Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA In-situ- Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Summary

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Abstract

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv bei der Kartierung hoch repetitive Sequenzen an heterochromatischen Regionen, in denen Rechenansätze gegen prohibitiv Herausforderungen. Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für DNA ISH, die Formamid wäscht die Standardschritte in anderen DNA ISH Protokolle umgeht. Unser Protokoll zur Hybridisierung mit kurzen Einzelstrang-DNA-Sonden, die Fluoreszenzfarbstoffe, die effektiv zu markieren repetitive DNA-Sequenzen in hetero chromosomalen Regionen in einer Anzahl verschiedener Insektengewebetypen durch optimiert. Jedoch können Anwendungen erweitert werden, um mit größeren Sonden und Visualisierung von Einzelkopie (nicht-wiederkehrende) DNA-Sequenzen zu verwenden. Wir zeigen, diese Methode durch die Abbildung verschiedene repetitive Sequenzen zu gequetscht Chromosomen von Drosophila melanogaster Nervenzellen und Nasoniavitripennis Spermatozyten. Wir zeigen Hybridisierungsmuster für beide klein, kommerziell synthetisiert Sonden und für eine größere Sonde zum Vergleich. Bei diesem Verfahren wird einfach Laborbedarf und Reagenzien, und ist ideal für Ermittler, die wenig Erfahrung mit der Durchführung DNA ISH haben.

Introduction

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Sonden an einzelne Kopie Regionen innerhalb Euchromatin kann durch eine Handvoll von Ansätzen, darunter Nick-Translation oder Endmarkierung langer DNA-Produkte ^1,2 und den Einbau von deoxygenin (DIG) -attached Nukleotide und ihre Anerkennung durch eine Vielzahl von erzeugt werden Gruppe-konjugierte Antikörper ^1-3. Visualisierung der euchromatischen Sequenzen in wenigen oder einzelnen Kopienzahl erfordert die Verwendung von entweder einzelne große Sonden mit hoher spezifischer Aktivität oder einen Cock....

Protocol

1. Die Gewebe Dissection und Fixation (60 min)

1. Für Drosophila Gehirn legen ^3. Larvenstadium in einem Tropfen 1x PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). Wählen Sie große ^3. Larvenstadium, die aktiv kriechen aus Ampullen oder Flaschen, die nicht überfüllt sind.
   1. Verwenden Sie einen ultrafeinen Pinzettenpaar zu halten den Mund Haken und andere Pinzettenpaar zu greifen zwei Drittel über die gesamte Länge des Körpers (1A, B) zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um das Gehirn, ventralen Ganglien, Speicheldrüsen und ein Teil der Larvenverdauungstrakt aus. Mit der Pinzette, um das Gehirn und ventralen gan....

Results

Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hybridisierten wir eine Reihe von kleinen kommerziell synthetisiert Oligos, die chemisch mit Fluoreszenz-Konjugate (Abbildung 2) und einem längeren biotinylierte Sonde verändert wurden (durch Nick-Translation eines PCR-Produktes hergestellt; 2B), um die Chromosomen aus verschiedenen Gewebe Typen (siehe Tabelle 1). Die Zielsequenzen enthalten Satelliten-Wiederholungen in pericentromeric (Heterochromatin) Regionen der mitotischen Chro.......

Discussion

DNA ISH wird häufig verwendet, um spezifische Sequenzen auf Chromosomen kartieren. Wir haben ein einfaches Verfahren zur DNA ISH für hohe Kopienzahl, hetero Sequenzen optimiert beschrieben. Anstatt mit Waschungen in einem Formamid-Lösung, die eine Anforderung in anderen vorhandenen DNA ISH Protokolle ist, legen wir gewebe Dias direkt auf einen vorgeheizten Block an DNA zu denaturieren. Dieses Verfahren umgeht die Verwendung von großen Mengen an Formamid. Ein wichtiger Schritt für die Herstellung von klaren Hybridisierun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger (es können auch normale Objektträger verwendet werden)	Sigma Aldrich
Ultrafeine Pinzette (5 Gauge)	Dumont
22 x 22 mm Deckgläser	Fisher		Sigmacote-behandelt durch Eintauchen für 15 Sekunden, trocken tupfen und alle Spuren von Sigmacote abwischen, so dass das Deckglas klar ist
Sigmacote	Sigma Filterpapier
			75 - 150 mm
Paraffinwachspapier
, Heizblock mit Thermometer
Trockenbrutkasten
Rasierklingen
Feuchtigkeitskammer			leere Pipettenspitzenbox oder Tupperware, ausgekleidet mit angefeuchteten Papiertüchern oder Kimwipes,
Coplin-Gläsern			mit Gleitrillen,
Aluminiumfolie
Pasteurpipetten
1,5 ml, Mikrofugeröhrchen
, Nagellack			klare oder farbige
P20-Mikropipette und Kunststoffspitzen
, Büroklammern			20 - 25 Standard-Büroklammern aus Metall, die zu einer Form verbunden sind. chain
Reagenzien
16% EM-Qualität Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie-Reagenzien
Essigsäure	Sigma
Flüssigstickstoff
100% Ethanol, chemische Qualität
Kommerziell synthetisierte, fluoreszenzmarkierte Oligos
Lange biotinylierte Sonde	Invitrogen; Alternative Schritte 2.7.1-2.7.3		z. B. Nick translatiert und biotinyliert mit BioNick von Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Alternative Schritte 2.7.1-2.7.3		für den Nachweis von langer biotinylierter Sonde
Hybridisierungspuffer	Rezeptur über
4x SSCT	Rezeptur über		Kochsalz-Natriumcitrat + Tween
0,1x SSC	Rezeptur über		Kochsalz-Natriumcitrat
Blockierungslösung	Rezept über
SBT	Rezept über Rezept über		SSC, Rinderserumalbumin, Tween
1x PBT	Rezeptur über		phosphatgepufferte Kochsalzlösung + Tween
1x PBS			phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Hypotonische Lösung			0,5% Natriumcitrat in H2O
Formamid	Sigma Aldrich
Vectashield Eindeckmedium mit DAPI	Vektor Laboratorien