Entwicklung eines In vitro Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von Equus Caballus IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines gentechnisch veränderten Assay-Systems, das auf der Transfektion von basophilen Leukämiezellen der Ratte mit dem equinen FcεRIα-Gen basiert. Transfizierte Zellen exprimieren einen funktionellen Rezeptor, an dem die Freisetzung von Mediatoren der allergischen Reaktion durch IgE und Antigen aktiviert werden kann.

Zusammenfassung

Die Interaktion von IgE mit seinem hochaffinen Fc-Rezeptor (FcεRI), gefolgt von einer antigenen Provokation, ist der Hauptweg bei IgE-vermittelten allergischen Reaktionen. Als Folge der hohen Affinitätsbindung zwischen IgE und FcεRI sowie der kontinuierlichen Produktion von IgE durch B-Zellen bleiben Allergien in der Regel ein Leben lang bestehen, ohne dass es derzeit eine dauerhafte Heilung gibt. Pferde, insbesondere Rennpferde, die häufig Inzucht betreiben, sind eine Säugetierart, die sehr anfällig für die Entwicklung von Überempfindlichkeitsreaktionen ist, die ihre Leistung ernsthaft beeinträchtigen können. Die physiologischen Reaktionen auf allergische Sensibilisierung bei Pferden spiegeln die bei Menschen und Hunden beobachteten Reaktionen wider. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines in situ Assay-Systems zur quantitativen Beurteilung der Freisetzung von Mediatoren der allergischen Reaktion im equinen System beschrieben. Zu diesem Zweck wurde das Gen, das für equine FcεRIα kodiert, in die Oberfläche von elterlichen Basophilen Leukämiezellen (RBL-2H3.1) transfiziert und exprimiert. Das Genprodukt der transfizierten equinen α-Kette bildete mit den endogenen Ratten-β- und γ-Ketten einen funktionellen Rezeptorkomplex ¹. Das resultierende Assay-System ermöglichte eine Bewertung der Menge an Mediator, die von equinen FcεRIα-transfizierten RBL-2H3.1-Zellen nach Sensibilisierung mit equinem IgE und antigener Provokation unter Verwendung der β-Hexosaminidase-Freisetzung als Messwert sezerniert ^{wurde 2, 3}. Die Mediatorfreisetzung erreichte einen Spitzenwert von 36,68 % ± 4,88 % bei 100 ng ^ml-1 Antigen. Dieser Assay wurde von früheren Assays modifiziert, die zur Untersuchung allergischer Reaktionen von Menschen und Hunden verwendet wurden ^{4, 5}. Wir haben auch gezeigt, dass diese Art von Assay-System vielfältige Anwendungen für die Entwicklung von diagnostischen Instrumenten und die Sicherheitsbewertung potenzieller therapeutischer Interventionsstrategien bei allergischen Erkrankungen hat ^{6, 2, 3}.

Einleitung

Allergie ist seit Jahrtausenden bekannt. Ein Asthma-Behandlung wurde in der antiken ägyptischen medizinischen Text als Papyrus Ebers (~ 1550 BCE) bekannt beschrieben und diskutiert pflanzliche Heilmittel, um es ⁷ zu behandeln.

Heute Allergie ist als Typ I-Überempfindlichkeitsreaktion, wobei die T-Helferzell-Typ 2 (TH ₂₎ Arm des Immunsystems steuert die Produktion von Immunglobulin E (IgE) Antikörper als Antwort auf Umweltantigene, Allergene genannt klassifiziert. Dies sind diverse Stoffe, die üblicherweise mit Zellen interagieren im Immunsystem und stimulieren die Synthese und Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, einschließlich IL-4 und Interleukin-13 ^{8, 9} als weiß Partikel im Zigarettenrauch oder Dieselabgaspartikeln, die IgE-Synthese zu erhöhen ^10.

Der Anstieg der allergischen Manifestationen in Industrieländern in den letzten 50 Jahren hat sich eine Kombination der Wirkung zugeschriebenUmweltschadstoffe und ein Trend zu einer keim Umgebung, die die Immunantwort gegenüber einem Profil von TH ₂ Zytokine überwog verschieben kombinieren, wie durch die "Hygiene-Hypothese" ¹¹ vorgeschlagen.

Wie oben erwähnt, sind Menschen nicht nur Säugern durch Allergie leidet. Insbesondere Pferden und Hunden entwickeln auch klassische allergische Reaktionen und eine Untersuchung von ¹² zeigt, dass, wie beim Menschen, wird equine Allergie auf genetischen und Umweltfaktoren zurückzuführen. Als Folge präsentieren diese Tiere gute Modelle zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen genetischen und umweltbedingten Ursachen von Allergien, ihr Fortschreiten von Sensibilisierung gegen Krankheit und mögliche Interventionsstrategien einmal klinischen Manifestationen in gesetzt

1887 Stömmer war die erste Person, die Ähnlichkeit zwischen Mensch und Pferde-Asthma ¹³ zu beschreiben, ist die Wirkung von Histamin auf der Pferdeherzkreislaufsystemsehr ähnlich dem des Menschen ^14. Pferde sind auch der Grundstein der Pferderennindustrie, die es wert USD 72 Milliarden mit einem Wettumsatz von US $ 115.000.000.000 jährlich ^15.

Die meisten zeitgenössischen Rennpferde sind Nachkommen von der geringen Zahl der arabischen Pferde von Lady Anne Blunt seit 1878 gezüchtet. Moderne Rennpferde werden häufig Inzucht für Performance Fähigkeiten auszuwählen. Sie sind anfällig für genetische Erkrankungen, von denen eine ihre Anfälligkeit für allergische Reaktionen zu montieren. Sie haben auch 1000 mal höhere Serum-IgE-Spiegel als selbst die am schwersten allergischen Menschen ^16. Pferde allergischen Reaktionen sind in der Regel als Insektenstich Überempfindlichkeit (IBH) ^{17, 18} manifestiert. IBH Ergebnisse in Dermatitis durch Bisse bilden Insekten aus der Gattung Culicoides. Eine andere Form der Pferde-allergische Erkrankung ist rezidivierenden Atemwegsobstruktionen (RAO), dies in den Lungen und Atemwegen manifestiert. Es wird von Keuchen und Labor gekennzeichnetODER-verknüpft Atmung. RAO tritt häufig als Reaktion auf Sporen zu formen, und hohe allergenspezifische IgE-Spiegel haben bei Pferden, die an RAO in einer Studie ¹⁹ registriert worden, obwohl ein anderer Untersuchung nicht bestätigt diesen ^20.

Studien über equine Allergie drehte sich um die Versuch Überwachung und Neutralisieren equine IgE durch die Entwicklung anti equine IgE monoklonalen Antikörpern (mAb) ^{21, 22.} Weiterhin die Studie von ²³ diskutiert die Produktion der extrazellulären Domänen der α equinen Hochaffinitäts-Fc-Rezeptors Kette (FcεRIα) Rezeptors in einem Versuch zu detektieren und zu quantifizieren Pferdeserum IgE. Eine verwandte Studie von Ledin ²⁴ bespricht einen neuen Ansatz bei der Neutralisierung Serum-IgE durch Priming des Immunsystems mit einem selbst / Nicht-Selbst Immunogen gerichtet. Alle diese Studien fehlte aber eine wirksame Assay, um die Sicherheit und Wirksamkeit der Testprotokolle. In diesem Artikel haben wir jetzt eine solche Assay sys präsentierentem für die Untersuchung der relevanten equinen System, in dem β-Hexosaminidase Release, als Indikator für die Zellmediator Degranulation wurde für RBL-Zellen, 2H3.1 equine FcεRIα beurteilt diagnostische und therapeutische Strategien. Dieses Protokoll basiert auf früheren Veröffentlichungen ^{25, 4, 5, 2, 3} das Engineering von RBL-Zellen mit den IgE-Bindungsdomäne des hochaffinen IgE-Rezeptors verschiedener Spezies kodiert, transfiziert Beschreibung basiert. Das Protokoll beschreibt, wie ein β-Hexosaminidase-Freisetzungstest durchzuführen, deren Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Experimenten dargestellt.

Der Freisetzungstest wurde zuerst von Siraganian entwickelt und Haken ²⁵ Menschenallergie zu untersuchen. Das Labor Gruppe von Dr. Reuben Siraganian führte entwickelte auch die RBL-Zelllinie. Diese RBL Zellen wurden entwickelt, um die menschliche FcεRIα auszudrücken und das Protokoll wurde von ⁴ veröffentlicht. Das letzte Stückder Test wurde mit der Entwicklung des Plasmids pSV in der Veröffentlichung von Neuberger ^26, die die Produktion von IgE-Antikörpern durch Klonierung ihrer Schwerketten-Gen stromabwärts von einem Maus-Gen für eine variable Region, die IgE das Hapten 4-Hydroxy-3 zielt beschrieben nitro-Phenacetyl (NP), war die resultierende chimäre Antikörper, vollständig funktionsfähig. Die Fähigkeit, jede IgE entwickeln die die gleichen Hapten, wobei auch die Klonierung seinen Rezeptor auf der Oberfläche der RBL-Zellen führte zu der Standardisierung des Assays so dass es ein nützliches Protokoll, um die Degranulation von Basophilen Zellen zu messen.

Der Test funktioniert haben Vor- und Nachteile. Die Profis des Assays ist seine Anpassungsfähigkeit an irgendeinem Säugersystem verwendet werden, unser Labor ist somit benutzt, um die Degranulation der Mensch, Hund und Pferde Systeme zu testen, und dies ist erreichbar, einfach durch Synthetisieren des Organismus IgE und Klonieren seinen Rezeptor auf die Oberfläche der RBL-Zellen.

Andererseits,die Nachteile des Assays ist, dass die RBL-Zellen sind sehr empfindlich gegen thermische, mechanische und PH ändert, so dass sie eine Veränderung der Degranulation Ebenen innerhalb des gleichen Assay zu ergeben. Es wird daher dringend empfohlen, dass die Tests werden immer dreifach wiederholt und dann ein Mittelwert von ihnen genommen. Darüber hinaus sind die RBL-Zellen sind in der Regel zu einer nicht-freisetzenden Phänotyp verschieben, wenn sie in der Gewebekultur für längere Zeiten (> 10 Wochen) ²⁷ übrig sind, was ihre Wartung umständlich. Sie sind auch anfällig für Infektionen durch Mycoplasma-Bakterien, die nicht von einem Lichtmikroskop sichtbar sind und nicht die Morphologie der Zelle ändern, würde aber ihre Degranulation Ebenen drastisch ändern. So regelmäßigen Mykoplasmen-Tests erforderlich.

Protokoll

1) Herstellung der Zelllinie:

1. Die Entwicklung der RBL-2H3.1 Zelllinie, Pferde FcsRI α:
   1. Mit grundlegenden Gewebekulturtechniken für Monolayer-Zelllinien, Transfektion Eltern RBL-2H3.1 Zellen unter Verwendung des pEE6 Plasmid, die Durchführung der Pferde FcεRIα Gens (GenBank: Y18204.1) ^28. Hinzufügen 2 ug ul ^-1 der Plasmid-DNA auf 0,8 ml Zellen bei einer Dichte von 1.2 x10 & ^{sup7; Zellen} ml ^-1. Elektroporieren der Zellen bei 250 V 960 uF mit einem 0,4 cm electrocuvette dann sofort auf Eis inkubieren für 10 min.
   2. Auswahl der transformierten Zellen unter Verwendung von Medien, die 0,4 g Geneticin G418 Sulfat, sortiert dann die verbleibenden lebenden Zellen durch FACS durch Markieren sie mit einem Fluoreszenz IgE-Antikörper. Verwenden Sie die resultierende RBL-2H3.1 ausdrücken Pferde FcεRIα Zelllinie für die Untersuchung ^{2, 3.}
2. Pre-Test Antikörper Sensibilisierung:
   1. 5 Zellen ml ^-1.
   2. Hinzufügen des IgE von Interesse für die suspendierten Zellen zu einer Endkonzentration von 1 ng ml ^-1, dann die Platte 100 & mgr; l der Zellen auf eine Platte mit 96 Vertiefungen in den Spalten 1-6 und bei 37 ° C + 5% CO ₂ + 90% relative Luftfeuchte für 16 Stunden. Nach der Inkubationszeit und vor der Durchführung der Freisetzungstest, überprüfen Sie die Brunnen unter einem Mikroskop auf gut Konfluenz und Zellhaftung.

2) Veröffentlichung Assay:

1. Waschen der Zellen:
   1. Warm Freisetzungspuffer (25 mM PIPES, 120 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 0,04 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Calciumchlorid) bei 37 ° C bis zur sanften Waschen der Zellen zu ermöglichen.
   2. Wash-Zellen durch Schwenken der Platte an Zellmedien zu entfernen und das Hinzufügen von 100 ul warm, 37 ° C, Freisetzungspuffer. Zweimal wiederholen.
2. Antigen Herausforderung:
   1. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung des Antigens (NIP-HSA oder DNP-HSA) von 0 ng ml ^-1, 0,1 ng ml ^-1, 1 ng ml ^-1, 10 ng ml ^-1, 100 ng ml ^-1, 1.000 ng ml ^-1, 10.000 ng ml ^-1 in Freisetzungspuffer und warm bei 37 ° C.
   2. Nach dem zweiten Zellwäsche, entsorgen Sie die Medien und mit 100 ul der Antigenlösungen ersetzt. Sicherzustellen, daß Vertiefungen in der gleichen Reihe (A1-6 zum Beispiel) die gleiche Antigenkonzentration zu ihnen hinzugefügt.
   3. Eine Negativkontrolle in der Zeile A durch Zugabe von 0 ng ml ^-1 Antigen eingestellt. Hinzufügen zunehmender Antigenkonzentration die Reihen (BG), gefolgt von Triton-x-Puffer (5% Triton X-100) in der Reihe H-Zellen, um die Zellen zu lysieren, um als positive Kontrolle verwendet werden. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min, um damit die Zellen ihre Mediatoren freisetzen.
3. Einrichten individuelle Wohlkontrollen:
   1. Nach der Inkubation mit einer Pipette 50 ul Zellüberstand auf die andere Hälfte der Platte (wells A1-6 bis A7-12 Vertiefungen, etc.). Verwerfen der restlichen 50 & mgr; l des Überstands und Ersetzen mit 50 ul Triton-X-Puffer, um die Messung der Menge des freigesetzten Mediatoren in jede Vertiefung in den Spalten 7-12 als Prozentsatz der Gesamtmediatoren in den Zellen in Spalte 1-6 ermöglichen .
4. Enzym-Substrat:
5. Dann werden 50 ul der β-Hexosaminidase-Substrat (50 mM 4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid in DMSO durch Zugabe zu Citratpuffer 0,2 M Zitronensäure und 0,2 M Natriumacetat auf 2 mM verdünnt, pH 4,5) zu allen Vertiefungen, um die Umwandlung des Substrats zu 4-Nitrophenol durch das β-Hexosaminidase Enzyms erleichtert. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 Stunden.

5. Beenden der Reaktion:
   1. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 150 & mgr; l Tris-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 9) in jede Vertiefung wie die hohe pH-Wert des Puffers wird die Reaktion gestoppt und dann die 4-Nitrophenol in einer gelben Farbe.
6. Das Lesen und die Analyse der Ergebnisse:
   1. Lesen der Platte unter Verwendung eines Platten Spektrophotometer bei 405 nm, die Absorption der gelben Farbe gemessen. Berechnet den Prozentsatz des freigesetzten β-Hexosaminidase Verwendung der folgenden Formel:

2. Wenden Sie diese Formel in jede Vertiefung, wonach ein Mittelwert für jede Zeile übernommen. A1 und A7 repräsentieren die Lage der Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. Eine Grafik mit Prozentsatz der β-Hexosaminidase Mitteilung (die Gesamtmediatorfreisetzung entspricht) against Antigenkonzentration ^{2, 3.}

Ergebnisse

Die Eltern RBL-2H3.1 Zellen und solche mit equinen FcεRIα Rezeptorgen transfiziert wurden zuerst mit Maus-IgE-anti-DNP-HSA sensibilisiert und mit dem DNP-HSA-Antigen herausgefordert. Maus-IgE bindet an den endogenen Rezeptor aus Ratte in beiden Zelllinien und dient als Kontrolle, um die Freisetzung Lebensfähigkeit der beiden Zelllinien zu testen, um Mediatoren (Figur 1 A) lösen damit. Dies ist eine wichtige Kontrolle und sollten routine da beim verlängert (> 10 Wochen) Passage in Zellkultur durchgefü...

Diskussion

In Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, dass bei RBL-Zellen, 2H3.1 equine FcεRIα mit equinen IgE durch ein Antigen sensibilisiert und herausgefordert, geben sie einen Spitzen Mediator-Freisetzung von 36,68% ± 4,88% der Gesamtmenge des innerhalb des Vermittlers Zellen, verglichen mit dem RBL-2H3.1 Elternzellen nicht exprimiert equine FcεRIα.

Somit Dieser Test liefert ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung und das Studium Pferde allergischen Reaktionen in vitro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RBL-2H3.1 Exprimieren von Pferdefcε RIα	-	-	Hergestellt im Labor
Pferde-IgE Anti-NIP-HSA	-	-	Hergestellt im Labor
96-Well-Platte Sigma		CLS3595-Mehrkanal-Pipette
	Anachem	-	-
Inkubator	Galaxy R	-
-4Hydroxy-5-iod-3-nitrophenylessigsäure	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH wurde mit humanem Serumalbumin konjugiert, um NIP-HSA im Labor herzustellen
Dinitrophenyl konjugiert mit humanem Serumalbumin	Sigma	A6661	abgekürztes DNP-HSA-Plattenspektrophotometer
	Anthos Labtec HT2	-
-Rohre	Sigma	P1851-Natriumchlorid
	Sigma	S7653-Kaliumchlorid
	Sigma	P9333-Magnesiumchlorid
	Sigma	M2670-Calciumchlorid
	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma	X100-4-nitrophenyl
N-acetyl-β-D-Glucosaminid	Sigma	N9376	Stammlösung mit der Bezeichnung β-Hexosaminidase-Substrat wurde 50mM in DMSO
Dimethylsulfoxid	Sigma hergestellt	D2650-Zitronensäure
	Sigma		251275-Natriumacetat
	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-