. In dieser Studie war es unser Ziel, eine konsistente und zuverlässige Methode, um Haarausfall bei Mäusen, die es erlauben Forschern, genau zu beurteilen und vergleichen Sie neue Therapieansätze für diese verschiedenen Formen von Haarausfall wird quantifizieren zu entwickeln. Das Verfahren nutzt ein Gel Standardbildgeber, um Bilder von Mäusen erhalten und verarbeiten, die Messung der Lichtabsorption, die in groben Verhältnis zu der Menge von Schwarz (oder Grau) Haar auf der Maus erfolgt. Daten, die auf diese Weise quantitativ bestimmt worden ist, kann dann unter Verwendung von statistischen Standardtechniken (dh, ANOVA, t-Test) analysiert. Diese Methode wurde in Mausmodellen von Chemotherapie-induzierter Alopezie, Alopecia areata und Alopecia aus Wachsen getestet. In diesem Bericht ist die detaillierte Protokoll prestierten zur Durchführung dieser Messungen, einschließlich der Validierung Daten von C57BL / 6 und C3H / HeJ-Mausstämme. Dieses neue Verfahren bietet eine Reihe von Vorteilen auf, einschließlich der relativen Einfachheit der Anwendung, der Verlässlichkeit von Geräten, die in den meisten Laboratorien leicht verfügbar ist, und Anlegen eines objektive, quantitative Beurteilung, die robuster als die subjektiven Bewertungen ist. Verbesserungen bei der Quantifizierung von Haarwachstum bei Mäusen wird Studie von Alopecia Modelle zu verbessern und Auswertung der vielversprechende neue Therapien in präklinischen Studien.

Einleitung

Alopezie (Haarausfall) kann eine psychologisch und emotional belastenden Ereignis mit mehreren Ursachen. GPH ist die häufigste Ursache von Haarausfall, die etwa zwei Drittel der Männer im Alter von 35 ^ein. Ein ähnliches Muster des Haarausfalls kann bei Frauen mit PCO-Syndrom beobachtet werden. In beiden dieser Erkrankungen wird der Haarausfall Androgenrezeptor vermittelten. Alopecia können auch als Autoimmunkrankheit, Alopezie areata, die 1,7% der Bevölkerung betroffen ² auftreten. Alopezie kann als Nebeneffekt von einigen medizinischen Behandlungen, wie die Chemotherapie ³ auftreten. Ein hoher Prozentsatz (65-85%) der Chemotherapie-Patienten erleben ein gewisses Maß an Haarausfall ^4,5. Die psychischen Folgen von Haarausfall sind gut in der Chemotherapie-Einstellung untersucht. Chemotherapie-induzierter Alopezie kann in Angst, Depression, ein negatives Körperbild, senkte das Selbstwertgefühl und einer verringerten Gefühl von Wohlbefinden ^6,7 führen. Eine hohe percentage (47-58%) der weiblichen Krebspatienten überlegen Haarausfall um die traumatischen Aspekt der Chemotherapie sein und bis zu 8% Rückgang Behandlung aus Angst vor Haarausfall ^4,6. Es gibt auch Hinweise in androgenetische Alopezie, die Therapie, psychologische und sogar medizinischen Folgen von Haarausfall ^8,9 reduzieren unterstützen. Ebenso Alopecia areata wurde berichtet, dass schwere psychische Folgen ² haben und die lückenhafte Natur der Haarausfall kann zu einer unangenehmen kosmetische Ergebnis als die meisten anderen Ursachen für Haarausfall führen.

Während Medikamente mit milden anti-androgenen Wirkungen (dh Spironolacton) hatten mit mäßigem Erfolg als Therapie für Alopezie verwendet wurde, das erste wirksame Medikament für Alopezie Minoxidil war ^10. Diese antihypertensive hat eine beobachtete Nebenwirkung verursacht Haarwachstum, und wird nun als topische Therapie für viele Formen der Alopezie verwendet. Allerdings sind Reaktionen oft unvollständig, mit einigen Themen, die nur langsaming von Haarausfall statt tatsächlichen Nachwachsen ^10. Finasterid ist ein kompetitiver Antagonist II 5α-Reduktase zu Dihydrotestosteron Typ blockier Umwandlung von Testosteron, was zu Verbesserungen in der androgenen Alopezie zu Lasten der Teil systemische Androgenblockade. Die Ansprechraten mit langfristigen (10 Jahre) Therapie sind etwa 50% ^11. Insgesamt trotz beträchtlicher Forschung in diesem Bereich gibt es immer noch keine angemessene Therapie für Haarausfall.

Seit Jahrzehnten haben Forscher und Kliniker Methoden zur Messung der Kopfhaarwachstum in klinischen Studien untersucht. Mit der Entwicklung von Medikamenten, die Alopezie zu behandeln, hat es einen erhöhten Bedarf an zuverlässigen, wirtschaftlichen und minimal invasive Mittel zum Messen des Haarwuchses und insbesondere als Reaktion auf die Therapie. Bildanalysetechnik für eine genaue Quantifizierung der Haardichte bei Patienten mit Haarausfall Erkrankungen ergab konsistent und gültige Ergebnisse in der Vergangenheit unter Verwendung einer Vielzahl von techniques, einschließlich der Analyse der digitalisierten Bilder ^12, Bildanalyse der einzelnen Haare und Hautläsionen ¹³ und mikroskopische Scannen in Haarmasse in einem definierten Kopfbereich ¹⁴ zu quantifizieren.

Leider, während die oben genannten Methoden haben verbesserte Beurteilung der Wirksamkeit für das Haarwachstum fördernden Eingriffe in klinischen Versuchen, in diesen Verfahren nicht auf Studien an Nagetieren in präklinischen Untersuchungen angewendet. Unser Ziel ist es, eine konsistente und zuverlässige Methode, um Haarausfall bei Mäusen, die es erlauben Ermittler genauer bewerten und zu vergleichen neue Therapieansätze für verschiedene Formen von Haarausfall wird quantifizieren zu entwickeln. Wir haben eine Methodik mit Hilfe von Geräten in den meisten Labors, die eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung der Haardichte bei Mäusen mit braunen oder schwarzen Haares ermöglicht leicht verfügbar entwickelt. Diese Methode wurde in Maus-Modellen von chemotherapieinduzierter Alopezie, Alopecia areata und Alopecia von Waxin getestetg. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung dieser Messungen, einschließlich der Validierung Daten von C57BL / 6 und C3H / HeJ-Mäusestämme dargestellt. Da dieses Verfahren beruht auf der Erfassung der Lichtabsorption von Pigmenten in den Haarschaft, kann es nicht verwendet werden, um das Haarwachstum bei weißen Mäusen oder Albino Mäuse nachzuweisen.

Protokoll

Ethik Hinweise: Alle Studien, die Tiere müssen von der IACUC der Einrichtung genehmigt werden (für die folgenden Daten wurden Protokolle durch die Montefiore IACUC, Protokoll # 11-6-240 und 13-7-100 # zugelassen). Tiere sind vorhanden Licht Anästhesie für den alleinigen Zweck halten sie noch während der Aufnahme angezeigt wird, gibt es keine schmerzhaften Eingriffen für dieses Protokoll erforderlich.

1. Erwerb von Fotografien

1. Stellen Sie Fokus und Sichtfeld für Gel-Imager Papier mit gedrucktem Text. Stellen Sie sicher, Gleichmäßigkeit der Lichtquelle über fotografiert Region. Um sicherzustellen, Einheitlichkeit, mit einem Gel-Imager mit in Lichtquelle für reflektierende photography eine gebaut. Verwenden Sie keinen Durchlichtquelle, da dies eine Silhouette des Tieres, die für die weitere Analyse ungeeignet ist Graustufen erstellen.
   Hinweis: Dadurch wird die Maus leicht unscharf, die optische Mittel in der Region of Interest (ROI) bietet Platz und wirdHilfe Quanten Fehler zu reduzieren für sehr kleine (dh <10 Pixel) Bereiche von Interesse. Größere Bereiche von Interesse werden durch diese geringfügige Fokussierungseinstellung beeinträchtigt werden, noch werden sie durch Unterschiede in der Größe des Tieres berührt.
2. Anesthetize Tiere unter Verwendung von Ketamin (100 mg / ml) / Xylazin (20 mg / ml) (2: 1), da dies eine schnelle Anästhesiewirkung und eine schnelle Wiederherstellung und ist optimal für das Fotografieren mehrerer Tiere.
   HINWEIS: Anesthesia wird bestätigt, wenn das Tier noch genug Fotografie ermöglichen. Da die Tiere in der Regel von dieser Licht Anästhesie innerhalb von 10-15 Minuten zu erholen, hat der Tierarzt nicht empfohlen Nutzung von Augensalben.
3. Zeigen narkotisierten Tiere auf Gel-Imager in vertikaler Ausrichtung (so nah wie möglich parallel).
   1. Für Rücken Fotografien, legen Sie die Tiere in Bauchlage mit Gliedmaßen erweitert.
   2. Für ventralen Fotografien, platzieren Tiere in Rückenlage, wobei darauf geachtet, dass die Tiere nicht seitlich gedreht.
4. Zeigen Graustufen-Standard in fotografiert Region.
5. Schließen Zugangstür. Wichtig: Umgebungslicht kann Schwankungen Exposition einzuführen.
6. Stellen Sie Blende zu einer Exposition, die den interessierenden Bereich im linearen Bereich des Erwerbs setzt (Lesen F-Stop).
   HINWEIS: Die meisten Systeme werden angezeigt, wo das Bild ist gesättigt.
7. Nehmen Sie Fotos.
8. Ändern F-Stopp in einen anderen Belichtungseinstellung, die den interessierenden Bereich im linearen Bereich legt durch Erhöhung oder Verringerung der F-stop um 1, so dass sowohl die Standard- und die Region von Interesse in einer linearen Reihe von Erfassung (Referenz bleiben F- hör auf).
9. Nehmen Sie Fotos.
10. Sobald Fotografie abgeschlossen ist, legen Sie Tiere auf einem Tisch Erwärmung und zu überwachen, bis sie Brustlage halten kann. Zurück Tiere in ihre Käfige. Bringen Sie die Gruppe von Tieren auf das Vivarium, sobald alle Tiere vollständig erholt.

2. Quantifizierung der Lichtabsorption

1. Mark Regionen von Interesse auf die Bilder der Tiere unter Verwendung mitgelieferte Software für die Gel-Imager.
   1. Für Ganztier Dorsalansicht verwenden einen rechteckigen oder ovalen Bild sich von dem oberen Schenkel an den unteren Extremitäten, die sich seitlich so weit wie möglich, so dass kein Teil der Schachtel erstreckt sich über den Rücken des Tieres, wie in 1A gezeigt.
      HINWEIS: Man könnte auch markieren den Bereich von Interesse mit einem Freihand-Zeichenwerkzeug.
   2. Für ganze Tier Ventralansicht Verwenden 2 Rechtecke: eine für den Beckenbereich und eine für den Brustbereich, wie in 1B gezeigt.
   3. Für eine kleinere Region von Interesse, dh, die Lage der Arzneimittelverabreichung, Marke entsprechend.
2. Region Marke (n) von Interesse auf Graustufen Absorption Standard.
3. Record Absorption von jeder der markierten Regionen von Interesse.

3. Analyse

Absorptionsniveaus obtained für die Regionen von Interesse können müssen, um den Hintergrund-Standard für den Vergleich zwischen Fotografien normalisiert werden. Die Beziehung der Belastung durch Absorption log-log (dh die Beziehung linear zwischen log (Exposition) und log (Absorption)). Unter Verwendung dieser Beziehung kann die Absorption der interessierenden Region normiert auf eine Standard-Hintergrundwert, der ermöglicht Absorptionen direkt zwischen verschiedenen Aufnahmen, einschließlich derjenigen, die zu verschiedenen Zeitpunkten (dh seriellen Messungen innerhalb eines Studienprotokoll) aufgenommen verglichen werden. Das Verfahren für die Durchführung dieser Korrekturen wird in optionalen Schritte 3.1 und 3.2 beschrieben.

1. (Optional) Plot Kurve von log (Belichtung) gegen log (Absorption) mit Hilfe von Graustufen Absorption Standard erhaltenen Werte.
2. (Optional) Stellen Sie Schwankungen in der Standard jedes Fotos, wie folgt:
   1. Wählen Sie F-Stop für das Lesen und F-Stop Referenz (wie in Schritt 1.6 festgelegt) (wie in s bestimmttep 1.8).
   2. Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption der Standard in allen Aufnahmen am Lesen F-stop. Dieser Durchschnitt ist die Referenz-Standard-Wert (RSV).
   3. Berechnen Absorptionsdifferenz zwischen dem Lesen und Referenzblendeneinstellungen in jeder Photographie für den Standard (Delta-S) und für jeden definierten ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Berechnen Sie die korrigierte Absorptions für jede ROI wie folgt: Korrigierte Absorption (ROI-X) = Absorption (ROI-X) im Lesen F-stop + (RSV - Aufnahme von Standard zu lesen F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Kompilieren experimentellen Daten und eine Datenanalyse unter Verwendung von statistischen Standardtechniken für kontinuierliche Variablen (das heißt, ANOVA, T-Test).

Ergebnisse

Diese Technik wurde mit C3H / HeJ Mäusen eingepflanzt, die Maus-Modell der Alopecia areata ¹⁶ validiert. Diese Tiere entwickeln globale Haarausfall die nach und nach im Laufe der Zeit fortschreitet. Allerdings tritt der Haarausfall bei Patches, und können von der Maus zum nächsten variieren, die Einführung erhebliche Variabilität und erschweren qualitative Bewertungen. Dieses Modell eine Gelegenheit, um Korrelationen zwischen den Messungen der optischen Dichte an unterschiedlichen Stellen auf der Maus, wie di...

Diskussion

In diesem Bericht wird eine detaillierte Beschreibung einer neuen Technik zur Quantifizierung von Haarausfall bei Nagetieren ist. Diese Technik verwendet ein Gel Imager für Bilderfassung und -analyse, die Ausrüstung, die in den meisten Laboratorien leicht verfügbar ist. Die Messungen haben gezeigt, robuste auf geringfügige Änderungen in der Technik (Figuren 4 - 5) zu sein, und mit dem Grad der visuellen Haarausfall bei Behandlungsmodelle (Abbildung 6) gut korreliert. Di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel Imager zum Erfassen und Analysieren von Fotos, muss über eine eingebaute Lichtquelle für reflektierende Fotografie verfügen.
Die Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Greyscale standard
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mäuse für repräsentative Studie
C3H/HeJ transplantierte Maus	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine Mäuse	für repräsentative