Methodenartikel

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs In-vivo- Imaging der Maus Spinal Cord

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DOI:

10.3791/52196

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3. Dezember 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Zusammenfassung

Studien im Neokortex von Säugetieren haben eine beispiellose Auflösung der kortikalen Struktur, Aktivität und Reaktion auf neurodegenerative Beleidigungen durch wiederholte Zeitraffer-In-vivo-Bildgebung bei lebenden Nagetieren ermöglicht. Möglich wurden diese Studien durch unkomplizierte chirurgische Verfahren, die einen optischen Zugang über einen längeren Zeitraum ohne wiederholte chirurgische Eingriffe ermöglichten. Im Gegensatz dazu beschränkten sich analoge Untersuchungen des Rückenmarks bisher auf wenige bildgebende Sitzungen, die jeweils eine invasive Operation erforderten. Wie bereits beschrieben, haben wir eine Wirbelsäulenkammer entwickelt, die einen kontinuierlichen optischen Zugang von mehr als 8 Wochen ermöglicht, die mechanische Stabilität der Wirbelsäule bewahrt, während der Bildgebung leicht extern stabilisiert werden kann und nur eine einzige Operation erfordert. Hier wird das Design der Wirbelsäulenkammer mit den zugehörigen chirurgischen Instrumenten überprüft und das chirurgische Vorgehen im Detail demonstriert. Kurz gesagt zeigt dieses Video die Vorbereitung des Operationsgebiets und der Maus für die Operation, die Freilegung des Wirbels und das entsprechende Gewebedebridement, die Einführung des Implantats und der Wirbelklemmung, die Fertigstellung der Kammer, die Entfernung des Einführsystems, die Versiegelung der Haut und schließlich die postoperative Versorgung. Auch das Verfahren zur chronischen in vivo Bildgebung mittels nichtlinearer Mikroskopie wird demonstriert. Schließlich werden Ergebnisse, Einschränkungen, typische Variabilität und ein Leitfaden für die Fehlerbehebung besprochen.

Einleitung

Zeitraffer-in-vivo-Mikroskopie in intakten Organismen ermöglicht die direkte Visualisierung von komplexen biologischen Prozesse, die zu den traditionellen Einzelzeitpunktanalyse nicht zugänglich sind, wie Immunhistochemie. Insbesondere Mehrphotonenmikroskopie (MPM) 1 erlaubt für die Bildgebung in streuendem Gewebe, wie beispielsweise Nager Neocortex, wobei Abbildungs ​​bis zu 2,3 und mehr als 4 1 mm erreicht wurde. Wenn mit chirurgischen Vorbereitungen 5-7, in dem ein einziges Verfahren ermöglicht einen optischen Zugang zum Gehirn für Wochen bis Monate kombiniert wurden diese Mikroskopie Ansätze verwendet worden, um dynamische Prozesse im Gehirn von gesunden und erkrankten Zuständen 8-11 studieren. Darüber hinaus wurden Protokolle entwickelt 12,13, die für In-vivo-Bildgebung in wach (dh nicht narkotisierten) Tiere, so dass für zelluläre auflösenden funktionellen Bildgebung bei Verhaltenstests. Diese Protokolle wurden für Comparis verwendetons korrelierter neuronaler Aktivität 14, Astrozyten Calcium-Signal 15 in narkotisierten und wachen Tieren, die Identifizierung von aufgabenspezifischen neuronalen Cluster 16, und die Fähigkeit der Neuronen zur Lage des Objekts auf Whisker Stimulation 17 unterscheiden.

Angesichts der Möglichkeit dieses Ansatzes zu gesunden und pathologischen Mechanismen, Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung wurde dem Rückenmark der Maus (SC) aufgebracht aufzuklären, die die Identifizierung von akuten axonale Degeneration (AAD) als Krankheitsmechanismus 18. Anschließende Studien untersuchten Wirkungen der peripheren Läsionen auf Spinalganglien (DRG) Axonregeneration 19, die Rolle von Blutgefäßen in Axonregeneration 20, glial-Chemotaxis als Reaktion auf Verletzung 21, T-Zell-Migration in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) 22, Aktivität Mikroglia und Astrozyten 23,24 25 in Reaktion auf amyotrophic lateraler Sklerose (ALS), die Rolle von STAT-3 in axonalen Sprossung nach SC Verletzungen (SCI) 26 und einen Mechanismus der Axon Verlust und Wiederherstellung in EAE 27. Trotz des Erfolgs dieser Ansätze wurden alle diese Studien, entweder eine einzelne Abbildungs ​​Sitzung beschränkt, wodurch Untersuchungen zur kurzfristigen Dynamik Begrenzung oder auch erforderlichen wiederholten chirurgischen Öffnungen des Tieres bei jedem Abbildungszeitpunkt, wodurch die Anzahl von Zeitpunkten zugänglich und die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer Verwechslung experimentellen Artefakte. Protokolle für diese Operationen wurden zuvor 28,29 veröffentlicht.

Kürzlich veröffentlichten wir eine Technik, 30 für die Implantation einer chronischen Wirbelsäulen Kammer, die Zeitraffer MPM Bildgebung in der Maus SC über mehrere Wochen freigegeben ohne die Notwendigkeit wiederholter Operationen. Kurz gesagt enthalten diese chirurgische Vorbereitung Durchführung Laminektomie in der unteren Brustwirbelsäule und die Implantation von einer vierteiligen Kammer. Die Kammer enthaltendrei individuelle bearbeiteten Teile aus Edelstahl, der die Wirbel umgebenden Laminektomie und ein Deckglas über das SC plaziert und mit Silikonelastomer gesichert eingespannt ist. Diese Technik erlaubt für Routine-Bildgebung, um mehr als 5 Wochen nach der Operation bei gesunden und verletzten Staaten ohne die Notwendigkeit für Wiederholungsoperationen. Die Anzahl der Bilderzeugungszeitpunkten wurde nur von der Frequenz, mit der das Tier zur Narkoseeinleitung tolerieren beschränkt. Imaging Lebensdauer wurde durch das Wachstum einer dichten, fibrösen Gewebe über die Oberfläche des SC beschränkt. Darüber hinaus überprüft man, daß das chirurgische Implantat hatte keine langfristigen Auswirkungen auf die Motorfunktion.

Seit unserer ersten Veröffentlichung wurden alternative Ansätze auch ermöglicht langfristige Bildgebung in der SC-31-33 an anderer Stelle beschrieben. Dieses Protokoll zeigt unser Verfahren zum Implantieren des Rückenkammer von uns entwickelte.

Protokoll

HINWEIS: Die Pflege und experimentelle Manipulation aller Mäuse in diesem Papier wurde von der Cornell University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Einrichten für Chirurgie

  1. Sterilisieren Sie alle benötigten Werkzeuge unter Verwendung eines Autoklaven oder genehmigt Sterilisationsverfahren. Zumindest sind ein Skalpell, Schere, vanna Scheren, Pinzetten, Juwelier Schraubenzieher, Wattestäbchen, eine Reihe von Wundhaken, das Implantat (1A) und dessen Verabreichungssystem (1D, E).
  2. Wischen Sie alle Oberflächen, einschließlich aller Stereoskop Knöpfe, mit 70% Ethanol und / oder geeigneten Desinfektionsmittel.
  3. Erstellen Sie einen sterilen Bereich durch Überlagerung der benutzerdefinierten stereotax (1D) und Umgebung Tisch mit sterilen Tüchern. Heizkissen (vorzugsweise rückgekoppelt gesteuert) ist auf der Oberseite des stereotax und nach steriler Abdeckung platziert werden.

2. Vorbereitungdie Maus für Chirurgie

  1. Anesthetize eine Maus unter 5% Isofluran / Sauerstoff in einer Induktionskammer, bis die Atemfrequenz verlangsamt, um ca. 1 Atemzug / sec.
  2. Übertragen der Maus auf einen Staging-Bereich vom sterilen Bereich, mit einem Nasenkegel auf Isofluran Belichtung fortzusetzen. Reduzieren Isofluran bis 2%. Bewerben Augensalbe zur Hornhaut Austrocknen zu verhindern.
  3. Verabreichen Glycopyrrolat (ein Anticholinergikum) bei 0,05 mg / 100 g Maus intramuskulär in den Hinterbeinen mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 ml-Spritze und liefert etwa 50% des Einspritzvolumen pro Schenkel.
    HINWEIS: Glycopyrrolat dient zur Flüssigkeitsansammlung in den Lungen zu verhindern, während sich der Mauszeiger in Narkose.
  4. Mit elektrischen Haarschneider, rasieren einen Teil des dorsalen der Maus, ca. 3 cm lang und 2 cm breit und am Thoraxbogen zentriert. Den eventuell getrimmt Haar weit weg von der rasierten Bereich.
  5. Verwalten Sie die folgenden Injektionen subkutan und distal der rasiertenPatch mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 cc Spritzen: 1 ml / 100 g Maus 5% Glucose in Kochsalzlösung (für die Hydratisierung), 5 mg / kg Maus Ketoprofen (NSAID zur Analgesie), 0,2 mg / kg Maus Dexamethason ( ein entzündungshemmendes Steroid um Entzündungen zu behandeln).
  6. Mit Wattestäbchen, führen drei Wechsel Wäschen von Jod und 70% Ethanol, warten 1 min zwischen Wäschen.
  7. Verwalten Sie 100 ul 0,125% Bupivacain (a peripheren Nervenblockade) subkutan mit 29 bis 30 G Nadeln und 10.3 ml-Spritze in die Mitte des rasiert Patch zu Schmerzen an der Einschnittstelle zu reduzieren.
  8. Transfer-Maus an den kundenspezifischen stereotax (1D), legen Sie die rektale Thermometer, und warten Sie etwa 10 Minuten für Bupivicain wirksam werden.

3. Expose und Reinigen Sie die Rücken Laminae von 3 Angrenzend Brustwirbel

  1. Mit dem Skalpell, erstellen Sie einen kleinen (5 mm oder weniger) Schnitt über dem Wirbel von Interesse (Abbildung 2A).
  2. Entweder mit einer Pinzette oder durch Einführen der Spitze chirurgische Scheren und verbreiten Sie die Griffe, um die Größe der Öffnung in der Haut stumpf.
  3. Mit einem Skalpell oder chirurgische Schere vorsichtig distanzieren Binde- Faszie zwischen der Haut und der darunter liegenden Muskeln.
  4. Verwenden Wundhaken, um die Haut zurückhalten, so dass für eine möglichst große Arbeitsfläche wie möglich (2B). Achten Sie darauf, um die Last auf der Brust zu erhöhen und dadurch die Atmung behindern.
  5. Unter Verwendung einer Pinzette, greifen die rostral-meisten Wirbel, die durch den darüberliegenden Muskel freigelegt wird. Mit einem Skalpell geschnitten Gewebe weg auf beiden Seiten des Dornfort von allen 3 Wirbeln (Abbildung 2c).
  6. Mit beliebige Kombination aus einer Skalpellklinge, Wattestäbchen, und / oder Knochenschaber, entfernen Sie alle darüber liegenden Gewebe aus dem dorsalen Schichten (2D).
  7. Mit OP-Schere, schneiden Sie vorsichtig entfernt Sehnen an die Wirbel auf beiden latera befestigtl Kanten der Wirbelsäule (2E).
  8. Verwendung des Skalpells, sanft zu entfernen, wie viel Gewebe von den Seitenkanten der Wirbelsäule wie möglich sein, um eine saubere Klemmfläche vorzusehen.
  9. Debridement vorsichtig die Wirbel der Verwendung eines Knochenschaber und / oder Wattestäbchen das verbleibende Weichgewebe. Schneiden Sie jede unpassende Gewebe an anderer Stelle mit chirurgische Scheren (2F).
    HINWEIS: Es ist wichtig, sowohl für Spann- und Durchführung der dorsalen Laminektomie, dass die Wirbel sind sauber ausgesetzt. Ein Ausbrenner kann nützlich bei der Kontrolle der anschließenden Blutungen.
  10. Umschalt Retraktoren, die rund um die Wirbelsäule zusätzlich zu der Haut (2F) Gewebe zurückhalten.
  11. Bringen Sie die Implantatseitenstege zu den Zinken auf den Lieferposten und laden Sie diese in den post-Inhaber (wie in Abbildung 1E).
  12. Klemmen Sie die drei Wirbelkörper mit den Seitenleisten, die Anwendung gerade genug Druck, um securel halteny (2G, H). Verwenden einer Pinzette, um sicherzustellen, ein Niveau Klemmung der drei Wirbel. Man beachte, dass mehrere Versuche notwendig sein. Stellen Sie sicher, dass die Seitengitter sind beide Ebene und parallel vor der Durchführung der Laminektomie.
  13. Sorgfältig reinigen und trocknen Sie die Rückenfläche des eingespannten Wirbel mit Wattestäbchen.

4. Führen Sie eine dorsale Laminektomie

  1. Stecken Sie die Spitzen der Vannas Schere in den Epiduralraum des medialen Wirbel eingespannten und drücken Sie die Griffe leicht; wenn der Knochen trocken ist, sollte es über die Länge der Rücken Lamina knacken. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der Gegenseite, die Lamina zu lösen.
  2. Gently Greifen der losen Lamina von der dorsalen Verfahren mit einer Pinzette vorsichtig schneiden Sie jede Bindegewebe an den rostralen und kaudalen Enden der Lamelle und ziehen Sie es.
  3. Mit 0,9% Salzlösung und / oder künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), gründlich abzuwaschen Blut overlying das Rückenmark. Verwenden Sie Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren.
  4. Mit Vannas Schere vorsichtig schneiden Sie die seitlichen Ränder der Knochen zurück in den Seitenholmen des Implantats. Auch abzuwaschen und zu kontrollieren Blutungen mit Wattestäbchen und Kochsalzlösung / ACSF.
  5. Für den Fall, dass ein Teil der Knochenhaut hat abgenommen und liegt über dem Rückenmark, entfernen Sie dieses Gewebe unter Verwendung von Wattestäbchen und / oder eine 29 bis 30 G-Nadel. Achten Sie darauf, in diesem Teil des Verfahrens zu verletzen das Rückenmark. Verwechseln Sie nicht die losen Knochenhaut mit dem fest eingewickelt Dura mater.
  6. Vorsichtig Abdichtung der verbleibenden freiliegenden Kanten des Knochens mit einem oder beiden der Dentalacryl und Cyanoacrylat (2I). Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zuzulassen, die Klebstoffe an auf die freigelegte Rückenmark fließt.

5. Verschließen Sie die Kammer

  1. Positionieren Sie die obere Platte vorsichtig, so dass die 4 Steckplätze eine Linie mit den 4 Löchern an den Seitenleisten und die Öffnung über der freiliegenden Spinal Kabel (Abbildung 1B und 2J).
  2. Mit der Juwelier-Schraubendreher vorsichtig starten Sie die erste Schraube, die Stabilisierung der Schaft des Schraubendrehers mit einer anderen Pinzette. Die Schraube in dieser Phase nicht festziehen, aber setzen Sie sie, so dass die ersten Gewindegänge im Eingriff sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen 3 Schrauben.
    HINWEIS: Es ist sinnvoll, Titan oder anderen nicht magnetisierbaren Pinzette verwenden, um Position zu diesem Zeitpunkt helfen, die Schrauben.
  3. Bei allen vier Schrauben fest, Jede Schraube abwechselnd um den gleichen Betrag in kleinen Schritten, bis alle Schrauben fest gesichert (Abbildung 2K). Beachten Sie, dass es nicht ungewöhnlich, dass die obere Platte, die während dieses Prozesses zu biegen. Achten Sie darauf, die Schrauben nicht zu fest an, da der Schraubenkopf kann brechen und übermäßiger Druck nach unten wird die Klemme lösen und / oder zu Verletzungen des Rückenmarks.
  4. Verwenden ein Silikonelastomer, den Raum zwischen dem Rückenmark und dem Glasfenster zu füllen. Weil es does nicht Essigsäure bei der Aushärtung zu erzeugen, verwenden Sie KwikSil Marke Elastomer und Mischkanülen. Eine großzügige Teil der Silikon auf die freigelegte Rückenmark. Achten Sie darauf, loszuwerden, jede silikonhaltige Luftblasen aus der Mischspitze vor dem Aufbringen auf das Rückenmark zu bekommen.
  5. Arbeiten schnell, drücken Sie vorsichtig eine 5 mm # 0 Deckglas in den Einsatz in der oberen Platte. Genügend Druck allmählich zusammendrücken flüssiges Elastomer umgibt das Rückenmark, aber nicht im Rückenmarkkompression (2L) führen. Einstellzeit für das Elastomer ist ca. 90 Sekunden, so stellen Sie sicher, dass das Deckglas wird rasch vorgenommen.
  6. Im Falle einer fehlgeschlagenen Versiegelung, warten Sie, bis das Elastomer ausgehärtet ist, entfernen Sie sie aus dem Implantat mit einer Pinzette und wiederholen 5,4-5,5.
  7. Bedecken die Ränder exsudierter Elastomers mit Dentalacryl / Cyanacrylat und sich an den umgebenden Knochen, so viel wie möglich, um das Elastomer von der Verschiebung auf der Oberfläche des Rückenmarks zu verhindern.
  8. Wundhaken entfernen und ziehen Sie die Haut rund um den Rand des Implantats. Mit Sekunden haften die Haut bis zu den Rändern des Implantats (2M, N).
  9. Legen # 0-80 - 1/4 "Gewindestifte in die Flügel der oberen Platte (1C und 2 O).
  10. Mit Zahn Acryl, verschließen Lücken in den Schraubenöffnungen der oberen Platte (Abbildung 2P).

6. Postoperative Behandlung

  1. Entfernen Tier aus der Narkose und in einen großen Käfig sauber. Sicherzustellen, daß der Käfig ausreichend groß ist, dass die Kammer nicht auf irgendetwas hängen bleiben (wie die V-förmigen Tauch für eine Wasserflasche und / oder Lebensmitteln), während des Verlaufs der normalen Fortbewegung der ganzen Käfig.
    ANMERKUNG: Eine Standard-Rattenkäfig ist ideal.
  2. Setzen Sie den Käfig auf einer erhitzten Oberfläche, während das Tier erholt. Sie nicht die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis er sich vollständig erholt hat.
  3. Überprüfen Tier behaVior in 1 - 2 Stunden nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden und Implantatintegrität.
    HINWEIS: Unter normalen Bedingungen sollte das Tier in der Lage, mit geringen Störungen auf die Bewegung ambulate sein.
  4. Weiter zur Tier alle 8 überprüfen - 12 Stunden für die ersten 72 Stunden, Messgewicht und Überwachungsverhalten. Überprüfen Sie, ob die Tiere aktiv und mobil in der Nacht sind. Feuchtnahrung in Form von Boden Chow mit Wasser oder Nahrungs Gele, Futter-Pellets vermischt und Trinkwasser sollte in Bodennähe zur Verfügung gestellt werden. Zusätzliche Flüssigkeitszufuhr durch subkutane oder intraperitonealen Injektionen sollte bei Bedarf zur Verfügung gestellt werden.
  5. Verabreichen 5 mg / kg Maus Ketoprofen und 0,2 mg / kg Dexamethason subkutan Maus 24 und 48 h Zeitpunkte, postoperativ. Zusätzlich sollte 0,005-0,010 mg / 100 g Maus alle 8 h durch subkutane Injektion von 72 h verabreicht werden.

7. In Vivo Imaging

  1. Anesthetize eine Maus unter5% Isofluran / Sauerstoff in einer Induktionskammer, bis die Atemfrequenz verlangsamt, um ca. 1 Atemzug / sec.
  2. Übertragen der Maus auf die benutzerdefinierte stereotax (1D) mit Rückkopplung gesteuert Heizkissen und legen Rektalthermometer. Reduzieren Isofluran bis 2%.
  3. Verabreichen Glycopyrrolat 0,05 mg / 100 g Maus intramuskulär in den Hinterbeinen mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 ml-Spritze und liefert etwa 50% des Einspritzvolumen pro Schenkel.
  4. Verabreichen 1 ml / 100 g Maus 5% Glucose (zur Hydratation) subkutan in Salz einmal pro Stunde.
  5. Setzen Sie die Gewindekammer Inhaber in die post-Halter für die Chirurgie (1F) verwendet. Stellen Sie die Höhe und drehen Sie die Beiträge auf die Gewindestifte in der oberen Platte.
  6. Mit befestigt beide Halter, erhöhen Sie die Halterungen in den post-Inhaber, bis die Brust frei nach Inspiration zu erweitern.
    HINWEIS: Sowohl die feste Anbringung der Halterungen und die freie Ausdehnung der Brust significantly Reduzierung von Bewegungsartefakten aufgrund der Atmung.
  7. Führen Bildgebung, wie gewünscht.
  8. Wenn Imaging abgeschlossen ist, niedrigere Beiträge, abdrehen Kammer Halter entfernen rektale Thermometer und Ort der Maus auf einer erhitzten Oberfläche zu erholen. Sie nicht die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis er sich vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Nach dem Verfahren oben, sollte jede Stufe der Operation die Ergebnisse für die einzelnen Phasen der Operation in Abbildung 2 skizziert imitieren. Besondere Vorsicht ist bei der Anwendung der Silikonelastomer, um Luftblasen unter dem Glas zu beseitigen genommen werden oder zumindest sicherzustellen, dass sie an der Peripherie des Gebietes von Interesse (2L) befindet. Für einen erfahrenen Chirurgen, chirurgische Komplikationen Euthanasie erfordern entweder während der Operation oder innerhalb der ersten 24 Stunden nach dem Eingriff auftreten, in etwa 20% der Operationen. Diese Komplikationen am häufigsten sind eine übermäßige Weichgewebe Blutungen oder Misserfolg sicher zu befestigen die Kammer an der Wirbelsäule.

In erfolgreich implantiert Kammern, bleibt das Fenster in der Regel optisch transparent für mehrere Wochen (Abbildung 3). Trotz aller Bemühungen, bildet eine opake, faserig, neoplastisches Wachstum häufig innerhalb weniger Tage, was zu einer teilweisen obscuring des Fensters (3C - F, schwarz gestrichelte Linie). Leuchtstoffstrukturen sind schwierig zu sehen, mit 2PEF Mikroskopie unter diesem Bindegewebe. Wir finden eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, mit ca. 50% der erfolgreich implantiert Fenster übrigen klar für mehr als 5 Wochen nach der Operation, und ca. 50% immer auf 1 verschleierten - 3 Wochen. Für Fenster, die klar, die meisten Orte im Sichtfenster Erfahrung nur ein bescheidenes Maß an Neovaskularisation in oder über der Dura (Abbildung 3D - F, grün Sternchen) bleiben, die 2PEF Bildgebung nicht behindert. Unsere früheren Studie 30 zeigten einen Anstieg der Mikroglia aber nicht Astrozyten Dichte unter dem Fenster und benachbarten Wirbeln, was einer leichten Entzündung analog der in Hirn Fenster Zubereitungen 5 ersichtlich.

In transgenen Mäusen, gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bei einem Teil der dorsalen Wurzel gangl exprimierendenia (DRG) Neuronen (YFPH Leitung; Jackson Labs) wurden Axone deutlich unterscheidbar Wochen postoperativ (4A und B) und, sofern vier Monate in einem Tier (Daten nicht gezeigt). Blutgefäße (4A und B) wurden durch retroorbital Injizieren fluoreszierenden Texas Rot sichtbar gemacht markiertem Dextran in das Blutplasma. Mikroglia wurden auch bei Mäusen, die GFP in einem CX3CR1 knock-in Maus sichtbar gemacht (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) ging zum YFPH Linie (4C). Kontrast und die Auflösung verschlechtert geringfügig über die Zeit (4C) durch die Bildung eines vorher 30 beschriebenen faserigen Wucherung. Wir routinemäßig für 3 Stunden in einer einzigen Sitzung ohne Mortalität jeder 12 Stunden abgebildet und so oft. Sitzungsdauer und Frequenz wird durch die Toleranz der Tiere zur Narkoseeinleitung, gleichzeitig mit der begleitenden Schmerzen und Leiden zu Versuchstieren ethischen Überlegungen begrenzt.

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Abbildung 1. Eine kundenspezifische OP-Bereich erleichtert Kammer Lieferung während der Implantation und stabilisiert die Kammer bei der anschließenden Imaging-Sitzungen. Zwei Seiten-Bars und eine obere Platte (A) zusammengesetzt werden (B) mit kleinen Schrauben in den Wirbelkammer (C). Ein Operationstisch mit ausziehbaren Stützen (D) ermöglicht die Lieferung und Spannen der Seitenschienen an den Wirbeln mittels Haltezapfen (E). Nachfolgende Imaging-Sitzungen statt dessen Innengewinde Beiträge an die Kammer über die Stellschrauben auf den Schwingen des Implantats (F) zu befestigen. Steuerung b dieser Zahl hat sich von Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 mit Genehmigung der Nature Publishing Group geändert.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2. Eine dorsale Laminektomie durchgeführt, und eine chronische Abbildungskammer implantiert ist, um einen optischen Zugang zum Rückenmark bereitzustellen. Das Verfahren ist in der Montage beschrieben. Zunächst wird die Haut (Platten A, B; Protokoll Schnitte von 3,1 bis 3,4) und Muskeln (C; 3,5) zurückgezogen, um die drei zugrunde liegenden Wirbel aus. Die darüberliegende diese drei Wirbel Gewebe entfernt (D, E, F; 3,6-3,10) und die Seitenfort abgeschabt zu reinigen, bevor sie sich auf beiden Seiten (G, H; 3,12) eingeklemmt sind. Vorsichtig ist der dorsale Lamina des zentralen Wirbel entfernt und die Kanten des Knochen abgedichtet (I (J; 5.1) und Schrauben in Position (K; 5,3) befestigt sind, um die Kammer vor dem Abdichten der Kammer mit Silikonelastomer und Deckglas (L; 5.5) sichern. Nachdem die Lieferung Stifte entfernt (M; 5,8) wird die Haut an den Seiten der Kammer geklebt (M, N; 5,8) und die Schrauben in den Flügeln (O; 5.9) eingefügt. Schließlich werden die Schraubenschlitze mit Zahn Acryl versiegelt (P; 5,10). Und die Maus in einem sauberen Käfig zu erholen platziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 3. Eine chronische Rückenkammer bleibt optisch transparenten over mehrere Wochen. Weißlichtbilder des Rückenmarks, im Bereich von einigen Minuten (A) bis drei Wochen nach der Operation (F). Vascular Sehenswürdigkeiten identifizierbar zu allen Zeitpunkten (gelbe Pfeile). Wenig Veränderung ist auf einen Tag nach dem Eingriff (B) zu sehen. Dichte Faserüberwucherung (C - F, durch die gestrichelte Linie auf der unteren rechten begrenzt) vorhanden ist schon drei Tage und führt zu einer teilweisen Verdunkelung der Bildfläche. Mild Neovaskularisation (D, E, F, grün Sternchen) ist auch vorhanden, aber nicht darüber hinwegtäuschen, ursprüngliche Gefäßsystem in weißes Licht oder 2PEF Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 4. Eine chronische Rückenkammer ermöglicht wiederholte Mehrphotonen Bildgebung ohne die Notwendigkeit wiederholter Operationen. wiederholte Abbildung von transgenen Mäusen, die YFP in einer Untergruppe von DRG Axone (grün) in die dorsale funiculi des Rücken Schnur und Gefäßen (rot) durch intravaskuläre Injektion Farbstoff (A, B) markiert. Die Aktivität von Mikroglia (lila) kann auch im Laufe der Zeit in Thy1-YFP / CX3CR1-GFP doppelt transgenen Mäusen (C) verfolgt werden. Während Axonen und Mikroglia sichtbar bleiben, Kontrast und Auflösung Rückgang bescheiden im Laufe der Zeit (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Diskussion

Die Technik hier gezeigt ermöglicht wiederholt, Zeitraffer, in vivo-Bildgebung des Rücken Maus SC aus, um viele Wochen nach der Operation ohne die Notwendigkeit für eine nachfolgende chirurgische Eingriffe. Dieses Verfahren stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber wiederholter Chirurgie Imaging-Studien oder über portmortem histologischen Ansätzen, bei denen Informationen über zelluläre Dynamik verloren. Wir haben zuvor gezeigt, 30 den Wert dieser Technik zur Untersuchung SCI Pathologie in vivo.

Die maximale Längserstreckung der Bildgebung durch das Wachstum einer dichten, faseriges Gewebe über die dorsale Oberfläche des SC bestimmt. Im Laufe der Zeit ergab sich dieses Wachstum in dem Verlust von Bildkontrast und die Auflösung. Dieses Wachstum wurde auch in alternative chirurgische Präparate 31 gesehen. Gerüchten zufolge wir durch vorsichtiges Waschen des dorsalen SC Oberfläche zu Blutprodukten zu entfernen, Abdichtung der Oberfläche beobachtet haben, dass dieses Wachstum minimiert werden kannder geschnittene Knochen mit Cyanoacrylat Dichtkanten der Kammer gut mit Silikonelastomer und den Zwischenraum zwischen der Rücken SC und dem Deckglas minimieren.

Vor kurzem ein anderer Ansatz ähnlich wie unsere eigene mit einem Polycarbonat Kammer hat sich gezeigt, 32. Die Verwendung von Polycarbonat ist vorteilhaft, da sie mit der X-ray und akustische Bildgebungsverfahren, das nicht der Fall ist für unsere Edelstahlteile kompatibel ist. Doch mit der heute allgegenwärtigen Technologie der 3D-Drucker, Kammerteile können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, um speziellen Anforderungen entsprechen. Vor kurzem haben wir eine klare Photopolymer gedruckt allen Teilen.

Ein wesentlicher Nachteil einer geschlossenen Kammer ist die Unfähigkeit, wiederholte Dosierungen von Medikamenten oder exogene Farbstoffe geeignet für SC-Bildgebung 34 zu verabreichen. Jedoch durch Nutzung der mechanischen Stabilität unserem gegenwärtigen System haben wir bereits unsere Gegenwart Kammer zur erfolgreichen verwendetlich verankern einen intrathekalen Katheter an eine subkutan implantierte Injektionsöffnung verbunden, die für die Arzneimittelabgabe auch in einer geschlossenen Kammer Systems (unveröffentlichte Arbeit) erlaubt zu mehreren Zeitpunkten. Außerdem ist es aufgrund des modularen Aufbaus der oberen Platte werden zukünftige Versionen dieser Zubereitung enthalten eine wiederverschließbare Kammer für wiederholte Anwendung von sowohl therapeutischen Mittel und fluoreszierende Markierungen ermöglichen. Es ist auch möglich, die oberen Platten mit Aufnahmen zur Aufnahme von Elektroden, optische Einsätze und Ports für die Arzneimittelabgabe vorstellen. Solche Zusätze wäre wahrscheinlich schwieriger zu implementieren mit dem minimalistischer System Fenrich et al. 31. Abschließend bietet unseren Kammer ein Gateway Plattform, auf der diverse Experimente basieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen und keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Joseph R. Fetcho für seinen Beitrag während der Entwicklung des Verfahrens. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch die US National Institutes of Health (R01 EB002019 zu C.B.S und DP OD006411 an Joseph R. Fetcho) und den National Science and Research Council of Canada (an M.J.F.).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vannas SchereFine Science Tools15000-04
Pinzette, Schere, Skalpell, etc.Fine Science Toolsmehrfach 
Retraktor-Kit - magnetischer FixateurFine Science Tools18200-02
Retractor-Kit - RetraktorFine Science Tools18200-09andere Retraktoren können ebenfalls verwendet werden
Retractor-Kit - ElastomerFine Science Tools18200-07
Heizdecke mit RückkopplungCWE Inc.Modell: TC-1000 Maus                         Part No. 08-13000
stereotaxsiehe Farrar et al., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinalchamber see Farrar et al., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Wirbelsäulenkammerhaltersiehe Farrar et al., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanacrylat-KleberLoctiteLoctite 495mehrfach Lieferanten
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)TeetsMfg. Teil: 8101mehrere Lieferanten
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)TeetsMfg. Teil: 8501mehrere Lieferanten
GlycopyrrolatMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG5767
BupivacaineMWI Veterinary SupplyMWI Artikelnummer: 029841 (Hospira 116301)
KetoprofenMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
DexamethasonMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
KwikSil MischkanülenWorld Precision Inc.KWIKMIX

Referenzen

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