Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

Zusammenfassung

Die In-vitro-Analyse der Klassenschalter-Rekombination bei Mäusen ist aufgrund zytophiler IgE-Moleküle, die an Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von B-Zellen gebunden sind, eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur IgE-Detektion unter Verwendung der Trypsin-vermittelten Spaltung von oberflächengebundenem IgE vor der Fixierung und Permeabilisierung für die zytoplasmatische Fluoreszenzfärbung.

Zusammenfassung

B-Lymphozyten-Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) ist ein Verfahren, bei dem zunächst ausgedrückt IgM schaltet auf andere IgH Isotypen, wie IgA, IgE und IgG. Messung der IgH CSR in vitro ist ein Schlüsselverfahren für die Untersuchung einer Reihe von biologischen Prozessen, die von DNA-Rekombination und Reparatur, um Aspekte der molekularen und zellulären Immunologie. In vitro CSR Assay das durchflusszytometrische Meßfläche Ig-Expression auf aktivierten B-Zellen. Während Messung des IgA- und IgG-Subklassen ist einfach, ist die Messung von IgE durch dieses Verfahren problematisch aufgrund löslichen IgE-Bindung an FcεRII / CD23, das auf der Oberfläche von aktivierten B-Zellen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Verfahren für die genaue Messung von IgE-produzierende Maus-B-Zellen, die CSR in Kultur erfahren haben. Das Verfahren basiert auf Trypsin-vermittelten Spaltung von IgE-CD23-Komplexen auf der Zelloberfläche gehalten und erlaubt die Detektion von IgE-produzierenden B-Linie Zellen durch cytoplasmic Färbung. Dieses Verfahren bietet eine komfortable Lösung für die durchflusszytometrische Analyse von CSR an IgE.

Einleitung

Während der schweren Immunglobulinkette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) in Mäusen und Menschen, μ die IgH Exons der konstanten Region (C & mgr;) gelöscht und durch eine von mehreren Sätzen von nachgeschalteten Exons der konstanten Region (C _H s) (z Cy ersetzt, C & egr; und C & alpha;), was zu einem Wechsel von der Herstellung von IgM auf die Herstellung von anderen Ig-Klassen (beispielsweise IgG, IgE oder IgA). CSR tritt innerhalb Schalter (S) Regionen, die 1-10 kb-Sequenzen, die 5 'an jeden Satz von C _H s ¹ sind. Die Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID) Enzym initiiert CSR über Cytidin Desaminierung Aktivität.

IgE ist ein wichtiger Mediator der allergischen Erkrankung ² und ein besseres Verständnis dafür, wie IgE produziert und reguliert kann Türen zu neuen Therapieansätzen zu atopischen Erkrankung zu öffnen. In Mäusen und Menschen, ist die IgE streng reguliert Ig Isotyp. IgE wird normalerweise in Mengen Tausende von tim erkanntes weniger als andere IgH Isotypen ^3, kann jedoch stark bei Krankheitszuständen ⁴ erhöht werden. Jedoch CSR an IgE ist nicht vollständig verstanden. In vitro-Aktivierung von B-Zellen mit IL-4 in Kombination mit entweder Anti-CD40 oder LPS induziert CSR sowohl IgG1 und IgE ^5. Aktivierte B-Zellen exprimieren den niedrigen affinen IgE-Rezeptors FcεRII / CD23 ^2,6, die die lösliche IgE in Kultur nach CSR abgesondert bindet. Deshalb bei der Analyse mit Durchflusszytometrie, B-Zellen mit rezeptorgebundenen IgE-Färbung ähnlich wie Zellen endogen exprimierenden IgE ^7b. Obwohl bekannt ist, dass die Maus-B-Zellen das geringe Affinität IgG-Rezeptor FcγRIIB1 (CD32) ^8, in unserer Erfahrung ist es offenbar nicht mit der Messung der Klassenwechsel zu IgG1 stören. Allerdings, wenn die Messung IgE Schalt nach B-Zell-Aktivierung in der Kultur, nicht spezifische oberflächengebundene IgE kann die Analyse verschleiern. Mit gemeinsamen Färbeverfahren, Fleck nicht IgE-exprimierenden Zellen positiv für IgE.

Hier skizziert ist eine Strategie, die verwendet worden ist, um CSR-Tests von Mäusen ⁹ durchführen und erkennen wahre IgE-exprimierenden Zellen, B ^{- 11.} Behandlung von aktivierten B-Zellen mit Trypsin, einem gemeinsamen Labor-Reagens, um Protein zu verdauen, entfernt sowohl cytophylic und Membran-gebundenen Oberfläche IgE. Nachfolgende Permeabilisierung und Färbung für zytoplasmatische IgE zeigt somit die wahren IgE-produzierenden Zellen.

Protokoll

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und von Tierforschung Kinderkrankenhaus (ARCH), Boston, Mass zugelassen.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. 1,000x IL-4 Stock: Verdünnen IL-4 Cytokins an 20 ug / ml in H ₂ O oder 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Dispense in 200 ul Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
2. 1,000x anti-CD40: Beziehen des Herstellers bei 1,0 mg / ml, Lagerung bei 4 ° C.
3. B-Zell-Stimulation Mittel: Auf 425 ml RPMI-1640-Medium, fügen Sie 75 ml frisch aufgetauten fötalem Kälberserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-Puffer, 5 ml L-Glutamin Lager, 5 ml Penicillin: Streptomycin Lager, 5 ml Minimum Essential Medium nicht essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol. Lagern Sie Druckmaterial bei 4 ° C für bis zu einer Woche. Hinzufügen IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) unmittelbar vor der Anwendungnur auf das Volumen des benötigten Medien.
4. 2% FCS-FACS-Puffer: 10 ml FCS bis 490 ml 1x PBS. Halten bei 4 ° C.
5. 2x Trypsin-EDTA-Lösung: 5 ml der 10fach Trypsin-EDTA-Stammlösung (5,0 g Trypsin, 2,0 g EDTA pro Liter) in 20 ml 1 × PBS. Speicher Trypsin-EDTA in 2x Arbeits Aliquots bei 4 ° C. Ermöglichen, sich auf Raumtemperatur gebracht werden.
6. Fötalem Kälberserum: Halten aufgetauten FCS bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. Zeigen auf Eis 15 min vor der zytoplasmatischen Färbungsverfahren.
7. Neutral-Formalin: Eine 10% ige Formalin-Lösung (3,7% Paraformaldehyd). Formalin ist giftig und daher behandeln es unter einem Laborabzug beim Tragen geeigneter PSA. Shop Formalin bei Raumtemperatur in einer chemischen Speicherschrank.
8. Methanol: Shop absolutem Methanol (100%) bei -20 ° C, bis die Zellen bereit sind, durchlässig gemacht werden. Beachten Sie, dass Methanol ist brennbar und sollte in einem angemessenen Gefrierschrank gelagert werden.

2.Reinigung und Aktivierung von B-Zellen

1. Von einem frisch geerntet Mäusemilz, bereiten eine Einzelzellsuspension durch leichtes Eindrücken der Orgel durch eine 70 um Zellsieb mit dem Kolben eines 3-ml-Spritze. In ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen sammeln Zellen in 10 ml 1x PBS und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C.
2. Dekantieren Sie den Überstand und Pellet in 1 ml Rotes Blutkörperchen Lysepuffer für 5 min. Neutralisieren mit 13,5 ml 1 × PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min.
3. (Optional) magnetisches Trennen der B-Zellen mit anti-CD45R (B220) -markierten Kügelchen nach der MACS Reinigungsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Stimulieren gereinigte B-Zellen mit 1,0 × 10 ⁶ Zellen / ml in erwärmt B-Zell-Stimulation Medien, die IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) für 5 Tage bei 37 ° C. Beginnen Sie mit 8 ml der Kultur in 2 Vertiefungen einer 6-Well-Kulturplatte (je 4 ml) aufgeteilt.
5. Überprüfen cultuWieder täglich mit 1,0 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erhalten. Die Konzentration ist anzupassen durch Aufteilen in andere Vertiefungen und mit B-Zell-Stimulationsmittel mit frischem IL-4 und anti-CD40 Verdünnen der Kultur.

3. Trypsinisierung, Fixierung und Permeabilisierung

1. Trypsinierung
   1. Sammeln von bis zu 1,0 x 10 ⁷ kultivierten Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und dekantiert den Überstand.
   2. Waschen mit 10 ml PBS, um die Rest Proteins aus der Zelle Mappen Medien zu entfernen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und dekantiert die überstehende.
   3. Zellpellet in dem Restvolumen nach dem Dekantieren (etwa 100 ul).
   4. 800 ul der Raumtemperatur 0,1% (2x) Trypsin-EDTA sorgfältig in den Zellen. Verzichtet werden langsam in einem Winkel von 45 ° an der Seite des konischen Rohrs.
   5. Die Tube und vorsichtig durch Kippen des Rohrs, so dass die Flüssigkeit entlang der Länge des Rohres 5-6 Zeit abläufts. Eine fadenziehende, weiße Niederschlag in der Lösung zu bilden. Begrenzen Sie die Zeit, um Trypsinisierung unter min.
   6. Quenche die Trypsinisierung Reaktion mit 1 ml kaltem FCS. Verdünne das FCS sofort durch Zugabe von 10 ml kaltem PBS gewaschen.
   7. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C, dann dekantiert und die Röhrchen zurück zu Eis.
2. Fixierung
   1. Resuspendieren der Zellen in dem Restvolumen nach dem Dekantieren. Falls erforderlich, bringen Volumen von bis zu 100 & mgr; l mit kaltem PBS.
   2. In einer Abzugshaube, fügen Sie 800 ul von 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung zu den Zellen und pipettieren auf und ab. Das Rohr wird durch die Zugabe von Formalin zu erwärmen. Bei 37 ° C für 10 min.
3. Permeabilisierung
   1. Richten Sie eine Tisch Vortex-Mischer in einem leichtem Schütteln Geschwindigkeit.
   2. Zeichnen 9 ml kaltem (-20 ° C) Methanol in einen 10 ml serologische Pipette.
   3. Halten Sie das Röhrchen mit den Zellen über die Vortex-Mischer und sanft starten Shaking die Zellen.
   4. Kaltes Methanol zu dem Rohr so ​​dass es auf den Zellen tropfenweise fällt, während das Rohr noch Schütteln, so dass das Methanol kontinuierlich gemischt. Nach den ersten 2 ml Methanol kann die Abgabegeschwindigkeit zu einem langsamen Strom erhöht werden.
   5. Lassen Sie den Schlauch sitzen auf Eis für 30 min, um die Permeabilisierung abzuschließen. Alternativ können die Zellen bei -20 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.

4. Fluoreszenzfärbung für IgG1 und IgE Class Switching

1. Centrifuge Probe bei 300 xg für 5 min und dekantiert die Methanollösung. Ein weißer Niederschlag kann mit den Zellen zu pelletieren.
2. 10 ml Raumtemperatur 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, um Zellen zu waschen. Wiederholen Sie einmal. Hinweis: Das Waschen des Pellets mit Raumtemperatur PBS löst zusätzliche Niederschlag, der nach dem Schritt 4.1 bilden kann.
3. Führen Sie eine weitere Waschung mit 10 ml 2% FCS-FACS-Puffer.
4. Verteilen Proben in eine 96-Well-Rundbodenplatteund Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Dekantieren und stellte den Teller auf dem Eis.
5. Stain in 60 ul 2% FCS-FACS-Puffer pro Vertiefung mit folgenden Antikörperverdünnungen: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200 Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE-FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200
6. Nach 5 min Färbung, waschen der Platte mit 150 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Zentrifuge 5 min bei 300 x g.
7. Resuspendieren in 400 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Pipette durch ein 40 um Nylon Zellsieb in ein 5 ml FACS-Röhrchen.

5. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie:

1. Isolieren CD45R (B220) positive Zellen aus dem Spreng Lymphozyten-Population auf der FSC / SSC Plot (Abbildung 1) befindet.
2. Von der B220-positiven Zellen, verwenden Sie die IgE und IgG1 Grundstück, um die entsprechenden Populationen zu offenbaren.

Ergebnisse

Dieses Verfahren wurde erfolgreich durchgeführt, um CSR an IgE in Maus-B-Zellen zu untersuchen. Um die Effizienz bei der Messung CSR demonstrieren angeregt wir Maus Milz-B-Zellen mit anti-CD40 und IL-4, wie zuvor beschrieben ^11. Nach fünf Tagen der Stimulation wurden die Zellen gesammelt und mit dem vorstehend beschriebenen und mit fluoreszierend markierten IgM, IgG1, IgE und B220 (CD45R) Antikörpern gefärbt Protokoll verarbeitet. An Strahl Lymphozyten (1), eine klare Population von IgE + Zel...

Diskussion

Stimulation von Maus-Milz-B-Zellen in Kultur mit Anti-CD40 und IL-4 wird T-Helfer Typ 2 _(TH 2) Wechselwirkungen, ermutigend Klassenumschaltzeit IgG1 und IgE ⁵ simulieren. B-Zellen können für CSR im Rahmen der Gesamt Splenozyten ¹² oder als gereinigte Milz-B-Zellen, ¹¹ aktiviert werden. Wie in dem Protokoll (Schritt 2.3) angemerkt, ist B-Zell-Anreicherung optional, und liegt im Ermessen des Experimentators, ob es von Vorteil, zu ermitteln. Positive magnetische Trennung von B-Ze...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Maus IgE FITC	BD Pharmingen	553415	Klon R35-72
Ratte Anti-Maus IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	Klon A85-1
Methanol	BDH	BDH1135-4LP	Bei -20 &de; C
Falcon Zellsieb 40 µ m Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µ m Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	Klon RA3-6B2
Anti-Maus/Ratte CD40	eBioscience	16-0402-85	Klon HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) Mikrokügelchen	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS Aufreinigungssäule	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Rekonstitution in Wasser oder 0,1% BSA
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Trypsin-EDTA Lösung (10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g Trypsin, 2,0 g EDTA• 4 Na pro Liter 0,9 % NaCl
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)
L-Glutamin 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-Mercaptoethanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Erythrozytenlysepuffer	Sigma Aldrich	R7757
Ratte Anti-Maus IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	Klon 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B-Zell-Stimulationsmedien			B-Zell-Stimulationsmedien bestehen aus RPMI mit fötalem Kälberserum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-Glutamin,   1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 & Mikro; g/ml), Beta-Mercaptoethanol (7 & Mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) und Anti-CD40 (1 & Mikro; g/ml)