Methodenartikel

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

DOI:

10.3791/52347

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27. Dezember 2014

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1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Zusammenfassung

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Als Subtyp der Leukozyten und Vorläufer von Makrophagen sind Monozyten an vielen wichtigen Prozessen von Organismen beteiligt und oft Gegenstand verschiedener Bereiche in der biomedizinischen Wissenschaft. Die im Folgenden beschriebene Methode ist eine einfache und effektive Methode, um murine Monozyten aus heterogenem Knochenmark zu isolieren.

Knochenmark aus dem Femur und der Tibia von Balb/c-Mäusen wird durch Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entnommen. Die Zellsuspension wird mit einem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) ergänzt und auf extrem niedrigen Bindungsflächen kultiviert, um eine adhäsionsinduzierte Differenzierung von Monozyten zu vermeiden. Die Eigenschaften und die Differenzierung von Monozyten werden in verschiedenen Abständen charakterisiert. Für die Phänotypisierung wird die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Markern wie CD11b, CD115 und F4/80 verwendet. Am Ende der Kultivierung besteht die Suspension aus 45%± 12% Monozyten. Durch die Entfernung von adhäsiven Makrophagen kann die Reinheit auf bis zu 86 % ± 6 % erhöht werden. Nach der Isolierung können Monozyten auf verschiedene Weise verwendet werden, und eine der effektivsten und gebräuchlichsten Methoden für die In-vivo-Verabreichung ist die intravenöse Schwanzveneninjektion.

Diese Technik der Isolierung und Anwendung ist wichtig für Studien an Mausmodellen, insbesondere in den Bereichen Entzündung oder Immunologie. Monozyten können auch therapeutisch in Krankheitsmodellen von Mäusen eingesetzt werden.

Einleitung

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Die Isolierung von Monozyten ist wichtig und entscheidend für viele in vitro und in vivo Studien. Diese Zellen sind Ziele für Krankheiten wie die periphere arterielle Verschlusskrankheit, die koronare Herzkrankheit oder andere ischämische Erkrankungen, da das Wachstum der Kollateralgefäße stark durch lokale Entzündungen angetrieben wird. Zu den Entzündungsreaktionen gehören die endotheliale Aktivierung und die lokale Rekrutierung von Leukozyten, hauptsächlich Monozyten, die dann zu Makrophagen reifen und ein hochgradig arteriogenes Milieu schaffen, indem sie mehrere Wachstumsfaktoren sezernieren, um den Umbau einer Arteriole in eine funktionelle Koll....

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Protokoll

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Diese Studie wurde mit Genehmigung des Landes Sachsen und Sachsen-Anhalt, Regierungspräsidium Dresden / Halle durchgeführt werden, nach § 8 des Gesetzes für den Tierschutz (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 Zellisolation

1.1 Herstellung von Ober- und Unterschenkel

  1. Anesthetize der Maus unter Verwendung einer 5% Isofluran Konzentration durch Verdampfen von Isofluran in einem geschlossenen Behälter. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt für 3 Sekunden, führen Sie den Genickbruch.
  2. Desinfizieren Sie die Hinterbeine mit Ethanol (96%). Haut und Muskeln entfernen und trennen Sie die Knochen mit einem steril....

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Ergebnisse

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Das aus dem Knochenmark der Maus extrahiert Zelllösung besteht aus verschiedenen Zelltypen. Die wichtigsten Zelltypen sind Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Zelltypen können durch Grße und Granularität, die in Abbildung 1 für native Suspensionen und Zellen nach 5 Tagen der Differenzierung geerntet gezeigt wird geschätzt werden. Beachten Sie die Verschiebung zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung. Jedoch muss eine genaue Klassifizierung der Bevölkerung auf die markante Expression zellu.......

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Diskussion

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Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um große Mengen an murine Monozyten aus Knochenmark zu isolieren. Im Vergleich zu anderen Protokollen mit dem peripheren Blut, die Monozyten Ausbeuten 5 von 1,4 x10 6 zu erhalten, werden wir in der Lage, höhere Ausbeuten an 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 Monozyten aus einer Spendermaus erhalten.

Wenn angesichts Herausforderungen mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Möglichkeit einer Verunreinig.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde gefördert durch die DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, Sonderforschungsbereich).

Vielen Dank an Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, Magdeburg, Deutschland, für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-Ultra-Low-Attachment-PlatteCorning Incorporated, NY, USA6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte, mit Kappe, steril
8- 12 Wochen alt, männlich, balb/c Mäuse Charles River, Sulzfeld, Deutschland
96-Well-PlatteGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Deutschland
Blauer TotzellenfleckLife technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
RinderserumalbuminGE Healthcare, Freiburg, DeutschlandFraktion V, pH 7,0
KanülenB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland28G, 30G
CD115eBioscience, San Diego, USA12-1152
CD11beBioscience, San Diego, USA53-0112
ZellkulturschaleGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, DeutschlandMit Kappe, steril
ZentrifugeBeckman Coulter GmbH, Krefeld, DeutschlandAllegra® X-15R Zentrifuge
EnthaarungscremeVeet, Mannheim, Deutschland
DesinfektionsmittelSchü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, DeutschlandKodan Tinktur forte
Einweg-Skalpell Nr.10 Feder-Rasierhobel Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTASigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Ethanol 96% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Deutschland
Extraktionsanlage PipetusHirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Deutschland
F4/80AbD Serotec, Dü sseldorf, DeutschlandMCA497APC FACS-Puffer
 Hergestellt von unserer Gruppe mit EinzelkomponentenPBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS GerätBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USABD FACS Canto II
FACS Rohre       Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® PipetteBecton Dickenson Labware, NY, USA
Fötales KälberserumSigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Feine PinzetteRubis, Stabio, Schweiz
HandschuheRö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Deutschland
Gr1eBioscience, San Diego, USA53-5931
Heizplatte Labotect GmbH, Gö ttingen, Deutschland Heizplatte 062
InkubatorEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, DeutschlandIncu
safe IsofluranBaxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Deutschland
LichtmikroskopCarl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, DeutschlandAxiovert 40 ° C
Makrophagen-Kolonie-stimulierender FaktorSigma Aldrich, Hamburg, DeutschlandSRP3110 
Mechanischer SchüttlerIKA, Staufen, Deutschlandms2 Minischüttler
Medium 199PAA Laboratories GmbH, Pasching, ÖsterreichWarm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
Mikro-ReagenzgläserEppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Mikrobiologische WerkbankThermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, DeutschlandHera sicherer
Monozyten-Waschpuffer Hergestellt von unserer Gruppe mit EinzelkomponentenPBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Maus-RückhaltesystemVerschiedene
NaClBerlin Chemie AG, Berlin, Deutschland
NaN3 (Natriumsäure)Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Neubauer ZählkammerPaul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland
Nylon-ZellsiebBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USAZellsieb, 70 & Mikro; m Maschenweite
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife technologies GmbH, Darmstadt, DeutschlandpH 7,4, steril
PipettenEppendorf AG, Hamburg, Deutschland10µ l/100&Mikro; l/200µ l/1.000&Mikro; l
PipettierköpfeEppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Serologische PipetteGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, DeutschlandCellstar 5 ml, 10 ml
AbsaugeinheitIntegra bioscience, Fernwald, DeutschlandVacusafe comfort
Chirurgische SchereWord Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
SpritzeB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland1 ml Omnifix® -F Insulinspritze
Röhrchen mit KappeGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Deutschland15 ml/50 ml Cellstar Röhrchen
WarmwasserbadJulabo Labortechnik GmbH, Seelbach, DeutschlandJulabo SW22

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.

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Schlagwörter

Knochenmark MonozytenMonozytenisolationDurchflusszytometrieUltra Low AttachmentM CSF BehandlungCD11b CD115 F4 80SchwanzveneninjektionMonozytenreinheitKnochenmarkgewinnung

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