Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopische beeldvorming van Human Tissue secties aan de verbetering van Pathologie

Published: January 21, 2015 doi: 10.3791/52332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3,4, 5, 2, 2, 2, 2
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago, 4Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, 5Department of Nephrology, University of Illinois at Chicago
* These authors contributed equally

Abstract

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopische beeldvorming is een opkomende aanpak om gedetailleerde beelden die biochemische informatie hebben geassocieerd te verkrijgen. FT-IR imaging weefsel is gebaseerd op het principe dat verschillende gebieden van het midden-infrarood geabsorbeerd door verschillende chemische bindingen (bijvoorbeeld C = O, CH, NH) in cellen of weefsel die vervolgens kan worden gerelateerd aan de aanwezigheid en de samenstelling van biomoleculen (bv, lipiden, DNA, glycogeen, eiwitten, collageen). In een beeld FT-IR, elke pixel in het beeld omvat een volledige infrarood (IR) spectrum die informatie kan geven over de biochemische status van de cellen die vervolgens kunnen worden benut celtype of ziekte-type classificatie. In dit artikel laten we zien: hoe IR beelden te verkrijgen van menselijke weefsels met behulp van een FT-IR-systeem, hoe de bestaande instrumenten aan te passen om voor high-definition imaging-mogelijkheden, en hoe je FT-IR-beelden te visualiseren. Vervolgens geven we een aantal toepassingen van de FT-IRpathologie met de lever en nieren als voorbeelden. FT-IR beeldvorming houdt interessante toepassingen in het leveren van een nieuwe route naar biochemische informatie van cellen en weefsels in de richting van het geven nieuw inzicht in de biomoleculaire veranderingen als onderdeel van ziekteprocessen te verkrijgen in een geheel label-free geen storing veroorzaakt route. Bovendien kan deze biochemische informatie potentieel zorgen voor objectieve en geautomatiseerde analyse van bepaalde aspecten van diagnose van de ziekte.

Introduction

IR spectroscopie is een analytische tool die beschikbaar is in een of andere vorm sinds de jaren 1930; echter alleen in het laatste decennium dat het weefselgebied beeldvorming met FT-IR geëxplodeerd is. De vooruitgang in de FT-IR voor tissue beeldvorming zijn gedreven grotendeels door drie belangrijke ontwikkelingen: 1) verhoogde snelheid van data-acquisitie door de beschikbaarheid van grote Focal Plane Array (FPA) detectoren die typisch duizenden IR detectoren 1 , 2, 2) de ontwikkeling van geavanceerde algoritmen en rekenkracht om grote hyperspectrale data verwerken sets 3, en 3) het modelleren van de FT-IR-imaging systemen om ruimtelijke resolutie van 4,5 maximaliseren. Er zijn tal van hoge kwaliteit en zeer uitgebreid artikelen herziening het gebied van FT-IR spectroscopie onlangs 6-16, naast een Nature Protocols papier stappen punt spectra of kaarten uit weefsels 17 verkrijgen Details geweest. In dit artikel zullen we ons richten op de protocol om beelden van weefsels met behulp van een 128 x 128 FPA-detector in een gewijzigde FT-IR-systeem met high-definition-mogelijkheden te verkrijgen.

FT-IR imaging al lang zouden een potentieel wenselijke het weefsel- en beeldvorming als gevolg van de mogelijkheid om beelden waarin elke pixel een schat aan biochemische informatie. FT-IR imaging is gebaseerd op het principe dat verschillende biomoleculen in een monster kwantitatief verschillende gebieden van het midden-infrarood absorbeert; dit zorgt voor het afleiden van een "biochemische vingerafdruk. Deze vingerafdruk was in veel studies aangetoond veranderen tussen verschillende celtypen en ziektetoestanden. In tegenstelling tot conventionele pathologie praktijk waarbij vlekken en immunohistochemische markers moeten worden voor het visualiseren en identificeren van celsoorten en weefselstructuren die worden gebruikt voor diagnose en behandeling opties begeleiden, worden de beelden van FT-IR gevormd op basis van de inherente biochemie van het weefsel. De huidige techniqUE kleuring weefsel voor diagnose is tijdrovend, destructieve, arbeidsintensief en vereist subjectieve ervaring van de patholoog, terwijl FT-IR biedt de mogelijkheid om dit proces snelle, niet-destructieve, sterk geautomatiseerd en objectiever maken. Bovendien FT-IR verschaft een nieuwe route ter verkrijging aanvullende biochemische informatie die niet gemakkelijk toegankelijk kan zijn met gebruikelijke kleuringstechnieken.

Eén van de meest interessante ontwikkelingen in de laatste jaren heeft de beschikbaarheid van hoge resolutie beeldvormingstechnieken die nu kan zorgen voor de visualisatie en karakterisatie van celtypen en weefsels structuren die essentieel zijn voor uitgebreide ziektediagnose zijn geweest. Een van deze technieken is Attenuated totale-reflectie (ATR) FT-IR, die een solide immersie lens (SIL) van een hoge brekingsindex die zorgt voor een hoge resolutie imaging 18, met een groot aantal zeer spannende studies toont zijn toepassingen 19-25 bevat. Bovendien wzoals onlangs aangetoond dat de verhoogde ruimtelijke resolutie geassocieerd met ATR beeldvorming kan zorgen voor de visualisatie en classificatie van endotheliale cellen en myo in borstweefsel die een belangrijke component van borstkanker diagnose 26 vormen. ATR beeldvorming is zeer nuttig, deze techniek vereist dat de SIL contact met het weefsel FT-IR beelden te vormen; daarom wordt het gebruik ervan enigszins beperkt voor weefselpathologie waar grote gebieden van weefsels snel moet worden afgebeeld.

Een tweede benadering werd aangetoond door het koppelen van een hoge vergroting doel bestaande FT-IR systeem een ​​synchrotron gebruik als een heldere bron van infrarood, is het mogelijk te helderen FPA en beeld met een effectieve pixelgrootte van 0.54 x 0.54 pm. Dit liet voor ons om belangrijke structuren te visualiseren in de borst en prostaat weefsels die niet oplosbaar met behulp van conventionele FT-IR-systemen 4. Terwijl deze dramatische toename in het IR ruimtelijke resolution waren spannend, het gebruik ervan beperkt gebleven vanwege die een synchrotron. Vervolgens werd een optimaal systeem ontworpen dat ook kan zorgen voor high-definition imaging-mogelijkheden met een 1,1 x 1,1 micrometer pixelgrootte zonder de eis van een synchrotron bron maar met behulp van een traditionele globar IR bron 5. In dit artikel laten we zien hoe een bestaande commerciële FT-IR-imaging-systeem mogelijk te maken diffractie beperkte IR beeldvorming van weefsels met een acceptabel signaal-ruisverhouding met behulp van meerdere IR-doelstellingen (15X, 36X en 74X) te wijzigen. De effectieve pixelgrootte met de drie doelstellingen is 5,5 x 5,5 micrometer (15X), 2.2 x 2.2 micrometer (36X) en 1,1 x 1,1 micrometer (74X). Vervolgens hebben we een paar voorbeelden geven van het belang van de winsten in de ruimtelijke resolutie voor de ziekte van detectie in lever en nieren biopten 27.

Protocol

1. Het opzetten van een FT-IR Microscoop en verwerven Tissue Afbeeldingen

  1. Doorsnede a formaline gefixeerde in paraffine ingebed weefsel blok 4 urn dik op een compatibele IR dia met een microtoom. Afwisselend, onderdeel a vloeibare stikstof bevroren weefsel op 4 micrometer dikte op een IR-compatibel dia met behulp van een cryostaat.
    OPMERKING: Typisch zal een seriële sectie worden verkregen op een glasplaatje en gekleurd met een speciale (zoals hematoxyline en eosine (H & E)) of immunohistochemische kleuring. Bovendien kunnen gekweekte cellijnen worden gekweekt op objectglaasjes compatibele IR. IR compatibel dia's kunnen worden IR reflecterende dia's voor reflectie modus beeldvorming (bv mirrir glijbaan, goud) of IR transparante dia's voor transmissie-modus beeldvorming (bv BaF2, CaF 2).
  2. Spoel de FT-IR microscoop en spectrometer met behulp van droge lucht of droog stikstofgas om water uit de lucht uit het systeem te verwijderen. Wacht ten minste 45 minuten voor de beeldvorming aan een grondige Purg zorgene.
  3. Cool zowel de FPA detector (79 K) en de interne MCT detector in de FT-IR microscoop met vloeibare stikstof. Koel de detectoren ongeveer elke 6 uur.
    LET OP! Vloeibare stikstof is een cryogene vloeistof en kan koude brandwonden, bevriezing en in afgesloten ruimtes stikken veroorzaken.
  4. Monteer het monster dia op de microscoop podium voor FT-IR beeldvorming.
  5. Zorg ervoor dat het zichtbare licht is "ON" en vervolgens met behulp van de verrekijker of het monster capture programma (dat een zichtbaar beeld van het weefsel real-time biedt), focus op het monster.
  6. Open de bundel software pakket zoals resoluties pro en klik op 'Collect', klik op 'Diagnostiek' en selecteer vervolgens 'Align Spectrometer'. Zorg ervoor dat de bundel pad naar de spectrometer interne melder niet wordt belemmerd.
  7. Klik op 'Imaging Setup'.
  8. In het tabblad 'Electronics', selecteert u de juiste 'Speed', 'Under Sampling Ratio (UDR) 'en' Instellingen Filters ', afhankelijk van het systeem.
    OPMERKING: In dit voorbeeld is de instelling Speed ​​= 2,5 KHz, UDR = 4 en Filters = Geen.
  9. In het tabblad 'Optics' zorgen dat 'Mid-IR bron', 'Open diafragma' en '100% beam demper' zijn geselecteerd.
  10. Om het systeem, kalibreren in het tabblad 'Optics', selecteer 'Detector' als 'Ground', 'Microscoop Detector' als 'links' en selecteer vervolgens 'Transmittance' of 'Reflectie' onder 'Optics mode' afhankelijk van het type van de schuif wordt gebruikt.
  11. Klik op Setup, die zal leiden tot het venster 'Lancer Control'.
    LET OP: Voor reflectie mode te volgen instructies in 1.12 en 1.13 en voor de transmissie mode te volgen instructies in 1,14-1,16. Ga verder vanaf 1,17 voor zowel reflectie en transmissie.
  12. Voor reflectie-modus, in &# 8216; 'klik op' Lancer Controle Raw '. Met behulp van het podium joystick en het kijken naar de live-weergave van de FT-IR afbeelding interferogram (rechtsboven afbeelding), te verplaatsen naar een schone ruimte op de dia.
  13. Stel de integratietijd tot ongeveer 8000 tellingen. Vervolgens verplaatst het podium om een ​​stukje weefsel met structuur, bij voorkeur de rand van een weefsel te vinden, en perfectioneren van de focus van het beeld. Change 'Warmte' en 'Contrast' opties om te helpen vormen een plaatje om te verbeteren richten, zal dit geen effect op de IR-gegevens. Verder vanaf 1.18.
  14. Voor de wijze van transmissie, in klik 'Lancer Control' op 'Raw'. Met behulp van het podium joystick en het kijken naar de live-weergave van de FT-IR afbeelding interferogram (rechtsboven afbeelding), verplaatsen naar een schone ruimte van de dia.
  15. Stel de integratietijd tot ongeveer 8000 tellingen.
  16. Stel de onderste concentreren / condensor doel het aantal tellingen verhogen de maximum. Kijken naar de vorm van de bodem juiste afbeelding in Lancer controle om ervoor te zorgen dat het Gauss in uiterlijk en relatief uniform. Pas de integratie weer tijd om ongeveer 8.000 graven.
    OPMERKING: Als een van de pixels in de afbeelding van de FT-IR interferogram wit worden, verminderen de integratie tijd.
  17. Verplaats de etappe een stuk weefsel met structuur, bij voorkeur de rand van een weefsel te vinden en perfectioneren de focus van de afbeelding. Eventueel, veranderen de warmte en contrast opties om te helpen vormen een plaatje om te verbeteren richten, maar heeft geen effect op de IR-gegevens.
  18. Met behulp van het podium joystick, verplaatsen naar een schone ruimte van de dia. Druk op de knop 'Calibrate'. Zorg ervoor dat de 'Out Of Range (OOR) "waarde lager is dan 50 en het verschil tussen de' Hoge Flux 'en' Low Flux 'telt ten minste 4.000 graven.
  19. Selecteer 'OK' twee keer. In de tabbladen optiek te selecteren; 'Detector' = 'MCT', 'Microsomgaan Detector '=' Right 'en klik vervolgens op' Instellingen '. Op dit punt zal er een FT-IR interferogram op het scherm zijn. Klik op 'Zoek Centerburst'. Klik op 'Oké'.
  20. In het tabblad 'Optics', opnieuw selecteren 'Detector' = 'Ground', 'Microscoop Detector' = 'Links' en selecteer 'Instellingen'.
  21. In Lancer Controle - zorgen voor het beeld is nog steeds op een schone omgeving in en klik op 'kalibreren' weer. Klik op 'Oké'.
  22. Vervolgens verzamel achtergrond afbeelding van een FT-IR om te corrigeren voor de absorptie van de atmosfeer, het systeem en glijbaan. Ga naar het tabblad 'Electronics' en kies een geschikte spectrale resolutie, meestal van 4 cm-1 of 8 cm -1 voor het weefsel.
  23. Ga naar het tabblad 'Achtergrond' en typ 128 in 'Scans om samen te voegen'. Selecteer de 'Nieuw bestand ...' knop en plaats de achtergrond bestand in de juiste plooieh. Controleer het tabblad 'Imaging' om ervoor te zorgen mozaïeken is 1 op 1. Klik op 'Achtergrond', wacht tot de scan te voltooien en te bevestigen waar u het bestand op te slaan. Klik op een regio op de achtergrond afbeelding van de FT-IR en controleer het spectrum.
  24. Voor een groot mozaïek beeld van het monster te nemen, selecteert u het tabblad 'Imaging' en het nummer van X- en Y-frames voor de mozaïek maat die u wenst te verwerven.
  25. Klik op 'Instellingen' en in Lancer controle gebruik maken van de live-IR-oog op het gebied van belang te vinden. Als het nemen van een mozaïek, centreren de live feed in het midden van het gebied van belang. Klik op 'Oké'. Ga naar het tabblad 'Electronics' en typ het aantal scans samen te voegen (meestal een waarde tussen 2 en 16 scans voor het weefsel). Klik op 'Scan'.
  26. Controleer de verzamelde afbeelding FT-IR op het scherm om ervoor te zorgen het ziet er gefocust. Klik op de afbeelding van een IR-spectrum van die locatie weer te geven en te controleren dat het lijkt op een acceptabel signaal-ruis hebben. Acquire een zichtbaar beeld van het monster.
  27. Sla de afbeelding op en exporteren naar het gewenste formaat, zoals de ENVI-IDL.

2. Aanpassen van een FT-IR Microscoop voor High-definition Mogelijkheden

OPMERKING: De meeste FT-IR systemen zijn uitgerust met een objectief ongeveer 15X vergroting en 0,5 numerieke apertuur (NA). Om het beeld in high-definition-modus, kan een IR-compatibele 36X of 74X doel worden gebruikt om diffractie beperkte grafische mogelijkheden te geven.

  1. Verwijder 15X doelstelling van het systeem door het losdraaien tegen de klok in.
  2. Schroef in ofwel de 36X of 74X objectief op zijn plaats. Lijn de doelstelling vóór gebruik. Gebruik lens verlengbuizen het doel dicht genoeg om het monster te brengen.
  3. Plaats weefsel onder de nieuwe doelstelling en focus met behulp van zichtbaar licht met behulp van de verrekijker of Sample Capture programma.
    OPMERKING: High-definition beeldvorming moet worden gedaan in de transmissie-modus. De zeer nauwe werkafstand van dese doelstellingen (1-2 mm) en zeer ondiepe diepte van de focus vereist focus langzaam en voorzichtig, de tijd nemen om de doelstelling te verlagen zonder het monster te raken.
  4. Volg de instructies 1,6-1,11.
    LET OP: Door beduidend moeilijker om zich te concentreren en veel minder licht het bereiken van de detector, wordt het volgende protocol aangepast op basis van 1.14.
  5. In de wijze van transmissie, klik op 'Raw'. Met behulp van het podium joystick en het kijken naar de live-weergave van de FT-IR afbeelding interferogram (rechtsboven afbeelding), te verplaatsen naar het weefsel en de focus (idealiter op een rand).
    LET OP: Dit kan moeilijk zijn, dus pas de 'warmte' en 'Contrast' opties om te helpen vormen een plaatje om te verbeteren richten (deze opties hebben geen invloed op de IR-gegevens).
  6. Eenmaal gericht, met behulp van het podium joystick en de live IR oog verhuizing naar een schone ruimte van de dia. Stel de integratietijd tot ongeveer 8000 tellingen. Stel de bodem fokusseerobjektief teverhoging van het aantal tellingen zijn maximum. Pas de integratie weer tijd om ongeveer 8.000 graven.
  7. Verplaats de etappe een stuk weefsel met structuur, bij voorkeur de rand van een weefsel te vinden, en perfect de focus van de afbeelding.
  8. Als mozaieken van een beeld met een hoge resolutie, stel het podium om de juiste beweging nodig over afstanden voor nauwkeurige mozaïeken mogelijk te maken. Naar het podium instellingen afstand te wijzigen, ga naar 'Setup fase' in Lancer Controle en de horizontale en verticale uitlijning instellingen aan te passen, zodat voor de juiste mozaieken.
  9. Met behulp van het podium joystick overgang naar een schone ruimte van de dia. Druk op de knop 'Calibrate'. Zorg ervoor dat de Out Of Range (OOR) waarde lager is dan 50 voor zowel de 36X en 74X doelstellingen. Zorgen voor het verschil tussen de Hoge Flux en Lage Flux waarden ten minste 1000 telt voor de 74X objectief en 2000 geldt voor de 36X objectief.
  10. Doorgaan 1,19-1,27. Het aantal scans in 1.23 en1.25 moeten worden aangepast door een verminderde signaal tot ongeveer 256 scans voor de achtergrond en 16-128 scans voor het weefsel.

3. Visualiseren en classificeren IR Spectral Datasets

OPMERKING: In deze sectie zullen we bespreken hoe om te visualiseren en te extraheren gegevens van spectrale beelden met behulp van geospatiale beeldverwerking en analyse software zoals ENVI + IDL, maar het proces is zeer vergelijkbaar voor elke alternatieve software zoals MATLAB, gratis software zoals CytoSpec of eigen software van het instrument ontwikkelaar. Er zijn een aantal verschillende spectrale technieken die kunnen worden uitgevoerd op de IR-gegevens.

  1. Open Geospatial beeldverwerking en analyse software en laad het IR-gegevensbestand.
  2. Breng een basislijn correctie algoritme om de IR-gegevens door het selecteren van "Spectral instrumenten" en scroll naar beneden en klik op "Absorptiespectra". Observeer een pop-up menu en selecteer "Baseline correctie "
    OPMERKING: Correctie van de basislijn wordt een uitgangswaarde offset helling van de gegevens als gevolg van verstrooiing te verwijderen
  3. Voer Spectral normalisatie door ratioing de gegevens naar een bepaalde spectrale piek (typisch amide (1650 cm -1) of amide II (1550 cm -1)) of oppervlak onder een bepaald gebied van de spectra. Doe dit door het "Normal spectra" te selecteren onder de "absorbantiespectra" menu-opties.
    OPMERKING: Spectral normalisatie wordt uitgevoerd, zodat eventuele verschillen in spectra zijn echte biochemische verschillen en niet te wijten aan de dikte of dichtheid verschillen tussen de monsters.
  4. Gebruik een algoritme voor ruisonderdrukking om geluid van de spectra indien nodig 28 te verwijderen.
    OPMERKING: Er zijn meerdere benaderingen beschikbaar waarmee basislijncorrectie, spectrale normalisering en ruisonderdrukking kan worden bereikt, met de meeste software die geautomatiseerde algoritmen ingebouwd Daarnaast zijn er een opkomende aantal benaderingen die zal corrigeren voor.spectrale aberraties, die in detail 29-42 hebben besproken; Echter, de gemeenschap nog niet eens over welke van deze nodig zijn.
  5. Neem een lijst van alle IR frequenties binnen het beeld (typisch een spectraal bereik van 900 tot 4000 cm -1) verzameld. Klik op de frequenties die overeenkomen met specifieke biomoleculen een beeld van het weefsel nageleefd de geselecteerde frequentie.
    1. Bijvoorbeeld, op 1650 cm -1 band om de verdeling van eiwitten in het monster te observeren. Of klik op 1080 cm -1 band om de verdeling van nucleïnezuren in het monster te observeren. Gebruik golfgetal 1650 cm -1.
  6. Maak extra afbeeldingen door het berekenen van spectrale piekhoogte ratio, piekoppervlakverhoudingen etc. die zal zorgen voor visualisatie van verschillende biomoleculaire componenten. Klik op 'Spectral Tools' en kies vervolgens 'piekhoogte Ratio's' of 'Bereken Image Area'om beelden te creëren.
  7. Scan de bijbehorende aangrenzende sectie weefsel dat gekleurd is met behulp van een apart geheel dia imager systeem dat helderveld beelden vastlegt. Het IR-beeld samen, brengen het digitale beeld van de gekleurde weefsel met een zichtbaar beeld programma.
  8. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding op een gebied van belang en selecteer 'Z-profiel'. Hierdoor wordt de spectrale informatie op het geselecteerde pixel.
  9. Kijk naar de IR spectra van meerdere pixels van meerdere klassen, zoals vergelijken celtypen, ziektetoestanden. Mark specifieke pixels op het beeld met behulp van de 'Regio Of Interest' (ROI) tool. Om dit te doen, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer "ROI tool '. Maak de klassen die zijn geëtiketteerd te worden, bijvoorbeeld normaal, dysplasie en kanker klassen. Selecteer vervolgens, 'ROI type' - 'Point'. Selecteer vervolgens de klas om pixels te selecteren en te tekenen op de juiste pixels op het IR-beeld. Leid de gemiddelde spectra fof elk van de klassen met behulp van de 'gemiddelde ROI' tool.
  10. Vergelijk afgeleide spectra door het plotten in grafische software.

Representative Results

FT-IR imaging maakt de afleiding van infraroodbeelden van weefsel dat verschillende contrasten naargelang de IR frequentie van belang kan geven. Bovendien, in een beeld IR, elke pixel bestaat uit het gehele IR spectrum met verschillende pieken die overeenkomen met verschillende biomoleculen die informatie over de biochemische eigenschappen van celtypen of ziektetoestanden (figuur 1) kan geven. Hier hebben we laten zien hoe je spectrale handtekeningen te vergelijken tussen de lessen, maar meer geavanceerde geautomatiseerde indeling is mogelijk met behulp van extra algoritmen 3,43-50, zoals Bayesiaanse indeling, Random Bossen, Artificiële neurale netwerken, en hiërarchische cluster analyse kan worden uitgevoerd op de gegevens. Bewaakte indeling aanpak kan voor de constructie van een te identificeren die kunnen worden getraind om voor automatische herkenning van celtypes of ziektestadia. Unsupervised indeling benaderingen kunnen worden gebruikt om te kijken naar de natuur voorkomende difschillen in weefsel of cellen als gevolg van biochemische variantie.

FT-IR instrumentatie is in de loop van de afgelopen decennia, van het meten in een enkel punt / mapping modus met behulp van IR ondoorzichtige openingen om beeldvorming modus met behulp van Cassegrain doelstellingen, met behulp van een verhelderende objectief in combinatie met een verzamelen doel in de transmissie-modus of een enkele objectieve dat zowel licht op en verzamelt zich in reflectie-modus (figuur 2). Recent werd aangetoond dat het verzamelen doel transmissie kan worden overgestapt en een hogere vergroting en numerieke apertuur doelstelling om voor diffractie beperkte IR imaging, die leidt tot een aanzienlijke verhoging van de ruimtelijke resolutie van verzamelde infraroodbeelden 4,5. De vooruitgang in de ruimtelijke resolutie voor tissue beeldvorming zijn van cruciaal belang aangezien we nu celtypen en weefselstructuren kunnen identificeren, bijvoorbeeld de functionele eenheden van de nier, de glomeruli, met behulp aangepast huisFT-IR systemen (figuur 3).

High-definition FT-IR beeldvorming zorgt voor gedetailleerde beelden van weefsels te worden onderzocht om abnormale gebieden te identificeren en biochemische verschillen tussen verschillende celtypen te identificeren. In leverweefsel kern, is het mogelijk om hepatocyten en regio infiltrerende fibrose dat twee verschillende gebieden van dysplasie en niet-dysplastische cirrose (figuur 4) verdeelt visualiseren. We zijn bezig om deze exploit naar het maken van geautomatiseerde diagnostische instrumenten voor gebruik in moeilijke gevallen van een leveraandoening.

Belangrijk is, kan de verhoogde ruimtelijke resolutie nu kunnen wij specifieke structurele kenmerken die chemisch kunnen worden gemodificeerd door ziekte voor histologische veranderingen duidelijk isoleren. Zo zijn we gericht op het identificeren biochemische veranderingen in de nieren glomerulaire structuren als het kapsel van Bowman, mesangium, glomerulaire basaalmembraan en tubulaire basaalmembraan vóór veranderingen die door de patholoog kan worden waargenomen (figuur 5). In het bijzonder zijn we geïnteresseerd in het identificeren van veranderingen in verband met de progressie van diabetische nefropathie en chronische afstoting bij transplantatie patiënten, waar de huidige technieken niet aan veranderingen in een vroeg genoeg mode voor succesvolle interventie te identificeren.

Figuur 1
Figuur 1. FT-IR beelden en spectrum van een lever kern. Afbeelding (A) H & E gekleurde kern van leverbiopsie en afbeeldingen van IR absorptie seriële gedeelte van dezelfde kern bij (B) 3286 cm -1 en (C) 2603 cm -1, die verschillende structurele kenmerken gemarkeerd. (D) Typische IR-spectrum van weefsel, met belangrijke pieken geëtiketteerd. Schaal bar = 100 micrometer.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Optics schematische detaillering FT-IR microscoop werkingsmodi. (A) in de transmissie-modus, wordt het monster verlicht door de bodem doel, en het licht dat door het monster wordt verzameld door de hoogste prioriteit. (B) In de reflectiemodus, de hoogste prioriteit dient zowel om het monster te verlichten en het gereflecteerde licht te verzamelen. De onderste doelstelling wordt niet gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Vergelijking van different microscoop doelstellingen op FT-IR beelden van een nierglomerulus bij 2925 cm-1. (A) 15X verzamelen van objectieve met NA = 0,5 (5,5 x 5,5 micrometer pixelgrootte). (B) 36X verzamelen objectief met NA = 0,5 (2,2 x 2,2 micrometer pixelgrootte). (C) 74X het verzamelen van objectieve met NA = 0,65 (1,1 x 1,1 micrometer pixelgrootte). Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. spectrale verschillen tussen fibrose en hepatocyten in een lever kern. (A) H & E gekleurde kern van leverbiopsie. (B) Afbeelding van een seriële sectie kern gescand in FT-IR (36X objectief setup). (C) Reppresentatief spectra van hepatocyten en fibrose, die uit gebieden van weefsel met pijlen in (A) en (B). Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Differentiatie van nierweefsel biopsie functies door het gebruik van high-definition FT-IR imaging. (A) Periodic zuur-Schiff gekleurde coupe met de kenmerken te extraheren geëtiketteerd. (B) High definition FT-IR-beeld van de CH 2 asymmetrische stretching regio (36X objectief setup) van een seriële deel van hetzelfde weefsel. (C) Features gelabeld (A) geëxtraheerd met FT-IR beeld in (B) kunnen chemisch differentiate de vier kenmerken van het weefsel. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

FT-IR is een nieuwe modaliteit voor labelvrije biochemische beeldvorming van weefselsecties, met potentieel een belangrijke rol bij het verbeteren van de huidige standaard van diagnose pathologie. De huidige gouden standaard voor pathologie vereist weefsel biopsie, gefixeerd in formaline, ingebed in paraffine, in secties verdeeld meerdere malen, en gekleurd met meerdere vlekken. Een getrainde patholoog moet de weefselstructuur en cellulaire morfologie subjectief visueel beoordelen om een ​​diagnose te bepalen. Hier laten we zien hoe infraroodbeelden hoge resolutie verzamelen van hetzelfde type profielen en bespreekt sommige van de computationele benaderingen chemische verschillen tussen celtypes en ziektetoestanden onderzoeken.

De kritische stappen in dit protocol zijn dat de weefsels zorgvuldig gericht en dat het systeem goed gekalibreerd zeer hoge kwaliteit spectroscopische gegevens. De zorg bij het opzetten van het systeem is bijzonder criti cal bij het werken met een hoge vergrotingsfactor doelstellingen. Om te helpen bij het oplossen van problemen, de volgende lijst bevat enkele van de mogelijke problemen;

Probleem: Lage IR intensiteit wanneer beeldvorming in reflectie. Oplossing: Controleer de IR-slide richting als het reflecterende coating kunnen worden op de verkeerde kant van de dia.

Probleem: Laag signaal / rood waarschuwingsbord in Lancer Controle. Oplossing: Cool detectoren met LN2. Vloeibare stikstof is nodig voor de FPA detectoren en vereist periodiek worden bijgevuld.

Probleem: Velocity fout / beweging fouten. Oplossing: Reset spectrometer en trillingen te verminderen. Vibrations zal de bewegende spiegel in de interferometer te worden verstoord.

Probleem: Waterdamp pieken in de gegevens. Oplossing: Verhoog purge op het systeem en het monster te beschermen tegen lucht.

Probleem: Ongeldige centerburst. Oplossing: Vind centerburst opnieuw.

e_content "> Probleem:. lage flux verschil in transmissie, hoewel gericht. Oplossing: Stel bottom condensor Dit ontstaat als IR licht niet gericht wordt naar een punt op het monster.

In dit artikel hebben we ons gericht op hoe je high definition IR beelden van weefsels te verwerven in beide transmissie of transflectance modus. De aard van FT-IR imaging, is dat er meerdere wijzigingen die kunnen worden aangebracht in de data-acquisitie, zoals type substraat, fixatie techniek monsterdikte, spectrale resolutie, interferometer mirror snelheid etc. Het effect van deze parameters heeft onlangs 4,5,17,51 besproken in uitgebreide detail.

Er zijn een aantal wijzigingen kunnen worden aangebracht in het afbeeldingssysteem inclusief beeldvorming in de ATR mode 10,24,26 en met nanoschaal thermische benaderingen 52,53 zodat voor hoge resolutie IR imaging. De belangrijkste beperking met hoge resolutie IR-beeldvorming is dat de tissues moet zorgvuldig worden voorbereid en dun genoeg om door IR (typisch 4 urn dik) te passen. Bovendien transmissie en reflectie FT-IR imaging vereist de monsters droog te wijten aan de absorptie van IR water. Echter, FT-IR imaging heeft belangrijke voordelen boven andere technieken, omdat het kan zeer snel beeld grote stukken weefsel terwijl afleiden rijke en gedetailleerde biochemische informatie. Andere soortgelijke technieken die biochemische informatie af te leiden in een label-free mode bevatten Raman spectroscopie, maar de tijd van data-acquisitie is veel langzamer om beelden te verwerven. Nieuwe Raman beeldvorming benaderingen zijn in opkomst, waaronder gestimuleerde Raman scattering (SRS) en Coherent Antistokes Raman scattering (CARS); zij hebben echter toegang te beperkte spectrale bereik of enkele frequentie beeldvorming.

De vooruitgang in de snelheid van data-acquisitie, ruimtelijke resolutie, en de beschikbaarheid van computationele benaderingen zijn van enorme waarde geweest in het maken van FT-IR IMAGing een meer haalbare aanpak voor de vertaling als een nieuwe imaging tool in de pathologie. De recente ontwikkelingen in de ruimtelijke resolutie zijn vooral van belang voor weefselpathologie geweest als gevolg van de belangrijkste celtypen niet zijnde oplosbaar met behulp van conventionele FT-IR imaging systemen. Het recente document door Reddy et al. liet zien hoe een ideaal systeem om de optimale ruimtelijke resolutie van een FT-IR-imaging-systeem 5 verkrijgen modelleren. De nierweefsel voorbeeld in dit document toont het belang van een hogere ruimtelijke resolutie om biochemische informatie uit glomerulaire structuren (Figuur 3 en Figuur 5) extract. In de toekomst, nieuwe ontwikkelingen in Quantum Cascade Lasers als zeer helder IR lichtbronnen 54-57, 3D spectral imaging 58, en doorbraken op het gebied van nano-IR technologieën 52,53,59,60 houden spannende nieuwe mogelijkheden van het onderzoek dat kan hebben enorme gevolgen voor de toekomst van weefsel beeldvorming.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, E. N., et al. Fourier transform spectroscopic imaging using an infrared focal-plane array detector. Anal Chem. 67 (19), 3377-3381 (1995).
  2. Dorling, K. M., Baker, M. J. Rapid FTIR chemical imaging: highlighting FPA detectors. Trends Biotechnol. 31 (8), 437-438 (2013).
  3. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
  4. Nasse, M. J., et al. High-resolution Fourier-transform infrared chemical imaging with multiple synchrotron beams. Nat Methods. 8 (5), 413-416 (2011).
  5. Reddy, R. K., Walsh, M. J., Schulmerich, M. V., Carney, P. S., Bhargava, R. High-definition infrared spectroscopic imaging. Appl Spectrosc. 67 (1), 93-105 (2013).
  6. Walsh, M. J., Bhargava, R. Chapter 10; Infrared spectroscopic imaging: an integrative approach to pathology. Nanobiophotonics. , McGraw Hill. (2010).
  7. Walsh, M. J., Reddy, R. K., Bhargava, R. Label-Free Biomedical Imaging With Mid-IR Spectroscopy. Ieee J Sel Top Quant. 18 (4), 1502-1513 (2012).
  8. Matthaus, C., et al. Chapter 10: Infrared and Raman microscopy in cell biology. Methods Cell Biol. 89, 275-308 (2008).
  9. Walsh, M. J., et al. IR microspectroscopy: potential applications in cervical cancer screening. Cancer Lett. 246 (1-2), 1-11 (2007).
  10. Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
  11. Sahu, R. K., Mordechai, S. Spectral signatures of colonic malignancies in the mid-infrared region: from basic research to clinical applicability. Future Oncol. 6 (10), 1653-1667 (2010).
  12. Kendall, C., et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics. Analyst. 134 (6), 1029-1045 (2009).
  13. Steiner, G., Koch, E. Trends in Fourier transform infrared spectroscopic imaging. Anal Bioanal Chem. 394 (3), 671-678 (2009).
  14. Biswas, S., Walsh, M. J., Bhargava, R. Ch. 16. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 475-504 (2014).
  15. Bhargava, R. Infrared Spectroscopic Imaging: The Next Generation. Appl Spectrosc. 66 (10), 1091-1120 (2012).
  16. Malek, K., Wood, B. R., Bambery, K. R. Ch. 15. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 419-473 (2014).
  17. Martin, F. L., et al. Distinguishing cell types or populations based on the computational analysis of their infrared spectra. Nat Protoc. 5 (11), 1748-1760 (2010).
  18. Sommer, A. J., Tisinger, L. G., Marcott, C., Story, G. M. Attenuated Total Internal Reflection Infrared Mapping Microspectroscopy Using an Imaging Microscope. Appl Spectrosc. 55 (3), 252-256 (2001).
  19. Glassford, S. E., Byrne, B., Kazarian, S. G. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta. 1834 (12), 2849-2858 (2013).
  20. Andanson, J. M., Chan, K. L., Kazarian, S. G. High-throughput spectroscopic imaging applied to permeation through the skin. Appl Spectrosc. 63 (5), 512-517 (2009).
  21. Kuimova, M. K., Chan, K. L., Kazarian, S. G. Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc. 63 (2), 164-171 (2009).
  22. Chan, K. L., Kazarian, S. G. Attenuated total reflection-Fourier transform infrared imaging of large areas using inverted prism crystals and combining imaging and mapping. Appl Spectrosc. 62 (10), 1095-1101 (2008).
  23. Gajjar, K., et al. Diagnostic segregation of human brain tumours using Fourier-transform infrared and/or Raman spectroscopy coupled with discriminant analysis. Anal Methods. 5, 89-102 (2012).
  24. Holton, S. E., Walsh, M. J., Bhargava, R. Subcellular localization of early biochemical transformations in cancer-activated fibroblasts using infrared spectroscopic imaging. Analyst. 136 (14), 2953-2958 (2011).
  25. Gulley-Stahl, H. J., Bledsoe, S. B., Evan, A. P., Sommer, A. J. The advantages of an attenuated total internal reflection infrared microspectroscopic imaging approach for kidney biopsy analysis. Appl Spectrosc. 64 (1), 15-22 (2010).
  26. Walsh, M. J., Kajdacsy-Balla, A., Holton, S. E., Bhargava, R. Attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopic imaging for breast histopathology. Vib Spectrosc. 60, 23-28 (1016).
  27. Investigating the Biochemical Progression of Liver Disease Through Fibrosis, Cirrhosis, Dysplasia and Hepatocellular Carcinoma using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging. Sreedhar, H., et al. Biomedical Vibrational Spectroscopy VI: Advances in Research and Industry, , 89390J (2014).
  28. Reddy, R. K., Bhargava, R. Accurate histopathology from low signal-to-noise ratio spectroscopic imaging data. Analyst. 135 (11), 2818-2825 (2010).
  29. Bassan, P., et al. The inherent problem of transflection-mode infrared spectroscopic microscopy and the ramifications for biomedical single point and imaging applications. Analyst. 138 (1), 144-157 (2013).
  30. Bassan, P., et al. FTIR microscopy of biological cells and tissue: data analysis using resonant Mie scattering (RMieS) EMSC algorithm. Analyst. 137 (6), 1370-1377 (2012).
  31. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering in infrared spectroscopy of biological materials--understanding the 'dispersion artefact'. Analyst. 134 (8), 1586-1593 (2009).
  32. Bassan, P., et al. RMieS-EMSC correction for infrared spectra of biological cells: extension using full Mie theory and GPU computing. J Biophotonics. 3 (8-9), 609-620 (2010).
  33. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples. Analyst. 135 (2), 268-277 (2010).
  34. Bassan, P., et al. Reflection contributions to the dispersion artefact in FTIR spectra of single biological cells. Analyst. 134 (6), 1171-1175 (2009).
  35. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of mid-infrared absorption microspectroscopy: II. Heterogeneous samples. Anal Chem. 82 (9), 3487-3499 (2010).
  36. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of midinfrared absorption microspectroscopy: I. Homogeneous samples. Anal Chem. 82 (9), 3474-3486 (2010).
  37. Kohler, A., et al. Estimating and correcting mie scattering in synchrotron-based microscopic fourier transform infrared spectra by extended multiplicative signal correction. Appl Spectrosc. 62 (3), 259-266 (2008).
  38. Miljkovic, M., Bird, B., Lenau, K., Mazur, A. I., Diem, M. Spectral cytopathology: new aspects of data collection, manipulation and confounding effects. Analyst. 138 (14), 3975-3982 (2013).
  39. Miljkovic, M., Bird, B., Diem, M. Line shape distortion effects in infrared spectroscopy. Analyst. 137 (17), 3954-3964 (2012).
  40. Bird, B., Miljkovic, M., Diem, M. Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue. J Biophotonics. 3 (8-9), 597-608 (2010).
  41. Mohlenhoff, B., Romeo, M., Diem, M., Wood, B. R. Mie-type scattering and non-Beer-Lambert absorption behavior of human cells in infrared microspectroscopy. Biophys J. 88 (5), 3635-3640 (2005).
  42. Bambery, K. R., Wood, B. R., McNaughton, D. Resonant Mie scattering (RMieS) correction applied to FTIR images of biological tissue samples. Analyst. 137 (1), 126-132 (2012).
  43. Kwak, J. T., Reddy, R., Sinha, S., Bhargava, R. Analysis of variance in spectroscopic imaging data from human tissues. Anal Chem. 84 (2), 1063-1069 (2012).
  44. Trevisan, J., Angelov, P. P., Carmichael, P. L., Scott, A. D., Martin, F. L. Extracting biological information with computational analysis of Fourier-transform infrared (FTIR) biospectroscopy datasets: current practices to future perspectives. Analyst. 137 (14), 3202-3215 (2012).
  45. Trevisan, J., et al. Measuring similarity and improving stability in biomarker identification methods applied to Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. J Biophotonics. 7 (3-4), 254-265 (2014).
  46. Bhargava, R., Fernandez, D. C., Hewitt, S. M., Levin, I. W. High throughput assessment of cells and tissues: Bayesian classification of spectral metrics from infrared vibrational spectroscopic imaging data. Biochim Biophys Acta. 1758 (7), 830-845 (2006).
  47. Menze, B. H., et al. A comparison of random forest and its Gini importance with standard chemometric methods for the feature selection and classification of spectral data. BMC bioinformatics. 10, 213 (2009).
  48. Kelly, J. G., et al. Biospectroscopy to metabolically profile biomolecular structure: a multistage approach linking computational analysis with biomarkers. J Proteome Res. 10 (4), 1437-1448 (2011).
  49. Bird, B., et al. Infrared micro-spectral imaging: distinction of tissue types in axillary lymph node histology. BMC Clin Pathol. 8, 8 (2008).
  50. Baker, M. J., et al. Investigating FTIR based histopathology for the diagnosis of prostate cancer. J Biophotonics. 2 (1-2), 104-113 (2009).
  51. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
  52. Katzenmeyer, A. M., Aksyuk, V., Centrone, A. Nanoscale Infrared Spectroscopy: Improving the Spectral Range of the Photothermal Induced Resonance Technique. Anal Chem. 85 (4), 1972-1979 (2013).
  53. Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Appl Spectrosc. 66 (12), 1365-1384 (2012).
  54. Kole, M. R., Reddy, R. K., Schulmerich, M. V., Gelber, M. K., Bhargava, R. Discrete frequency infrared microspectroscopy and imaging with a tunable quantum cascade laser. Anal Chem. 84 (23), 10366-10372 (2012).
  55. Vrancic, C., et al. Continuous glucose monitoring by means of mid-infrared transmission laser spectroscopy in vitro. Analyst. 136 (6), 1192-1198 (2011).
  56. Mid-infrared microspectroscopic imaging with a quantum cascade laser. Yeh, K., Schulmerich, M., Bhargava, R. Next-Generation Spectroscopic Technologies VI, 8726, 87260E (2013).
  57. Brandstetter, M., Volgger, L., Genner, A., Jungbauer, C., Lendl, B. Direct determination of glucose, lactate and triglycerides in blood serum by a tunable quantum cascade laser-based mid-IR sensor. Appl. Phys. B. 110 (2), 233-239 (2013).
  58. Martin, M. C., et al. 3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography. Nat Meth. 10 (9), 861-864 (2013).
  59. Kwon, B., et al. Infrared microspectroscopy combined with conventional atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 116, 56-61 (2012).
  60. Marcott, C., et al. Nanoscale infrared (IR) spectroscopy and imaging of structural lipids in human stratum corneum using an atomic force microscope to directly detect absorbed light from a tunable IR laser source. Exp Dermatol. 22 (6), 419-421 (2013).

Tags

Geneeskunde spectroscopie Imaging Fourier Transform Pathologie kanker lever nieren hyperspectrale biopsie Infrarood Optics Tissue
High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopische beeldvorming van Human Tissue secties aan de verbetering van Pathologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen,… More

Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter