Methodenartikel

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus

DOI:

10.3791/52321

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8. Januar 2015

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1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Zusammenfassung

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Prionen sind unkonventionelle, sich selbst vermehrende proteinhaltige Partikel, die keine kodierende Nukleinsäure enthalten. Diese proteinhaltigen Samen dienen als Vorlagen für die Umwandlung und Replikation ihrer gutartigen zellulären Isoform. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass viele Proteinaggregate als selbstvermehrende Matrizen fungieren und die Faltung verwandter Proteine korrumpieren können. Obwohl Aggregate unter bestimmten Umständen funktionsfähig sein können, führt dieser Prozess häufig zu einer Störung der zellulären Proteinhomöostase (Proteostase) und schließlich zu verheerenden Krankheiten wie Alzheimer (AD), Parkinson (PD), Amyotropher Lateralsklerose (ALS) oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs). Die genauen Mechanismen der Prionenvermehrung und der Ausbreitung von Proteinaggregaten von Zelle zu Zelle sind noch Gegenstand intensiver Untersuchungen. Um dieses Wissen zu erweitern, wurde kürzlich ein neues Metazoenmodell in Caenorhabditis elegans für die Expression der Prionendomäne des zytosolischen Hefe-Prionenproteins Sup35 etabliert. Dieses Prionenmodell bietet mehrere Vorteile, da es die direkte Überwachung der fluoreszenzmarkierten Prionendomäne in lebenden Tieren ermöglicht und genetische Ansätze erleichtert. Hier werden Methoden zur Untersuchung des prionenähnlichen Verhaltens von Proteinaggregaten und zur Identifizierung von Modifikatoren der Prionen-induzierten Toxizität mit Hilfe von C. elegans beschrieben.

Einleitung

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Viele neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden mit Aggregation neigende Proteine ​​verbunden und werden daher allgemein als Proteinfehlfaltungserkrankungen (PMDs bekannt ). TSE oder Prionenerkrankungen stellen eine einzigartige Klasse von PMDs indem sie Infektions in Mensch und Tier 1 sein kann. Auf molekularer Ebene, replizieren Prionen durch die Rekrutierung und Umwandlung von monomeren α-Helix reiche Wirts kodierten zellulären PrP (PrP C) in die pathologische β-Faltblatt-reiche PrP Sc

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Protokoll

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1. Überwachung transzelluläre Verbreitung des Prion-ähnlichen Proteine ​​durch In-vivo-Zeitraffer-Imaging

HINWEIS: Wachsen C. elegans Wildtyp (WT) (N2) und transgenen Linien nach Standardmethoden und die Kultivierungstemperatur 47 sorgfältig zu kontrollieren.

  1. Gene transgenen Linien von C elegans Expression des Prion-ähnlichen Protein, mit monomeren rot fluoreszierendes Protein (mRFP) markiert. In diesem Video, das, wie man die Mikroinjektion 48 demonstriert. Weitere Details und die Methoden beschreiben, wie Sie diese extrachromosomale Linien zu integrieren, finden 49. ....

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Ergebnisse

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Überwachung interzelluläre Ausbreitung von Prionen-ähnlichen Proteinen durch In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung

Transgenen C. elegans Linien die Prion-Domäne exprimieren, sind besonders gut für die Analyse von bestimmten Aspekten der Prion-ähnlichen Proteine, zB Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität geeignet. Die Transparenz der Tiere ermöglicht Verfolgung von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​aus dem lebenden Organismus in jeder Pha.......

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Diskussion

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Die hier beschriebenen Methoden helfen, um zu veranschaulichen die Verbreitung und der komplexen Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität von Prion-ähnlichen Proteinen. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass eine Aggregation neigende cytosolische Prion-Domäne wird in membrangebundene Vesikel in einer Autophagie bezogenen Prozess übernommen. Eine spezielle Untergruppe dieser Vesikel transportiert das Prion-Domäne innerhalb und zwischen den Zellen und Gewebe 40. Der Schlüssel, um ihre Bewegung im leben.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

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Wir danken Cindy Voisine und Yoko Shibata für hilfreiche Diskussionen und kritische Kommentare zum Manuskript. Wir danken dem High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) und der Biological Imaging Facility (BIF) an der Northwestern University für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), der Ellison Medical Foundation und der Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (an R.I.M.) finanziert. C.I.N.-K. wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
Nanosphäre Größenstandards 100 nmThermoScientific3100A
LevamisolSigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
Ahringer RNAi BibliothekQuelle BioScience LifeSciences http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/nicht-säugetiere/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Ausrüstung
Sorvall Legend XTR Kühlzentrifuge, 120VACThermoScientific75004521http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96-poliger ReplikatorScionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro Inkubationsschüttler mit hoher Kapazität Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Kombi-Reagenzienspender Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automatisierte Workstation Beckman Coulterhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 ShakerNew Brunswickhttp://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04& action=Produkte& contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD-KameraHamamatsuhttp://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Konfokalmikroskop Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 Kamera Teledyne Dalsa http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Mikroskopie Automatisierung & BildanalysesoftwareMolekulare Bauelementehttp://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI BildanalysesoftwareMeyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJNIHhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck Plugin für ImageJhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans Stämme
N2 (WT)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]Morimoto-Laborin unserem Labor erhältlich 
In Tabelle 1 finden Sie eine Quelle für Faltsensor- und Stressreporterdehnungen

Referenzen

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  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....

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Schlagwörter

C elegans ModellZeitraffer Fluoreszenzmikroskopiegenomweites RNAi ScreeningWorm Tracker Analysezellautonome Toxizit tnicht zellautonome Effekteberwachung des VesikeltransportsThrashing Motilit tsassayoxidative Stressantwort

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