Methodenartikel

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

DOI:

10.3791/52310

⸱

21. Januar 2015

 , 
1Center for Pain Research, Department of Anesthesiology, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat

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Zusammenfassung

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Dieses Video zeigt im Detail ein in vitro-Einzelfaser elektrophysiologische Ableitung Protokoll mit einer Maus Kolorektums-Nerven Vorbereitung. Der Ansatz ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einzelner kolorektalen Afferenzen. Extrazelluläre Ableitungen von propagierten Aktionspotentiale (APs), die von einem oder wenigen afferenten stammen (dh Einzelfaser) rezeptiven Felder (RFS) in Kolorektum aus gehänselt Nervenfaser Faszikel gemacht. Die Kolorektums ist entweder mit dem Becken (PN) oder Lenden splanchnischen (LSN) Nerven befestigt und in Längsrichtung geöffnet entfernt. Das Gewebe wird in einer Aufnahmekammer gebracht, fixiert flach und mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Lösung perfundiert. Brenn elektrischen Stimulation verwendet, um die kolorektale afferenten Endungen, die durch drei verschiedene mechanische Stimuli getestet lokalisieren (blunt Sondieren, Schleimhaut Streichen und Umfangsdehnung) funktionell zu kategorisieren Afferenzen in fünf mechanosensitive Klassen. Endings Reaktion auf keine dieser mechanische Reize werden als mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) kategorisiert. Sowohl mechanosensitive und MIAs kann Sensibilisierung (dh, verbesserte Reaktion, reduziert Schwelle und / oder Erwerb von Mechanosensitivität) bewertet werden, indem die lokale Exposition des RFs Chemikalien (zB entzündliche Suppe (IS), Capsaicin, Adenosintriphosphat (ATP)). Wir beschreiben die Geräte und Kolorektums-Nerven Aufnahme Vorbereitung, Ernte Kolorektums mit angeschlossenem PN oder LSN, die Identifizierung von RFs im Kolorektums, Einzelfaser-Aufnahme von Nervenfaszikel und lokalisierte Anwendung von Chemikalien auf die RF. Außerdem werden Probleme der Herstellung und Anwendung von standardisierten mechanischen Stimulation ebenfalls diskutiert.

Einleitung

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Schmerzüberempfindlichkeit sind die vorherrschenden Beschwerden von Patienten mit funktionellen gastrointestinalen Störungen einschließlich Reizdarmsyndrom (IBS), die in Abwesenheit des sichtbaren pathobiologischen Ursache oder Gewebeschäden vorliegen. Zum Beispiel weisen IBS-Patienten Überempfindlichkeit, einschließlich erhöhter Antworten auf rektale Ballon Spannungsgefühl und erhöhte Empfindlichkeit während des normalen Darmfunktion sowie Überempfindlichkeit der somatischen Weisung (dh Druckschmerz im Bauchbereich) 1. Da Targeting kolorektalen Afferenzen hat sich als wirksam bei der Linderung von Schmerzen und Überempfindlichkeit in IBS-Patienten (zB intrarektale Einträufeln von Lokalanästhetika 2,3; orale Aufnahme des Guanylatzyklase-C-Agonisten linaclotide 4-6) sein, ein besseres Verständnis der afferenten Innervation Kolorektum ist wichtig.

Visceral Afferenzen, darunter Dickdarm- AfferenzenIn der Lage sind zu reagieren, um chemische / Nähr- und thermischen Behandlungsformen (zum Beispiel 7-9). Allerdings viszerale Afferenzen Reaktion auf mechanische Reize (dh mechanosensitive Afferenzen) waren die am besten untersuchte, weil mechanische Reize (zB Lumen Blähungen, Dehnung) sind diejenigen, die in der Regel führen zu bewussten Empfindungen, einschließlich Beschwerden und Schmerzen 10-16. Darüber hinaus werden die Eingeweide auch mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) innerviert, allgemein als stille oder Schlaf Nozizeptoren 17. Unter normalen physiologischen Bedingungen, müssen MIAs nicht auf mechanische Reize reagieren und haben eine sehr hohe Ansprechschwellen 18, sondern kann aktiv werden und erwerben Mechanosensitivität in pathophysiologischen Bedingungen und dazu beitragen, Überempfindlichkeit.

Unter Verwendung der in vitro Herstellung und hier beschriebene Protokoll, entwickelt und verwendet ein elektrisches Stimulus-Strategie in See wir rch für aufnahmeEnden und ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung der beiden mechanosensitive und MIA Enden in der Kolorektums 19. Das kolorektale Innervation aus Lenden splanchnischen (LSN) und Beckennerv (PN) Wege abgeleitet und enthält kolorektalen Afferenzen, die in fünf mechanosensitive Klassen (seröse, Schleimhäute, muskulös, Muskel-Schleimhaut, mesenterialen) und eine MIA-Klasse 20 eingestuft werden können. Mit dieser In-vitro-Vorbereitung, fanden wir, dass kolorektalen MIAs erworben Mechanosensitivität (Sensibilisierung) nach kurzzeitiger ihres rezeptiven Felder zu einer entzündlichen Suppe (IS), die 71% der MIAs in der PN-Bahn und 23% der MIAs im LSN Weg sensibilisiert 19. Wir haben auch dokumentiert Langzeitsensibilisierung (bis 28 Tage) von MIA in Zusammenhang mit langanhaltenden Verhaltens viszerale Hypersensitivität (dh in Mäusen intrakolische Behandlungen mit Zymosan 21 oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 22) .

jove_content "> Unter mechanosensitive Afferenzen, muskulös und Muskel-Schleimhaut-Afferenzen sind die einzigen Klassen, die tonisch kodieren Umfangsdehnung des colorectal (dh sind Stretch-und Kleinschreibung) und dienstbar die Kodierung der schädlichen kolorektale Dehnung 23,24. Mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftaktuator wir mit einem Standard, homogene und reproduzierbare gefahren Dehnung in der Umfangsrichtung des abgeflachten kolorektales Gewebe und weiter kategorisiert dehnungsempfindlichen Afferenzen als Niedrigschwellenwert und hohem Schwellenwert 23. Darüber hinaus den Zeitverlauf der Sensibilisierung von Dehnungs sensitive Afferenzen nach intrakolische Zymosan 21 oder TNBS 22 Behandlung entspricht der Beginn, Ausdauer, und / oder Wiederherstellung von Verhaltens viszerale Hypersensitivität, was auf eine Rolle von Dehnungsempfindlichen Dick Afferenzen in viszeralen Schmerzen und Überempfindlichkeit.

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Protokoll

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HINWEIS: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der University of Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Herstellung von modifiziertem Krebs-Lösung und Test-Arzneimittel Aliquots

  1. Make 6 L modifizierte Krebs-Lösung, die (in mM) enthält: 117,9 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 11.1 D-Glucose, 2 Natriumbutyrat 20 Natriumacetat , 0,004 Nifedipin (spontane Muskelkontraktionen blockieren) und 0,003 Indometacin (die Synthese von endogenem Prostaglandin blockieren). Verwenden eiskalt und warmen Krebs Lösungen für Gewebedissektion und Einzelfaser-Aufnahme auf.
  2. Bereiten keine chemischen Lösungen (zB, IS, Capsaicin, ATP) in Aliquots bei gewünschten Konzentrationen.

2. Dissektion der Kolorektums-Nervengewebe

  1. Betäuben und euthanize männliche Mäuse (6 - 8 Wochen alt, 20 - 30 g) inein CO 2 Kammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die mit 10 verdrängt - 30% des Kammervolumens pro Minute bis Mäusen atmen aufhören vollständig wie durch das Fehlen von Brustbewegung angegeben.
  2. Unmittelbar nach Euthanasie, exsanguinate durch Aufschneiden der Thoraxkammer, Perforation des rechten Vorhofs und das Eintauchen der Maus Karkasse in einem großen Volumen (~ 500 ml) eiskaltem Krebs (4 ° C) Lösung geblasen mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2).
  3. Alle inneren Organe, sondern auch die Dickdarm-und Beckenorgane vorsichtig entfernen. Transekt mit der Maus in die Hälfte über dem Wirbelsegment T12 leicht über dem Zwerchfell und übertragen Sie die Schwanz Hälfte zu einer Dissektion Kammer, eiskalt, sprudelte Krebs-Lösung.
  4. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie die Blase und die Fortpflanzungsorgane durch Durchtrennung an ihren Verbindungsstellen an der Harnröhre, und entfernen Sie den absteigenden / Bauchaorta, bis sie in gemeinsamen Beckenarterien gabelt. Befreien Sie den PN oder die LSN von ihren surrounding Gewebe stumpf und folgen Sie den Nerv von außerhalb des Beckenkamm bis zu seiner ventralen Einstieg in die L6 und S1 Wirbelsäule (PN) oder T13 und L1 Wirbelsäule (für LSN).
  5. Schneiden Sie die Symphyse und rechts und links Pfannen Gelenke, und entfernen Sie das Darmbein. Sorgfältig kostenlos entweder die PN oder LSN aus dem beigefügten Muskels und des Bindegewebes aus der Nähe des colorectal, bis wo der Nerv in die Wirbelsäule.
  6. Sorgfältig Resektion des Darmbein, um den distalen Kolorektums aussetzen. Präparieren Sie die distale Kolorektums mit dem angebrachten PN oder LSN im Kontinuum.
  7. Übertragen Sie die Kolorektums mit dem Nerv in das Bad Fach der Gewebekammer angebracht. Überschüssiges Bindegewebe durch weitere Dissektion, und öffnen Sie die Kolorektums Längsrichtung entlang des Anti mesenterialen Grenze.
  8. Mit Schleimhautseite nach oben, stecken Sie die mesenterialen Rand des Kolorektums neben dem Aufnahmeraum in die Silikonbasis der chamber und befestigen Sie den antimesenteriale Länge des Kolorektums an einen Rake von Haken mit einem Kraftstellglied verbunden (in Abbildung 1 veranschaulicht und in 2A fotografiert).
  9. Erweitere PN oder LSN in die Aufnahmefach, das zu dem Bad Raum durch eine Mausloch und dem Gate verbunden ist. Legen Sie vorsichtig den Nervenstamm auf einen kleinen Glasspiegel im Aufnahmeraum, der eine hydrophile Oberfläche für den Mut, zu halten bietet. Superfuse das Baderaum mit warmem (30 bis 32 ° C), mit Sauerstoff angereicherte Krebs-Lösung und füllt die Aufnahmefach mit Mineralöl.

3. Einzelfaser-Aufnahme und Lokalisierung der rezeptiven Feld

  1. Schieben Sie vorsichtig die Epineurium (Nervenscheide) der PN oder LSN unter dem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung (50 - 60X). Mit einer feinen Pinzette, necken den Nervenstamm in 5-8 Nervenbündel von ~ 100 & mgr; m Dicke.
  2. Legen Sie die Platin-Iridium-ReferenzElektrode in Kontakt mit dem Krebs-Lösung in das Gewebe Kammer. Sequentielles Platzieren der einzelnen Nervenbündel auf die Aufzeichnungselektrode aus dem gleichen Material hergestellt.
  3. Mit einem weichen Pinsel, um APs von den Dick Afferenzen durch sanft streichelte oben und unten der kolorektalen Oberfläche hervorrufen. Suchen Sie den Nervenbündels (n), die den Doppelpunkt durch nachweisbare AP (Aktionspotential) Aufnahmen innervieren.
    HINWEIS: Die PN und LSN auch die Harnblase und andere Beckenorgane innervieren.
  4. Verwenden Sie ein Paar 30 G Nadelspitzen weiter zu spalten die Nervenbündels in feine Faszikel Filamente ~ 10 & mgr; m Dicke und legen Sie einen individuellen Filament auf die Aufzeichnungselektrode.
  5. Legen Sie die rund Spitze konzentrischen Elektrode senkrecht zur Schleimhautoberfläche zu afferenten Enden am Überschwellenreizstärke (10 mA Stärke, 0,5 ms Dauer @ 0,3 Hz), die eine mm Radius von aktuellen Ausbreitung ~ 2 produziert elektrisch erregt. Bewegen Sie den Elektroden systematisch (~ 1,5 mm Schritten) Entlang der Länge und Breite des abgeflachten colorectum empfänglich Digungen lokalisieren.
  6. Wenn ein afferenten Ende ist aufgeregt, stellen Sie die Elektrodenposition, um den Ort der Aktivierung (rezeptiven Feld, HF), die minimale Reizstärke (Reizschwelle) erfordert genau zu bestimmen. Entsorgen Enden mit einer Reizschwelle> 3 mA 19.
  7. Berechnen der Leitungsgeschwindigkeit (CV) von 1) der Abstand zwischen der Stimulationselektrode an dem Empfangsfeld (RF) und der Aufzeichnungsstelle, und 2) die Leitungsverzögerung (zB, 2B) zwischen dem Reizartefakt und dem Einsetzen des Aktionspotentials .
    CV (m / sec) = Abstand (mm) / Leitungsverzögerung (msec).

4. Funktions Einstufung mechanosensitiven Colorectal Afferenzen

  1. Nach dem Auffinden eines RF durch elektrische Stimulation, gelten die folgenden drei mechanische Reize an den HF:
    1. Führen Sie die Sondierung Reiz, indem Sie die Spitze eines calibrated von Frey-like Nylonmonofilament (0,4 und 1 g Kraft), die senkrecht auf die RF auf der abgeflachten Kolorektums.
    2. Führen Sie den Reiz von streichelte sanft streichelte den kolorektalen Schleimhaut mit einer feinen Nylonfaden Strang (10 mg Kraft), eine kleine Oberflächenscherspannung an der RF zu erzeugen.
    3. Führen Sie die Umfangsdehnung mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftantrieb, die eine rampenförmige Strecke Kraft liefert (0-170 mN bei 5 mN / sec) in Umfangsrichtung entlang der Anti mesenterialen Rand des Kolorektums über den Rechen des in Schritt 2.8 beschrieben Haken .
  2. Bewerte Afferenzen als Serosa (reagieren nur auf stumpf Sondieren), Schleimhaut (reagieren auf Schleimhaut streicheln und stumpf Sondieren), muskulös (zum Umfangsdehnung reagieren und stumpf Sondieren) Muskel / Schleimhaut (zum Umfangsdehnung, Schleimhaut Streicheln reagieren und stumpf Sondieren), oder MIA (nicht in Reaktion auf jede der drei mechanischen Reizen).
  3. Für mesenterialen Afferenzen (nur indie LSN Innervation), die schwierig sind, um selektiv durch elektrische Stimulation zu aktivieren, suchen ihre rezeptiven Enden durch mechanische Streicheln / Sondierung des Mesenteriums.
  4. Für Stretch-sensitive Afferenzen (Muskel-und Muskel-Schleimhaut), bestimmen die Ansprechschwelle, die als die Kraft, die die erste AP während der geneigte Strecke erinnert definiert ist.
  5. Für serösen Afferenzen, notieren ihre Antworten auf aufsteigend Ebenen der punktförmige Sondieren des rezeptiven Feldes durch die computergesteuerte Kraftstellglied angetrieben.

5. Chemische Anwendung / Modulation der Empfang Endings

  1. Zeichnen Sie eine Baseline-Reaktion auf einen mechanischen Reiz (dh Reaktion auf geneigten Strecke, punktförmige Sondieren oder Schleimhaut Streicheln).
  2. Bestreichen Sie die Unterkante eines Schlauchstück (Messing oder Edelstahl, 10 mm Höhe und 4 x 4 mm 2 quadratisch oder 4-5 mm Durchmesser) mit Vaseline und legen Sie es über dem rezeptiven Feld auf der Kolorektums.
  3. Entfernendie Krebs-Lösung im Inneren des Schlauchs, und setzen die aufnahme Endung für 3 - 5 min zu 170 ul der Lösung, die die Chemikalie (n) zu prüfen.
  4. Beobachten Sie die Reaktion des afferenten bei der chemischen Anwendung (einige Afferenzen sind chemosensitiven).
  5. Entfernen Sie die chemische Lösung und die Schläuche, die Wirkung der chemischen beenden. In 4 - 6 min, testen die afferenten Reaktion auf denselben mechanischen Stimulus, wie in der Grundreaktion.
  6. Wenden Sie die mechanischen Reiz wieder nach ausreichenden Zeitraum Auswaschen (> 15 min).

6. Aufnahme und Diskriminierende AP Spikes

  1. Digitalisieren der elektrischen Signale von Axonen bei 20 kHz aufgenommen und speichern Sie die Daten auf einen Computer. Überwachen Sie die Signal online durch eine Audio-Überwachung.
  2. Analysieren Sie die AP Spitzen off-line und diskriminieren einzelne Einheiten basierend auf der Hauptkomponentenanalyse einzelner Dorn 25 Wellenformen.
    HINWEIS: Ein Datensatz sollte nicht mehr th enthaltenein zwei leicht unterscheidbar aktiven Einheiten.

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Ergebnisse

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Der Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt ist. Es umfasst eine maßgeschneiderte Gewebekammer, die die colorectum in einem Silikon-Bad ausgekleideten Kammer und der beigefügten Nerv in einem zusammenhängenden Mineralöl gefüllten Abteil untergebracht ist. Die Zwei-Kammer-Kammer wurde aus einem massiven Block aus Acrylkunststoff mit einer CNC-Maschine bearbeitet; der Boden der beiden Kompartimenten wurde anschließend mit festen Silikon ausgekleidet, um einfach Stift nach unten des kolorektalen Gewebe ermög...

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Diskussion

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Die hier beschriebene in vitro-Nerven Kolorektums Vorbereitung hat sich als leistungsfähiges Konzept für neuronale Kodierung Funktionen einzelner kolorektalen Afferenzen, die schön ergänzt andere nicht-funktionale Ansätze (zB Zell-, Molekular- und histologische Untersuchungen) auf viszeralen sensorischen Neuronen (studieren siehe Bewertung 27 für Details). Neuronalen Mechanismen Beitrag zur Nozizeption und langfristig colorectal Überempfindlichkeit festgestellt worden sind und pharmakologisc...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Unterstützt durch den NIH-Preis R01 DK093525 (GFG). Wir schätzen die wissenschaftliche Überprüfung und grammatikalische Bearbeitung des Manuskripts durch Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) sehr und danken Michael Burcham für die Unterstützung bei der Erstellung der Abbildungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Stereomikroskop Leica MZ16Leica Microsystems Inc.
Leica IC D KameraLeica Microsystems Inc.
VerstärkerWorld Precision Instruments, Inc.SYS-DAM80Rauscharmer Differenzverstärker
Zweikammer-GewebekammerSonderanfertigung
Power1401Cambridge Electronic Design LimitedPower1401Datenerfassung, analoger Signaleingang/-ausgang
Spike2 v5.02Cambridge Electronic Design LimitedSoftwarepaket, das mit dem Power1401
AudiomonitorNatusAm funktioniert
RechteckpulsstimulatorNatusS48Zur Abgabe elektrischer Reize
Photoelektrische IsolationseinheitNatusPSIU6Stimulusisolierung zur Reduzierung des Rauschens
Konzentrische bipolare MikroelektrodeFHC Inc.CBFFG75Zur Abgabe elektrischer Reize
Dual-Mode-HebelsystemAurora Scientific Inc.Serie 300CZur Abgabe mechanischer Reize
PinzettenFine Science Tools11252-00Pinzetten mit feinen Spitzen
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Referenzen

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Elektrophysiologie von EinzelneuritenPr fung der mechanischen StimulationBewertung der chemischen Sensitivit tIdentifizierung des rezeptiven FeldesDissektion von NervenfasernPerfusion mit Krebs L sungAufzeichnung von Aktionspotenzialenmechanosensitive KlassifizierungApplikation von Inflammatory Soup

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