Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten In-vitro-

Summary

Diese Methode demonstriert eine Technik zur Beurteilung der Granulozytenfunktion durch gleichzeitige Messung der Phagozytose von Bakterien und des oxidativen Ausbruchs. Die bildbasierte Durchflusszytometrie ermöglichte die Identifizierung von drei verschiedenen Untergruppen aktivierter Granulozyten, die sich alle in ihrer relativen Funktionsfähigkeit unterschieden.

Abstract

Granulozyten spielen eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunantwort des Körpers auf bakterielle und virale Infektionen. Es gibt zwar Methoden, um die Funktion von Granulozyten zu messen, aber im Allgemeinen sind diese in Bezug auf die Informationen, die sie liefern können, begrenzt. Zum Beispiel liefern die meisten bestehenden Assays lediglich einen Prozentsatz der Anzahl der Granulozyten, die nach einer einzigen Inkubation mit fester Länge aktiviert werden. Erschwerend kommt hinzu, dass sich die meisten Assays aufgrund von Einschränkungen in der Nachweistechnologie nur auf einen Funktionsaspekt konzentrieren. Dieser Bericht demonstriert eine Technik zur gleichzeitigen Messung der Granulozytenphagozytose von Bakterien und des oxidativen Bursts. Durch die gleichzeitige Messung dieser beiden Funktionen wurden drei einzigartige Phänotypen aktivierter Granulozyten identifiziert: 1) Niedrige Aktivierung (minimale Phagozytose, kein oxidativer Burst), 2) Moderate Aktivierung (moderate Phagozytose, ein gewisser oxidativer Burst, aber keine Kolokalisation der beiden funktionellen Ereignisse) und 3) Hohe Aktivierung (hohe Phagozytose, hoher oxidativer Burst, Co-Lokalisation von Phagozytose und oxidativer Burst). Eine vierte Population, die aus inaktivierten Granulozyten bestand, wurde ebenfalls identifiziert. Unter Verwendung von Assay-Inkubationen von 10, 20 und 40 Minuten wurde der Effekt der Assay-Inkubationsdauer auf die Reverteilung der aktivierten Granulozyten-Phänotypen untersucht. Eine vierte Inkubation wurde als Kontrolle auf Eis durchgeführt. Durch die Verwendung von seriellen Zeitinkubationen kann der Assay möglicherweise nachweisen, wie sich eine Behandlung räumlich auf die Granulozytenfunktion auswirkt. Alle Proben wurden mit einem bildbasierten Durchflusszytometer gemessen, das mit einer quantitativen Bildgebungsoption (QI), einem Autosampler und mehreren Lasern (488, 642 und 785 nm) ausgestattet war.

Introduction

Granulozyten stellen einen Bestandteil des körpereigenen angeborenen Immunsystems, die die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Antigene zur Verfügung stellt. Frühere Verfahren zur Beurteilung Granulozytenfunktion fokussiert auf die Phagozytose Kapazität oder oxidativen Burst mit separaten Methoden, so dass es schwierig ist, festzustellen, wie kollektiv Granulozyten ^1-4 verändert. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflußzytometrie in der Herstellung von Tischgeräten in der Lage, hochauflösende, Mehrfarbenbilder von Zellen in einem Hochdurch Weise ⁵ geführt. Die Fähigkeit zur Bildgebung mit traditionellen Flow kombinieren Zytometrie stellt eine Weiterentwicklung, die die technologische Plattform benötigt, um im Rahmen der bestehenden Flusszytometrie Methoden innovativ und extrahieren Sie neue Informationen über das Immunsystem bietet.

In den letzten zehn Jahren hat unser Labor unter anderem stark von der Wirkung von verschiedenen Ernährungs- und Bewegungs Behandlungen Patte fokussiertrns auf angeborene Immunfunktion ^6-9. Die in dieser Handschrift zeigte Methode hat praktische Auswirkungen im Bereich der klinischen Immunologie. Das vorliegende Verfahren nutzt die Leistung von bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose von Bakterien und Partikeln oxidativen Burst. Mit dieser Vorgehensweise ist man in der Lage aktivierten Granulozyten mit Variablen durch die bildbasierte Teil der Analyse bereitgestellt trennen. Diese Teilmengen nur erkennbar, nachdem die Beurteilung der Zellbilder auf den einzelnen Granulozyten. Weitere Assays Inkubationszeit betroffen den Übergang zwischen den drei Untergruppen Aktivierungs ^10. Somit ist es plausibel, dass die Verwendung von mehreren Inkubationszeiten erlauben ein Verfahren, um die Änderung in Granulozytenfunktion nach einem spezifischen experimentellen Behandlung zu testen. Der Zweck dieses Manuskripts wurde die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung Granulozytenfunktion mithilfe bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose mit oxidat demonstrierenive platzen.

Protocol

HINWEIS: Alle in dieser Methode beschriebenen Blutentnahmeverfahren wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der UNT Institutional Review Board (IRB) für den Menschen zugelassen. Alle Probanden gaben schriftliche Zustimmung für die Blutentnahme, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wurde, um sicherzustellen, dass sie scheinbar gesunden, normalen Körpergewicht und frei von Krankheiten.

1. Reagenz Source & Vorbereitung

1. Verwendung CD66b-APC (Klon # G10F5; DF = 1: 50) und CD45-APCeFluor780 (Klon # 2D1, DF = 1: 50) für diesen Test.
   HINWEIS: Vor der Studie, CD45 und CD66b-Antikörper wurden titriert, um die optimale Verdünnung zu bestimmen, die klar aufgelöst Granulozyten (CD45 + / + 66b) von anderen Leukozyten (CD45 + / 66b-) ^11. Nach Zugabe der verdünnten Antikörper zur Anfärbung der Endverdünnung im Rohr 875.
2. Kauf und auftauen Lager S. aureus Biopartikeln mit pHrodo roten Farbstoff markiert. Auszusetzen bei einer Konzentration von 1 mg Biopartikeln pro ml in sterilem PBS. Aliquoten verdünnten Biopartikeln und bei -20 ° C eingefroren, bis in dem Assay verwendet.
3. Löse Dihydroethidium (DHE), der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid in Gegenwart von Sauerstoff-freien Radikalen (dh die oxidative burst) in einer Endkonzentration von 10 g / ml überführt wird, in DMSO.
4. Mischungs N-Ethylmaleimid (zur zusätzlichen Phagozytose folgenden angegebenen Assay Inkubationsdauer zu verhindern) mit steriler PBS in einer 2-Schritt-Verdünnung von 200 mg / ml und 17,5 mg / ml. In dem Assay verwendet eine Endkonzentration von 15 mM. Beim Auftauen N-Ethylmaleimid, mit einem 37 ° C-Heizblock, da die N-Ethylmaleimid nicht in Lösung bleiben.
5. Nach dem Schlussfixierungsschritt verwenden 7AAD zu Kern-DNA zu färben. Vor der Zugabe verdünnter Lager 7AAD 1:10 mit sterilem PBS.

2. Blutentnahme

1. Fragen Sie Themen, die im Labor nach einer O / N schnell (> 8 Std) und abstenti ankommenauf von der körperlichen Aktivität (> 12 h).
2. Nach der Reinigung der Haut mit einem Alkoholtupfer, legen Sie eine sterile Blutentnahme Nadel in eine periphere Armvene.
3. Sammeln Blut in Vakuumröhren, die im Handel mit Heparin-Natrium gefüllt sind.
4. Nach der Sammlung, ein steriles Heftpflaster auf die Patienten Arm.
5. Invertieren Blutröhrchen zu 10 mal zu mischen und dann auf einem Schüttler, bis die Analyse zu platzieren.

3. Phagozytose Assay-Technik

1. Auftau S.aureus Biopartikel (RT), DHE (RT) und N-Ethylmaleimid (37 ° C).
2. In 20 l S.aureus Biopartikeln zu 4 Einzel 1,2-ml-Röhrchen, während der Arbeit in der sterilen Haube.
3. In 40 l DHE in jedes Röhrchen, das die Biopartikeln.
4. Klopfen Sie leicht die Rohre auf der Tischfläche, die Reagenzien in den Boden des Röhrchens zu sammeln.
5. 100 L mischten Vollbluts in jedes Röhrchen, die mit Biopartikeln und DHE gefüllt worden ist.
6. Wischen Sie die Innenkante der Rohre mit einem Wattestäbchen, um jede verunreinigende Blut zu entfernen.
7. Mischen Sie das Blut und Reagenzien mit einer elektronischen Pipette eingestellt, um das Blut und Reagenzien für die drei Zyklen nach der Blut hinaus mischen.
8. Zeigen Teströhrchen in einem Eiskübel und decken den Inhalt vor Licht zu schützen.
9. Assayröhrchen für 10, 20 und 40 min inkubiert. Beginnen Sie mit dem 40-Minuten-Rohr, um sicherzustellen, alle Teströhrchen beenden zugleich.
10. Thaw N-Ethylmaleimid in 37ºC Perle Bad.
11. Pipette 15 l N-Ethylmaleimid (vorstehend in 1.4 beschrieben) in jedem Teströhrchen, inkubiere für 30 min.
12. Pipettieren Sie 10 l CD66b-APC und 10 l CD45-Antikörper APCeFluor780 verdünnt (siehe oben unter 1.1 beschrieben), 60 min.
13. Pipettieren Sie 750 L der WBC fix / RBC Lyse-Lösung in jedem Teströhrchen, Inkubation 60 min.
14. Zentrifuge (10 min bei 400 · g) Teströhrchen, um das Zellpellet zu sammeln.
15. Vakuum absaugen WBC Lyse / RBC Fixier-Lösung, so dass ein Rest fluid Volumen (100 L) über dem Zellpellet.
16. Pipettieren Sie 10 l verdünnt 7AAD-Lösung (oben in 1.5 beschrieben) und 50 l PBS in jedem Teströhrchen.
17. Einen Tropfen Kalibrierung Perlen (~ 25 L) zu jedem Teströhrchen, Ort Kappen auf Teströhrchen, Wickelrohre in Folie und Platz im Kühlschrank.
18. Laden Sie das Probenröhrchen in die bildbasierte Durchflusszytometer und sammeln ein Minimum von 3.000 Granulozyten Ereignisse mit vordefinierten Parametern: Autosampler, Blau (488 nm, 60 mW), Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) Laser (Abbildung 1).

Abbildung 1. Acquisition Method & Template. Die Proben wurden auf einer bildbasierten Durchflusszytometer (A) erworben. Während der Akquisition wurden Dot-Plots von Hellfeld Seitenverhältnis gegen CD66b-APC getrennt Granulozyten aus Stachel Kalibrierung Perlen usin erzeugt100.2.292.0 Software (B) g INSPIRE v.. , Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm, 8,5 mW) Laser, ein Minimum von 5.000 Granulozyten wurden für jeweils Proben mit einem Autosampler, blau (60 mW 488 nm) erworben. Bitte beachten Sie, dass eine Reihe von Histogrammen bei der Erfassung der Lasereinstellungen und andere Aspekte der Datenerfassung überwachen vorhanden sind. Alle diese Histogramme sind optional und nur erforderlich, wenn die Laborstandardverfahren verlangt, dass sie die Qualitätskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4. Probenerfassung und -analyse

1. Verwenden Sie die automatische Softwarekompensation Assistent des IDEAS-Software, um eine Kompensationsmatrix, um Raw-Bilddateien (RIF) anwenden und erstellen kompensieren abgebildeten Dateien (CIF).
2. Laden einzelnen CIF-Dateien in IDEAS-Software und die folgende Grundstücke, die Granulozyten-Untergruppen zu identifizieren:
Stellen Anfangs Tore, um die Zellen, die berücksichtigt wurden mit Hilfe eines Histogramms für Hellfeld Gradienten RMS (2A) im Fokus sein zu identifizieren. Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard.
3. Verwenden Sie sekundäre Grundstücke zu trennen Singulett-Zellen aus Schutt und Dubletten mit einem Punktediagramm der Hellfeld-Aspektverhältnis (Verhältnis von Zellenhöhe vs. Breite) vs. Hellfeldbereich (2B). Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard.
4. Sobald eine saubere Population von Zellen identifiziert worden waren, stellen Sie eine Dot-Plot von CD45 gegen CD66b (2C), um positiv zu identifizieren Granulozyten (CD45 + / 66b +). Erstellen Sie eine Tochter Plot (Abbildung 3) von hellen Detail Intensität für S. aureus (x-Achse) vs. hellen Detail Intensität für oxidativen Burst (DHE, y-Achse), um Untergruppen von aktivierten Granulozyten identifiziert. Sammeln bright Feldbilder in Kanal 1 und 9, Biopartikeln in Kanal 2, DHE in Channel 4, Channel 5 in 7AAD, CD66b in Kanal 11 und CD45 in Kanal 12.

Abbildung 2. Analysevorlage. Diese Zahl die Reihe der Grundstücke, die erzeugt wurden, um Zellen, die im Blickpunkt (A) wurden identifiziert, Einzelzellen (B), Granulozyten (C). Zusätzliche Flächen wurden verwendet, um die drei Teilmengen von aktivierten Granulozyten vs. inaktiven Granulozyten identifiziert. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Results

Verwendung bildbasierten Durchflusszytometrie uns erlaubt, eine homogene Population von aktivierten Granulozyten in drei verschiedene Untergruppen der Aktivierung (Figur 3) zu trennen. Bei diesem Verfahren wird der wirksamste Weg, um die drei Aktivierungsmengen zu lösen, ist durch Auftragen hellen Detail Intensität für Phagozytose (S. aureus) gegen oxidativen Burst (DHE) (Figur 3; Figur 4). Auch wird die Verwendung des Co-Lokalisation Assistenten in IDEAS-Software für die Quantifizierung der Anwesenheit von gleichzeitigen Phagozytose und oxidativen Burst, die ein Markenzeichen Zeichen der hoch aktivierten Granulozyten ist erlaubt.

Abbildung 3. Bezeichnung des Aktiv Granulozyten-Subsets. Nach der Identifizierung von Granulozyten mit Zelloberflächenmarker (CD45 + / 66b +), eine Tochter Grundstück wurde mit hellen ausführlich inten erzeugtVielfalt für die Phagozytose vs. hell Detail Intensität für oxidativen Burst. Mit diesem Ansatz Anteil der inaktiven (lila), low-aktiv (rot, A), mittel-aktiv (blau, B) und high-aktiv (gelb, C) Granulozyten bestimmt. Dieses Gating-Technik wurde auch verwendet, um die Wirkung der Test Inkubationszeit auf die relative Menge der verschiedenen aktivierten Granulocyten Untergruppen auszuwerten. Der höchste Prozentsatz von "high-aktiv" Granulozyten vorhanden war, nach der 40-minütigen Inkubation. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Neben dem Nachweis der Anwesenheit von drei unterschiedlichen Teilmengen von aktivierten Granulozyten, wurde demonstriert, dass das Assay Inkubationszeit beeinflusst die relative Häufigkeit jeder aktivierten Granulozyten Subset. Insbesondere wird das 40 min incubation führte zur größten Anteil der "high-aktiv" Granulozyten. Von denen mindestens drei Assay Inkubation Dauern kann es möglich sein, zu bestimmen, wie ein bestimmter klinischer Behandlung ändert die zeitliche Aktivierungsstatus von Granulozyten. Dies ist der erste veröffentlichte Verfahren unter Verwendung der bildbasierten Durchflusszytometrie an verschiedene aktivierte Granulozyten Teilmengen in Abhängigkeit von gleichzeitigen Messungen der Phagozytose und die oxidative Burst identifizieren.

Abbildung 4. Repräsentative Bilder von Cellular Markers. Eine Fotogalerie von Zellen als high-aktiv (A) klassifiziert, moderate aktiven (B) und low-aktiv (C) ist in dieser Figur dargestellt. S.aureus Biopartikeln sind in CH03 ist oxidativen Burst in Ch04, 7AAD für den Kern in CH05, Seitenstreuung ist in Ch06, CD66b ist inCh11 und CD45 ist in Ch12. Es wird auch ein co-lokalisiert merge Bild der Phagozytose (CH03) gegen oxidativen Burst (Ch04) angezeigt. Gebiete gelb in der Zusammenführung Bild anzuzeigen, dass die Phagozytose und oxidativen Burst in der gleichen anatomischen Raum zur gleichen Zeit auftreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Das vorliegende Verfahren stellt eine Verfeinerung der bestehenden Methoden zur Bewertung der Granulozyten-Funktion mit Hilfe der Durchflusszytometrie ^1,3,4,12-14. Die kritischen Schritte des Assays sind in der Regel auf das richtige Mischen der Blutprobe mit den Biopartikeln und DHE hängen. Unvollständige Mischung wird zu ungenauen Ergebnissen führen. Während eine vollständige Durchmischung kritisch ist, sollte die Mischmethode sanftes Natur sein. Es wird vorgeschlagen, dass das Mischen unter Verwendung einer elektronischen Pipette mit einer Mischfunktion, anstatt einem Wirbelmischer durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt im Assay ist, immer sicher, dass kein Blut Verunreinigung der oberen Hälfte der Teströhrchen. Das Restblut kann mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt werden. Die vollständige Entfernung ist wichtig, weil dies versäumt, so kann die endgültige Testvorbereitung mit nicht lysierten roten Blutkörperchen verunreinigen.

Vor der Verwendung dieser Methode eine angemessene Entschädigung Kontrollen sollten hinzugefügt, um sp steuernectral Überlappung zwischen den verwendet, um die verschiedenen Aspekte der Granulozytenfunktion identifizieren Reagenzien. Für diese Methode Entschädigung Kontrollen umfassen sammeln Blutproben, die die 40 min Inkubation Assay vorgeschlagen haben und die Kennzeichnung mit einem einzigen Marker (dh E. coli, DHE, etc.). Nach der Markierung werden einzelne positive Ereignisse gesammelt und einer Kompensationsmatrix wird mit Hilfe eines automatisierten Assistenten in der IDEEN-Analyse-Software generiert. Es ist kritisch, dass, wenn dieser Test verwendet wird, geeignete Kompensationssteuerungen abgeschlossen sind, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten.

Die Analyse wird mit Hilfe der Funktion Finder und Co-Lokalisation Assistenten zu erkennen, dass helle Detail Intensität ist die beste Variable, um die Bevölkerung zu trennen und zu identifizieren, wie viel Überschneidung zwischen oxidativen Burst und Phagozytose Signale vorhanden erreicht. Insbesondere die Verwendung von bildbasierten Zytometrie vorgesehen die Fähigkeit aktivierten Granulozyten in drei Teilmengen zu trennen. Tseine Teilmenge Aufteilung wurde mit hellen Detail Intensität der Phagozytose gegen oxidativen Burst bestimmt. Neben der Untersuchung dieser singulären Zellfunktionen wurden die Zellen, die sowohl Veranstaltungen zur gleichen Zeit in der gleichen anatomischen Lage (Co-Lokalisation) zeigten identifiziert. Granulozyten, die in die "high-aktiv" Untergruppe fiel das einzige Phänotyp, die im Einklang Kolokalisation zwischen Phagozytose und oxidativen Burst demonstriert. Diese Identifizierung aktivierter Granulozyten-Untergruppen ist der größte Bereich, in dem Problembehandlung erforderlich ist. Es ist sehr wichtig für ein neuer Benutzer sich Zeit zu nehmen, um die Probe Prozess-Workflow in IDEAS zu verstehen und die Mechanik der Anschnitt die Zellpopulationen mit dem bildgebenden Komponente zu verstehen. Andere Änderungen, die ein Benutzer kann versuchen, zu machen sind die Auswahl der anderen oder einen zusätzlichen Test Inkubationszeiten. Das gegenwärtige Verfahren schlägt die Verwendung von Zeitdauern von 10-40 min; jedoch in Abhängigkeit von dem experimentellen Modell, wenn dieses Verfahrenverwendet werden soll, kann es notwendig mehr Assay Dauern auszuwählen. Eine solche Veränderung würde müssen individuell bewertet werden.

Ferner wurde bestimmt, daß die Dauer der Inkubation werden eine signifikante Wirkung auf das Aussehen der drei Untergruppen aktiviert. Die in diesem Bericht beschriebenen Ansatz stellt eine Erweiterung, welche Informationen bereits erhalten werden konnten bezüglich Granulozytenfunktion ^3,4,13,15. Andere Labors haben die Bedeutung der Beurteilung von Veränderungen in Granulozytenfunktion als Teil einer umfassenden Bewertung der Immunität und Krankheit ^{15 bis 17} gezeigt. Trotz des Potentials dieses Assays ist es nicht ohne Einschränkungen. Eine der Haupteinschränkungen mit hohem Probendurchsatz assoziiert Kosten und Zeitbedarf. Wenn ein Studiendesign erfordert eine große Anzahl von Proben in einem gegebenen Tag, können diese schwierig zu verarbeiten sein. Die Verarbeitung wird durch den Einsatz von elektronischen Pipetten und Dispenser gestrafft,aber diese neigen dazu, teuer zu sein und sind nicht notwendigerweise in jedem Labor.

Unsere Forschungsbereich konzentriert sich auf eine Studie, wie Bewegung und Ernährungsgewohnheiten beeinflussen die Gesundheit des Immunsystems und Funktion ^{6,8-10,18-20.} Diese Ziele haben signifikante praktische Bedeutung für eine Vielzahl von Bereichen der menschlichen Gesundheit. Über die Untersuchung der Bewegung und Futterverwertung der Phagozytose Verfahren in diesem Manuskript konnte gezeigt werden, die in anderen Bereichen der klinischen Immunologie, wo die Überwachung der Phagozytose Funktion ist entscheidend für die Behandlungsergebnisse. Die vorliegende Test ist der erste von vielen, dass immunologische Tests mit dem Potenzial, indem sie Vorteile der einzigartigen Bildinformationen, die von einer bildbasierten Durchflusszytometer werden können, können neu erfunden werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainer	BD Life Sciences		zur Blutentnahme
WBC Fixiermittel / Erythrozyten-Lyselösung	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience-Klon	G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience-Klon	2D1
S. aureus Biopartikel	Life Technologies	A10010
Dihydroethidium	Sigma-Aldrich	D7008
N-Ethylmalemid	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
Hämatologie-Analysator	Mindray	BC-3200
96-Kanal-Pipette	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Inkubator	LabArmour	BeadBath
Imaging Durchflusszytometer	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Software	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Software	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plate Sealer	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell-Computer	Verschiedene	für die IDEAS-Analyse verwendet