Wir beschreiben ein Mittel, um schnell und einfach die Lungendiffusionskapazität bei Mäusen zu messen und zu zeigen, dass sie ausreichend empfindlich auf Phänotypänderungen bei mehreren häufigen Lungenpathologien reagiert. Diese Metrik bringt somit eine direkte translationale Relevanz für die Mausmodelle, da die Diffusionskapazität auch beim Menschen leicht gemessen werden kann.
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Methodenartikel
Phänotypisierung Maus Lungenfunktion In-vivo- Mit der Lungendiffusionskapazität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Maus ist nun der primäre Tier zur Behandlung einer Vielzahl von Lungenkrankheiten zu modellieren. Um die Mechanismen, die solche Krankheiten zugrunde liegen, zu untersuchen, werden phänotypische Methoden benötigt, die pathologischen Veränderungen zu quantifizieren kann. Ferner, um eine Translations relevant Mausmodelle, sollten solche Messungen Tests, die leicht in Menschen und Mäusen durchgeführt werden kann. Leider ist in der vorliegenden Literatur einige phänotypische Messungen der Lungenfunktion haben die direkte Anwendung auf den Menschen. Eine Ausnahme ist die Diffusionskapazität für Kohlenmonoxid, das eine Messung, die routinemäßig in Menschen durchgeführt wird, ist. In diesem Bericht beschreiben wir ein Mittel, um schnell und einfach zu messen, diese Streukapazitäten bei Mäusen. Das Verfahren beinhaltet einen kurzen Lungeninflation mit Spürgase in anästhesierten Maus, gefolgt von einer 1-minütigen Gasanalysezeit. Wir haben die Fähigkeit dieses Verfahrens, mehrere Lungenerkrankungen, einschließlich Emphysem, Fibrose, akuter Lungenverletzung und Influenza und detektieren getestetPilz-Infektionen der Lunge, sowie die Überwachung Lungenreifung bei jungen Welpen. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme in allen Lungenerkrankungen, wie auch eine Erhöhung der Streukapazität bei Lungenreifung. Diese Messung der Lungendiffusionskapazität liefert somit eine Lungenfunktion, die eine breite Anwendung mit seiner Fähigkeit, phänotypische Strukturänderungen mit den meisten der vorhandenen pathologischen Lungen Modelle erfassen hat.
Einleitung
Die Maus ist nun der primäre Tier zur Behandlung einer Vielzahl von Lungenkrankheiten zu modellieren. Um die Mechanismen, die solche Krankheiten zugrunde liegen zu untersuchen, werden phänotypische Methoden benötigt, die es zu quantifizieren, können die pathologischen Veränderungen. Obwohl es viele Studien an Mäusen, wo Belüftungsmechanik gemessen werden, sind diese Messungen in der Regel nicht mit den Standarduntersuchungen zur Lungenfunktions normalerweise beim Menschen durchgeführt. Dies ist bedauerlich, da die Fähigkeit, gleichwertige Messungen bei Mäusen und menschlichen Probanden durchführen kann die Umsetzung der Ergebnisse in Mausmodellen für die menschliche Krankheit ermöglichen.
Eine der häufigsten und leicht vorgenommen Messungen am Menschen ist die Diffusionskapazität für Kohlenmonoxid (DLCO) 1,2, aber diese Messung ist nur selten in Maus-Modellen geschehen. In diesen Studien, bei denen es wurde berichtet, 3-7, gab es keine Folgestudien, zum Teil, weil die Verfahren oft umständlich oder require komplexen Anlagen. Ein anderer Ansatz ist es, eine CO Rückatemmethode in einem stabilen Zustand System, das den Vorteil, dass sie in der Lage, CO-Diffusion in der bewussten Mäusen messen verfügt. Dieses Verfahren ist jedoch sehr aufwendig, und die Ergebnisse können mit dem Niveau der der Maus die Belüftung sowie O 2 und CO 2 -Konzentrationen 8,9 variieren. Diese Schwierigkeiten scheinen routinemäßige Anwendung von Diffusionskapazität der Lunge Pathologie bei Mäusen erkennen ausgeschlossen haben, trotz seiner mehrere Vorteile.
Um die Probleme mit der Messung der Diffusionskapazität in Mäusen zu umgehen, Details der ein einfaches Mittel, um es in Mäusen gemessen wurden kürzlich berichtet 10. Das Verfahren schließt das schwierige Problem der Probenahme unberührten Alveolargas durch schnelles Abtasten eines Volumens gleich der gesamten Inspirationsgas. Dieses Verfahren führt zu einer sehr reproduzierbare Messung, der sogenannten Diffusionsfaktor für Kohlenmonoxid (DFCO), die empfindlich gegenüber einer Vielzahl von pathologic Veränderungen der Lunge Phänotyp. Die DFCO errechnet sich somit 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), wo die c und 9 Indices beziehen sich auf Konzentrationen der Kalibrierungsgase eingespritzt und die Gase nach einer 9 sec Atemanhaltezeit beseitigt, jeweils. DFCO ist eine dimensionslose Größe, die zwischen 0 und 1 variiert, wobei 1 reflektiert vollständige Aufnahme aller CO und 0 reflektierenden keine CO-Aufnahme.
In diesem Vortrag zeigen wir, wie man diese Diffusionskapazität Messung durchzuführen, und wie sie verwendet werden, um Veränderungen in fast allen der vorhandenen Maus Lungenkrankheit Modelle, einschließlich Emphysem, Fibrose, akuter Lungenverletzung und Virus- und Pilzinfektionen zu dokumentieren.
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Protokoll
HINWEIS: Alle Tier Protokolle wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Tiere
- Bereiten Sie 6 C57BL / 6-Kontrollmäuse für die DFCO Messung von betäuben sie mit Ketamin und Xylazin wie in Schritt 2.3 unten beschrieben.
- Bereiten alle anderen Mäuse mit den in Tabelle 1 gezeigten verschiedenen Lungenerkrankungen durch Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die Kontrollen. Spezifische Details benötigt, um jedes dieser Modelle zu etablieren sind in den entsprechenden Referenzen gefunden. Die Kontrollmäuse und die in den anderen pathologischen Kohorten alle 6-12 Wochen alt.
2. Messung der Diffusion Faktor für Kohlenmonoxid (DFCO)
- Einrichten des Gaschromatographen Modul mit der Maschine zugeführt, um Peaks für Stickstoff, Sauerstoff, Neon und Kohlenmonoxid zu messen. Für diese Anwendung verwenden nur die Neon und CO-Daten.
HINWEIS: Dieses Gerät verwendet eine molekulare sIEVE Säule mit Helium als Trägergas mit einem 12,00 um Film, 320,00 & mgr; m-ID und 10 m Länge. Der Chromatograph Säule mit einem Volumen von 0,8 ml, aber wir 2 ml ausreichende Lichtung der Verbindungsschlauch mit der Probe zu gewährleisten. - Zu Beginn eines jeden Versuches Tag, vor der Durchführung von Messungen von Proben, die von Mäusen, einen 2 ml Probe direkt aus einem Gasgemisch enthaltenden Beutel ungefähr 0,5% Ne, 0,5% CO, Rest Luft, und diese Probe zu kalibrieren Gaschromatograph.
- Anesthetize Mäuse mit Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (15 mg / kg), und bestätigen Narkose durch das Fehlen von Rückbewegung. Bewerben Tier Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. Tracheostomize die Mäuse mit einer Stichnadelkanüle (18 G bei Erwachsenen bzw. 20 G bei sehr jungen Mäuse).
HINWEIS: Die DFCO wird in weniger als 10 min nach der Narkose beendet und vor jeder mechanischen Ventilation oder andere Verfahren. - Bei Mäusen mehr als 6 Wochen alt, mit einem 3-ml-Spritze to zurückzuziehen 0,8 ml Gas aus dem Gasgemisch Beutel. Verbinden Sie die Spritze mit der Trachealkanüle und schnell aufblasen die Lunge. Mit Hilfe eines Metronoms, zählen 9 sec, und dann schnell ziehen Sie die 0,8 ml (ausgeatmete Luft).
- Verdünnen Sie diese zurückgezogen 0,8 ml ausgeatmete Luft auf 2 ml mit Raumluft, lassen Sie es für mindestens 15 Sekunden Ruhe. Dann injizieren die gesamte Probe in den Gaschromatographen für die Analyse.
- Bei der Analyse dieses ersten DFCO Probe, pumpen Sie die Mauslunge mit einem zweiten 0,8 ml aus dem Gasgemisch Tasche, und dann verarbeiten dieses Beispiel identisch mit der ersten Probe. Der Mittelwert der beiden Messungen DFCO.
HINWEIS: Für die Messung in Mäusen im Alter von 2 Wochen alt, mit einem Volumen von 0,4 ml, 0,8 ml, da ist das umfangreiche Messungen in Lungen von sehr jungen Mäusen zu machen. Es ist besser, das 0,8 ml Volumen für Mäuse älter als 6 Wochen verwendet, und dass, wenn der 0,4-ml-Volumen bei einigen Mäusen benötigt wird, es wird durchgehend für alle Mäuse der Kohorten untersucht werden. - Berechnen DFCOB. 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), wobei c und 9 Indices beziehen sich auf Konzentrationen der Kalibrierungsgase eingespritzt und die Gase nach einer 9 sec Atemanhaltezeit entfernt sind.
- Analyse und den Vergleich Unterschiede mit einem one-way ANOVA und die Bedeutung Ebene mit Tukey-Korrektur für Mehrfachvergleiche in allen Kohorten-Mäusen. Betrachten p <0,05 als signifikant Wert.
HINWEIS: Alle hier verwendeten Mäuse waren Teil der experimentellen Studien mit mehreren aufeinander folgenden Messungen der Lungenventilation, Mechanik, Lungenspülung oder Histologie, der hier nicht ausgewiesen werden. Da zusätzlich das Verfahren ist das gleiche in allen experimentellen Modellen, wie oben bei den Kontrollmäusen durchgeführt wurde, werden nur die Ergebnisse von den verschiedenen pathologischen Modellen vorgestellt. Weitere Informationen zu diesen Modellen wird in der zusätzlichen Tabelle dargestellt. - Euthanize die Tiere durch tiefe anesthetic Überdosierung durch Genickbruch folgte oder Enthauptung. Wo nötig, entfernen Sie die Lungenzellen und / oder Geweben von den toten Mäusen für die weitere biologische oder histologische Verarbeitung und Analyse.
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die DFCO Messungen von den erwachsenen Mäusen in den Gruppen A, B, C, D, E und F. Es wurden signifikante Abnahmen sowohl mit den Aspergillus und Influenza-Infektionen, sowie eine signifikante Abnahme in der fibrotischen, Emphysem, akute Lungenschädigung Modelle. Abbildung 2 zeigt die Gruppe G entwicklungsbedingten Veränderungen in DFCO im Laufe der Zeit als die Mäuse im Alter von 2-6 Wochen. Es gab eine kleine, aber signifikante Zunahme mit Lungenentwicklung in dieser ...
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Diskussion
In der vorliegenden Arbeit, definiert man eine neue Metrik, um die Gasaustauschfähigkeit der Mauslunge quantifizieren. Diese Metrik ist analog zu der Streukapazität eines gemeinsamen klinischen Messungen, die die primäre Funktion der Lunge misst, das heißt, seine Fähigkeit, den Gasaustausch. Die Diffusionskapazität ist die einzige Lungenfunktionsmessung, die leicht und schnell sowohl in Mäusen und Menschen durchgeführt werden können. Für den Nachweis von Lungenerkrankung bei Mäusen ist ein Hauptziel, um Lungenfunktionsv...
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Offenlegungen
Interessenkonflikte, und nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH HL-10342
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gaschromatograph | Inficon | Micro GC Modell 3000A | Agilent stellt ein vergleichbares Modell |
| her 18 G Luer-Stichnadel | Becton Dickenson | Mehrere andere mögliche Anbieter | |
| 3 ml Kunststoffspritze | Becton Dickenson | Mehrere andere mögliche Anbieter | |
| Polypropylen-Gasprobenbeutel | SKC | 1 oder 2 L Fassungsvermögen funktionieren gut | Andere gasdichte Beutel funktionieren gut |
| Gastank, 0,3 % Ne, 0,3 % CO, Ausgleichsluft; (Größe ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | Dies ist die Standardmischung, die für DLCO beim Menschen verwendet wird |
| 25 TCID50/Maus des Influenzavirus A/PR8, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. | |||
| Porzine Pankreas-Elastase | Elastin-Produkte, Owensville, MO | 5,4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0,25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μ g/g Körpergewicht; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (Af293)-Konidien wurden aus reifen Kolonien gesammelt, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar gezüchtet wurden. |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
