Entwicklung eines In vitro Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von Equus Caballus IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

Summary

Die vorliegende Studie beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines gentechnisch veränderten Assay-Systems, das auf der Transfektion von basophilen Leukämiezellen der Ratte mit dem equinen FcεRIα-Gen basiert. Transfizierte Zellen exprimieren einen funktionellen Rezeptor, an dem die Freisetzung von Mediatoren der allergischen Reaktion durch IgE und Antigen aktiviert werden kann.

Abstract

Die Interaktion von IgE mit seinem hochaffinen Fc-Rezeptor (FcεRI), gefolgt von einer antigenen Provokation, ist der Hauptweg bei IgE-vermittelten allergischen Reaktionen. Als Folge der hohen Affinitätsbindung zwischen IgE und FcεRI sowie der kontinuierlichen Produktion von IgE durch B-Zellen bleiben Allergien in der Regel ein Leben lang bestehen, ohne dass es derzeit eine dauerhafte Heilung gibt. Pferde, insbesondere Rennpferde, die häufig Inzucht betreiben, sind eine Säugetierart, die sehr anfällig für die Entwicklung von Überempfindlichkeitsreaktionen ist, die ihre Leistung ernsthaft beeinträchtigen können. Die physiologischen Reaktionen auf allergische Sensibilisierung bei Pferden spiegeln die bei Menschen und Hunden beobachteten Reaktionen wider. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines in situ Assay-Systems zur quantitativen Beurteilung der Freisetzung von Mediatoren der allergischen Reaktion im equinen System beschrieben. Zu diesem Zweck wurde das Gen, das für equine FcεRIα kodiert, in die Oberfläche von elterlichen Basophilen Leukämiezellen (RBL-2H3.1) transfiziert und exprimiert. Das Genprodukt der transfizierten equinen α-Kette bildete mit den endogenen Ratten-β- und γ-Ketten einen funktionellen Rezeptorkomplex ¹. Das resultierende Assay-System ermöglichte eine Bewertung der Menge an Mediator, die von equinen FcεRIα-transfizierten RBL-2H3.1-Zellen nach Sensibilisierung mit equinem IgE und antigener Provokation unter Verwendung der β-Hexosaminidase-Freisetzung als Messwert sezerniert ^{wurde 2, 3}. Die Mediatorfreisetzung erreichte einen Spitzenwert von 36,68 % ± 4,88 % bei 100 ng ^ml-1 Antigen. Dieser Assay wurde von früheren Assays modifiziert, die zur Untersuchung allergischer Reaktionen von Menschen und Hunden verwendet wurden ^{4, 5}. Wir haben auch gezeigt, dass diese Art von Assay-System vielfältige Anwendungen für die Entwicklung von diagnostischen Instrumenten und die Sicherheitsbewertung potenzieller therapeutischer Interventionsstrategien bei allergischen Erkrankungen hat ^{6, 2, 3}.

Introduction

Allergie ist seit Jahrtausenden bekannt. Ein Asthma-Behandlung wurde in der antiken ägyptischen medizinischen Text als Papyrus Ebers (~ 1550 BCE) bekannt beschrieben und diskutiert pflanzliche Heilmittel, um es ⁷ zu behandeln.

Heute Allergie ist als Typ I-Überempfindlichkeitsreaktion, wobei die T-Helferzell-Typ 2 (TH ₂₎ Arm des Immunsystems steuert die Produktion von Immunglobulin E (IgE) Antikörper als Antwort auf Umweltantigene, Allergene genannt klassifiziert. Dies sind diverse Stoffe, die üblicherweise mit Zellen interagieren im Immunsystem und stimulieren die Synthese und Sekretion von proinflammatorischen Cytok....

Protocol

1) Herstellung der Zelllinie:

1. Die Entwicklung der RBL-2H3.1 Zelllinie, Pferde FcsRI α:
   1. Mit grundlegenden Gewebekulturtechniken für Monolayer-Zelllinien, Transfektion Eltern RBL-2H3.1 Zellen unter Verwendung des pEE6 Plasmid, die Durchführung der Pferde FcεRIα Gens (GenBank: Y18204.1) ^28. Hinzufügen 2 ug ul ^-1 der Plasmid-DNA auf 0,8 ml Zellen bei einer Dichte von 1.2 x10 & ^{sup7; Zellen} ml ^-1. Elektroporieren der Zellen bei 250 V 960 uF mit einem 0,4 cm electrocuvette dann sofort auf Eis inkubieren für 10 min.
   2. Auswahl der transformierten Zellen unter Verwendung von Medien, die 0,4 g Gen....

Results

Die Eltern RBL-2H3.1 Zellen und solche mit equinen FcεRIα Rezeptorgen transfiziert wurden zuerst mit Maus-IgE-anti-DNP-HSA sensibilisiert und mit dem DNP-HSA-Antigen herausgefordert. Maus-IgE bindet an den endogenen Rezeptor aus Ratte in beiden Zelllinien und dient als Kontrolle, um die Freisetzung Lebensfähigkeit der beiden Zelllinien zu testen, um Mediatoren (Figur 1 A) lösen damit. Dies ist eine wichtige Kontrolle und sollten routine da beim verlängert (> 10 Wochen) Passage in Zellkultur durchgefü.......

Discussion

In Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, dass bei RBL-Zellen, 2H3.1 equine FcεRIα mit equinen IgE durch ein Antigen sensibilisiert und herausgefordert, geben sie einen Spitzen Mediator-Freisetzung von 36,68% ± 4,88% der Gesamtmenge des innerhalb des Vermittlers Zellen, verglichen mit dem RBL-2H3.1 Elternzellen nicht exprimiert equine FcεRIα.

Somit Dieser Test liefert ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung und das Studium Pferde allergischen Reaktionen in vitro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Exprimieren von Pferdefcε RIα	-	-	Hergestellt im Labor
Pferde-IgE Anti-NIP-HSA	-	-	Hergestellt im Labor
96-Well-Platte Sigma		CLS3595-Mehrkanal-Pipette
	Anachem	-	-
Inkubator	Galaxy R	-
-4Hydroxy-5-iod-3-nitrophenylessigsäure	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH wurde mit humanem Serumalbumin konjugiert, um NIP-HSA im Labor herzustellen
Dinitrophenyl konjugiert mit humanem Serumalbumin	Sigma	A6661	abgekürztes DNP-HSA-Plattenspektrophotometer
	Anthos Labtec HT2	-
-Rohre	Sigma	P1851-Natriumchlorid
	Sigma	S7653-Kaliumchlorid
	Sigma	P9333-Magnesiumchlorid
	Sigma	M2670-Calciumchlorid
	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma	X100-4-nitrophenyl
N-acetyl-β-D-Glucosaminid	Sigma	N9376	Stammlösung mit der Bezeichnung β-Hexosaminidase-Substrat wurde 50mM in DMSO
Dimethylsulfoxid	Sigma hergestellt	D2650-Zitronensäure
	Sigma		251275-Natriumacetat
	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-