Das Ziel dieser Technik ist es, Forschern die Möglichkeit zu geben, Puppenaugenscheiben jeden Alters zu dissektionieren, Immunfärbung und Montage von Puppenaugenscheiben durchzuführen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Augenscheibe von Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges System, mit dem viele verschiedene biologische Prozesse untersucht werden können. Es enthält etwa 800 separate Augeneinheiten, die als Ommatidien1 bezeichnet werden. Jedes Ommatidium enthält acht neuronale Photorezeptoren, die sich aus undifferenzierten Zellen entwickeln, nachdem die morphogenetische Furche im dritten Larvenstadium2 passiert ist. Nach der sequentiellen Differenzierung der Photorezeptoren entwickeln sich nicht-neuronale Zellen, darunter Zapfen- und Pigmentzellen sowie mechanosensorische Borstenzellen3. Abschließende Differenzierungsprozesse, einschließlich der strukturierten Anordnung aller ommatidialen Zelltypen, des programmierten Zelltods undifferenzierter Zelltypen und der Rhodopsin-Expression, erfolgen in der Puppenphase4-7. Diese Technik konzentriert sich auf die Manipulation der Puppenaugenscheibe und bietet Einblicke und Anweisungen, wie die Augenscheibe während der Puppenphase zu präparieren ist, was von Natur aus schwieriger durchzuführen ist als die üblicherweise präparierte dritte Augenscheibe. Diese Technik liefert auch Details zur Immunfärbung, um die Visualisierung verschiedener Proteine und anderer Zellbestandteile zu ermöglichen.
Einleitung
Drosophila melanogaster: Die Felder der Entwicklungs- und Zellbiologie wurden stark von der Modellorganismus beeinflusst. Bei diesem Modell haben Studien des Auges Disc viel Wissen über Signalisierung, Zellbiologie und anderen Bereichen beigetragen. Die späten dritten Larvenstadium Auge Disc wurde ausgiebig untersucht und ist ein leistungsfähiges Modell zu nutzen, da es eine Momentaufnahme aus einer Reihe von Entwicklungsperioden, jede mit ihrer eigenen einzigartigen Signalmoleküle und Prozesse, wie der morphogenetischen Furche fortschreitet über das Auge Disc 8. Es besteht jedoch ein Bedarf für unser Verständnis von Entwicklungsprozessen weiter ausbauen in den Puppenentwicklungsphase. Zwar gab es auf der Puppenaugenscheibe 3-7 wurden Studien, unser Wissen nicht nähern die Breite der Arbeit, die auf dem dritten Larvenaugenscheibe durchgeführt worden ist. Dies liegt zum Teil an die größere Schwierigkeit der Zerlegung des Puppenaugen Disc. Daher ist eine Präsentation derrichtige Methode der Präparation konnte erheblich erweitern Forschung in diesem Bereich.
Zwar gibt es Stufen innerhalb Puppenaugenscheibe Entwicklung, die leicht zerlegt werden, insbesondere um die Mitte des Puppenperiode, sind andere Zeiträume viel schwieriger zu sezieren. Das Protokoll stellt ein Verfahren zum Präparieren Puppenaugenscheiben, die universell für alle Puppenentwicklungszeitrahmen verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann als eine Alternative zu einem anderen Protokoll 9, die eine einfachere und schnellere Methode zur Augenscheiben von den Zeitpunkten, zu sezieren midpupal zeigt verwendet werden. Dieses Protokoll wurde ursprünglich gefilmt und für die Ausbildung fortgeschrittene Studierende in der UCLA Undergraduate Research Consortium in Functional Genomics (URCFG) 10,11 in der Technik der Puppenaugen Dissektion entwickelt. Viele Studenten waren in der Lage, um dieses Video und Verfahren zu nutzen, um diese anspruchsvolle Technik zu erlernen.
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Protokoll
Dieses Verfahren ist einen 2-tägigen Verfahren.
Tag 1 (2 HR + Sezieren Zeit)
1. Pupal Eye Disc Dissection
- Wählen Sie eine Puppe für die Präparation.
HINWEIS: Das Alter der Puppe zu seziert werden durch die experimentellen Bedürfnisse ermittelt werden. Wenn jedoch die Prüfung der Zellmorphologie, wird dies häufig bei 42 h nach Pupariumbildung (APF) bei 25 ° C, die das Alter der in der Video gezeigt Puppen durchgeführt wird. Sammeln weißen Puppen (als 0 hr APF) mit einem angefeuchteten Pinsel und ordnen sie in chronologischer Reihenfolge (basierend auf Sammelzeit) in einer neuen Fliege Essen Fläschchen bei 25 ° C gehalten. Präparieren Sie die im Alter von Puppen in diesem gleichen chronologischen Reihenfolge, um die Zeitunterschiede zwischen Puppen so nah wie möglich zu halten. - Übertragen Sie die Puppe in einen Tropfen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4, siehe Materialien für Rezept) auf einem Silikon Seziersaal Platte.
- Halten Sie die Spitze der Puppenhülle mit einer Pinzette und Pierce und öffnen Sie die lower Teil der Puppenhülle mit einem Paar von scharfen Pinzette. Entfernen Sie die Puppe von der neu gegründeten Loch Fall.
- Einen Diagonalschnitt mit einer Schere, mid-Thorax, in der Puppe. Entfernen Sie den Fremdkörper oder überweisen Sie den Puppenkopf zu einem neuen Tropfen PBS. Sauber mit der Pipette Blasrohr (siehe Materialien und Abbildung 1 für Details) und zusätzliche PBS nach Bedarf. Achten Sie darauf, um Austrocknung zu vermeiden.
- Sicher zu greifen die Besten der Puppenkopf Kutikula mit einer Pinzette. Mit der Spitze des Blasrohr, schieben auf der Puppenhülle, um das Gehirn und anderen Geweben, einschließlich der Augenscheiben, aus der Puppenhülle zu extrudieren. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, greifen jedes Gewebe innerhalb der Nagelhaut.
- Mit dem Blasrohr mit PBS gefüllt, blasen das Fett Körpergewebe und andere Verunreinigungen aus dem Kopf Fall klar zu trennen und identifizieren die Gehirn und Auge-Discs.
HINWEIS: Halten Sie das Gehirn an den Puppenkopf Gehäuse angebracht wird es der Forscher auf die Verwendung erad Fall als "Griff" für zukünftige Manipulation des Gewebes, ohne die Augenscheiben oder Gehirn. Jedoch ist es üblich, das Gehirn und Augen Scheiben vom Kopfgehäuse zu entfernen und dies ist nicht schädlich für das Gesamtverfahren und Ergebnisse. Es dauert oft mehrere Versuche von Treib und schob die Augenscheiben und Gehirn aus dem Puppenkopf Fall und so, dass sie sich deutlich von umliegenden Gewebe erfolgreich zu extrahieren. Die saubere und getrennte man die Augenscheiben aus dem umgebenden Gewebe zu helfen zu verhindern äußerem Gewebe von Befestigung an der Augenscheiben. - Nach Dissektion, sofort das Gewebe übertragen, um einem 3 gut Glasschale auf Eis mit 0,5 ml Fix-Lösung (siehe Materialien). Float das Gewebe auf der Oberfläche der Fixier-Lösung für einige Minuten (typischerweise der Zeit, die für die nächste Reihe von Augen Scheiben zu zerlegen).
HINWEIS: Ist das nicht das erste Auge Disk in dieser Runde der Dissektion, completel seziert werdeny tauchen die vorherige Augen Disc in den Fix-Lösung. Wenn für besondere Färbeverfahren (zB reaktive Sauerstoffspezies, Lysosomen, etc.) muss dies vor der Fixierung durchgeführt werden. Um dies zu tun, vor der Fortsetzung mit dem entsprechenden Färbungsprotokoll speichern die seziert Augenscheiben in eiskaltem PBS. - Nach Präparation und Untertauchen aller Augenscheiben seziert, bewegen Sie den 3 gut Glasschale auf einer Wippe und Rock bei Raumtemperatur für 30 min.
2. Immunfärbung
- Entfernen Sie vorsichtig das Fix-Lösung und 0,5 ml PBS mit 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, siehe Materialien) und waschen Sie das Gewebe auf einer Wippe für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal für insgesamt vier Waschvorgängen (je 10 min).
HINWEIS: Die sorgfältige Entfernung der Lösung aus der Quelle unter einem Präpariermikroskop zu Gewebeschäden oder Verlust zu verhindern, durchgeführt werden. Die Lösung kann vorsichtig mit einer Pipette angesaugt werden; bevorzugen wir eine fein Tipped, Einmaltransferpipette, die die Öffnung abgeflacht ist, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern Absaugen Gewebe hatte. - Am Ende des 4. waschen, entfernen Sie die Wasch- und 0,5 ml Blocklösung (siehe Materialien), um den Brunnen und Inkubation für 30 min.
Hinweis: Dieser Zeitrahmen kann nach Ihren Bedürfnissen erweitert werden. - Am Ende der 30 Minuten Blockzeit, Pipette 10 ul Primärantikörperlösung (in Block-Lösung verdünnt) in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte.
HINWEIS: Eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte wird über 4 Paar Augenscheiben zum Puppenhülle angebracht oder 8 isolierte Paare von Augenscheiben mit Köpfchen befestigt zubringen. Die primären Antikörper in diesem Protokoll für die repräsentative Daten verwendet werden, sind Anti-Phosphotyrosin (1: 500 Verdünnung) und Anti-Cut (1: 200 Verdünnung). - Übertragen Sie die sezierten Gewebes in die Mikrotiterplatte Wells mit dem primären Antikörper-Lösung aus der 3 gut Glasschale gefüllt.
- Ortder Mikrotiterplatte auf einem befeuchteten Papiertuch in einem leeren Pipettenspitze Box (oder andere ähnliche Behälter) und bei 4 ° C über Nacht (um eine Austrocknung zu verhindern).
Tag 2 (4 h + Montagezeit)
- Übertragen Sie das Gewebe aus der Mikrotiterplatte auf ein neues 3 gut Glasschale mit 0,3% PBT (≈0.5 ml) und waschen Sie das Gewebe für 10 Minuten auf der Wippe. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal für insgesamt vier Waschvorgängen (je 10 min)
- Entfernen Sie die letzten Wasch und 0,5 ml Block-Lösung zum Brunnen. Block für 30 min.
Hinweis: Dieser Zeitrahmen kann nach Ihren Bedürfnissen erweitert werden. - Entfernen Sie die Block-Lösung und 0,5 ml des Sekundärantikörperlösung zum Brunnen (von fluoreszenzmarkierten entsprechend Ihrer primären Antikörper und Fluoreszenzwellenlänge, in Block-Lösung verdünnt Antikörper hergestellt) und zum Schutz der 3 gut Glasschale von Licht mit einem Deckel oder Aluminium Folie und Inkubation für mindestens 2 Stunden bei RaumTemperatur.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten in ähnlicher Weise von Lichtexposition geschützt werden. Diese Inkubation kann über Nacht bei 4 ° C erweitert werden, in einem Setup ähnlich wie der primäre Antikörper Inkubation, aber es kann auch in einem 3 gut Glasschale mit Labor-Film oder eine Mikrotiterplatte, wenn Antikörper Erhaltung gewünscht abgedeckt durchgeführt werden. - Am Ende der Antikörper-Inkubation, entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und 0,5 ml von 0,3% PBT zum Brunnen und Wäsche auf der Wippe für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 4 Wäschen (jeweils 10 Minuten).
HINWEIS: Wenn DAPI-Färbung gewünscht wird, vor dem Start der ersten Wäsche, fügen 0,5 ul DAPI-Stammlösung (siehe Materialien) zu den 500 ul PBT, die für die erste Wäsche verwendet wird (1: 1000 Verdünnung).
3. Montage
- Am Ende der letzten Waschung montieren anten / Augenscheiben auf einem Objektträger mit 70% Glycerin oder PBS als Medium, um die br entfernenain und anderen unerwünschten Gewebe in einem Pool auf einer Seite der Folie.
- Das Gewebe vorsichtig bewegen Sie mit hydrostatischen Druck zwischen den Zangen, oder sehr vorsichtig mit einem Zangenspitze, und richten Sie die Augenscheiben in einer Kolonne in Richtung der Mitte des Schlittens.
- Entfernen Sie alle Fremd Glycerin oder PBS aus der ganzen Gewebe (mit Dochtwirkung eines Laborwischtuch oder die Zange arbeiten für diese).
- Legen Sie eine kleine Menge (≈10 ul) Montagemedium entlang einer Seite des Auges Disc Spalte und setzen Sie ein Deckglas auf das Gewebe, um so die Montagemedium auf das Auge Scheiben verteilen.
- Lassen Rutsche sit für 1 bis 2 min, damit das Gewebe / Montagemedium vollständig auszubreiten.
- Wischen Sie zusätzliche Montagemedium weg von den Rändern des Deckglases und verschließen Sie diese mit klarem Nagellack.
- Erfassen Fluoreszenzbilder der Augenscheiben mittels konfokaler Mikroskopie.
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Ergebnisse
Als Beispiel für die Verwendung dieses Protokolls, Ergebnisse darstellt midpupal (42 Std APF bei 25 ° C) Augenscheiben mit unterschiedlichen Antikörpern immungefärbt sind in Abbildung 2 Durch Verwendung eines gegen Phosphotyrosinreste gerichteten Antikörper präsentiert, kann die Membran der Zellen (Abbildung 2A). Dies kann verwendet werden, um die regelmäßige Anordnung der Ommatidien Zellen im Puppenauge identifizieren folgenden endgültigen Strukturierungsprozessen, die vor der midpupal Stufe auftritt. ...
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Diskussion
Obwohl es den Anschein hat, dass der Prozess einfach und leicht durchzuführen ist, erfordert diese Technik in Wirklichkeit viel Übung, um sie zu beherrschen. Routinemäßig beginnen wir damit, dass wir lernen, die dritten Augenscheiben12 zu präparieren und zu montieren, mit denen viel einfacher zu arbeiten ist. Diese Praxis trägt dazu bei, eine angemessene Präparierposition der Arme, Hände und Finger13 zu entwickeln, so dass die Handhabung der Pinzette unter dem Präpariermikroskop stabil, leicht und...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir schätzen und möchten dem Howard Hughes Medical Institute für den HHMI Professor Award an U.B. danken, der dieses Projekt möglich gemacht hat. Wir danken dem College an der University of California, Los Angeles, für die Bereitstellung von Einrichtungen und die Unterstützung der Lehrinfrastruktur für diese Arbeit. Die Arbeit wurde auch mit Mitteln der Midwestern University und einer großzügigen Spende des Charity Fidelity Gift Fund unterstützt. Wir danken John VandenBrooks für die Kommentare zum Manuskript und Krista Pearman für ihre technische Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Lautstärke auf 1 μ l, pH-Wert auf 7,4 einstellen, autoklavieren oder filtrieren, vor Gebrauch mit autoklaviertem ddH2O auf 1x PBS verdünnen. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Achtung: Reizend! Tragen Sie Handschuhe. |
| 0,3 % PBT | , 1,5 ml Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37%ige Formaldehydlösung | Fisher Scientific | F75P1GAL | Achtung: Giftig, wahrscheinlich krebserregend für den Menschen! Tragen Sie Handschuhe. |
| Lösung | fixieren(≈ 4% Formaldehyd in PBS) 50 μ l davon 37% Formaldehyd, 450 μ l 1x PBS, vor Gebrauch frisch machen | ||
| Normales Ziegenserum | Rockland Antikörper & Assays | B304 | Aliquot in 1 ml Volumen und lagern bei -80 ° C |
| Blocklösung | 10% NGS in PBT. Dies kann bei 4 & Grad hergestellt und gelagert werden; C für einige Tage vor der Anwendung. | ||
| DAPI-Stammlösung | Life Technologies | D3571 | Für die Coutnerfärbung von Zellkernen. Bereiten Sie eine Lösung von 1 mg/ml mit ddH2O vor. |
| VectaShield Eindeckmedium | Vector Labs | H-1000 | Eindeckmittel |
| Glycerin | Sigma | G5516 | Zum Einbetten. Bereiten Sie eine 70%ige Verdünnung mit ddH2O vor. |
| Ausrüstung | |||
| Nutationsmischer | VWR | 82007-202 | Wird verwendet, um Gewebe in einer 3-Well-Glasschale |
| zu rocken SylGard 182 Silikonelastomer-Kit | Krayden | NC9897184 | Wird zur Herstellung von Silikon-Sezierschalen |
| Silikon-Präparierschale | verwendetMischen Sie das Sylgard-Elastomer-Kit (oben) gemäß den Anweisungen vorsichtig (um Blasen zu vermeiden). Gießen Sie die Mischung in die Petrischale (beliebige Größe). Lassen Sie SylGard über Nacht bei 37 & Grad aushärten. C Inkubator. | ||
| 3-Well-Glasschale | Corning | 7220-85 | Die 3-Well-Variante davon ist nicht mehr erhältlich, dies ist das 9-Well-Produkt. |
| 72 Well Microwell Minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp Pinzette (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-Typ Mikroschere, gerade, 5 mm | Klinge Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Kapillaren aus Borosilikatglas | World Precision Instruments | 1B100-4 | Ziehen Sie mit Nadelabzieher, um eine feine Spitze zu erzeugen, die einen kleinen Strom von PBS fließen lässt. |
| Einweg-Transferpipetten, feine Spitze | Samco Scientific | 231 | |
| Die angegebenen Schlauchabmessungen sind Innendurchmesser (ID) x Außendurchmesser (OD) x Wandstärke in Zoll | |||
| PVC-Schlauch (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Verwenden Sie diese mit gezogener Nadel, um das Gebläserohr wie in Abbildung 2 gezeigt zusammenzubauen. |
| Tygon Silikonschläuche (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silikonschläuche (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Referenzen
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- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
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- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
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