Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Zusammenfassung

Als Subtyp der Leukozyten und Vorläufer von Makrophagen sind Monozyten an vielen wichtigen Prozessen von Organismen beteiligt und oft Gegenstand verschiedener Bereiche in der biomedizinischen Wissenschaft. Die im Folgenden beschriebene Methode ist eine einfache und effektive Methode, um murine Monozyten aus heterogenem Knochenmark zu isolieren.

Knochenmark aus dem Femur und der Tibia von Balb/c-Mäusen wird durch Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entnommen. Die Zellsuspension wird mit einem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) ergänzt und auf extrem niedrigen Bindungsflächen kultiviert, um eine adhäsionsinduzierte Differenzierung von Monozyten zu vermeiden. Die Eigenschaften und die Differenzierung von Monozyten werden in verschiedenen Abständen charakterisiert. Für die Phänotypisierung wird die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Markern wie CD11b, CD115 und F4/80 verwendet. Am Ende der Kultivierung besteht die Suspension aus 45%± 12% Monozyten. Durch die Entfernung von adhäsiven Makrophagen kann die Reinheit auf bis zu 86 % ± 6 % erhöht werden. Nach der Isolierung können Monozyten auf verschiedene Weise verwendet werden, und eine der effektivsten und gebräuchlichsten Methoden für die In-vivo-Verabreichung ist die intravenöse Schwanzveneninjektion.

Diese Technik der Isolierung und Anwendung ist wichtig für Studien an Mausmodellen, insbesondere in den Bereichen Entzündung oder Immunologie. Monozyten können auch therapeutisch in Krankheitsmodellen von Mäusen eingesetzt werden.

Einleitung

Die Isolierung von Monozyten ist wichtig und entscheidend für viele in vitro und in vivo Studien. Diese Zellen sind Ziele für Krankheiten wie die periphere arterielle Verschlusskrankheit, die koronare Herzkrankheit oder andere ischämische Erkrankungen, da das Wachstum der Kollateralgefäße stark durch lokale Entzündungen angetrieben wird. Zu den Entzündungsreaktionen gehören die endotheliale Aktivierung und die lokale Rekrutierung von Leukozyten, hauptsächlich Monozyten, die dann zu Makrophagen reifen und ein hochgradig arteriogenes Milieu schaffen, indem sie mehrere Wachstumsfaktoren sezernieren, um den Umbau einer Arteriole in eine funktionelle Kollateralarterie zu induzieren^1-3. Monozyten reifen auch zu dendritischen Zellen heran, die häufig für immunologische Studien^4,5 und die Krebsforschung^6,7 verwendet werden.

Problematisch bei der Herangehensweise an die Monozytenisolierung aus peripherem Blut⁸ ist die hohe Anzahl von Spendertieren, die benötigt werden, um eine ausreichende Menge an Monozyten für die meisten Analysen zu produzieren. Frühere Protokolle beschreiben Methoden wie die Dichtegradientenzentrifugation und die Zelldepletion über MACS⁹ bei der Isolierung von Monozyten; Diese Techniken können jedoch die Eigenschaften und die Funktionalität von Monozyten verändern, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation führen^{kann 10,11}. Darüber hinaus sind diese Methoden schwierig und können die experimentelle Reproduzierbarkeit verringern.

Unser Ziel mit diesem Protokoll ist es, eine einfache und kostengünstige Methode zur Erzeugung großer Mengen von Monozyten aus dem Knochenmark bereitzustellen. Aufgrund der hohen Zellausbeute von 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ Zellen, die mit diesem Protokoll gewonnen werden, können wir die Anzahl der Mäuse, die bei der Isolierung von Monozyten aus dem Knochenmark benötigt werden, erheblich reduzieren. Das Verfahren kann innerhalb kürzester Zeit und ohne den Einsatz teurer und komplizierter Techniken, wie oben beschrieben, abgeschlossen werden. Hier extrahieren wir Monozyten aus nativer Knochenmarksuspension von Spendermäusen, kultivieren die Suspension auf ultraniedrigen Anhaftplatten und ergänzen die Lösung mit 20 ng/ml M-CFS. Am 5. Tag der Inkubation werden die Zellen geerntet und charakterisiert, um funktionelle und phänotypische Eigenschaften zu bestätigen.

Für Experimente auf dem Gebiet der Arteriogenese ist die intravenöse Transplantation dieser aus dem Knochenmark gewonnenen Monozyten in Mäuse eine effektive Methode der systemischen Wirkstoffabgabe, die in gängigen Modellen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit mit der Ligatur der Oberschenkelarterie kombiniert werden kann.

Protokoll

Diese Studie wurde mit Genehmigung des Landes Sachsen und Sachsen-Anhalt, Regierungspräsidium Dresden / Halle durchgeführt werden, nach § 8 des Gesetzes für den Tierschutz (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 Zellisolation

1.1 Herstellung von Ober- und Unterschenkel

1. Anesthetize der Maus unter Verwendung einer 5% Isofluran Konzentration durch Verdampfen von Isofluran in einem geschlossenen Behälter. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt für 3 Sekunden, führen Sie den Genickbruch.
2. Desinfizieren Sie die Hinterbeine mit Ethanol (96%). Haut und Muskeln entfernen und trennen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell.
   1. Beginnen Sie mit einem Leistenhautschnitt, und verlängern die Inzision in Richtung der Innenknöchel und die eine Kreis Präparation der Haut um den Unterschenkel. Entfernen Sie die Haut der Beine vollständig durch Abziehen es proximal.
   2. Nehmen Sie den Quadrizeps vom Femur mit einem scharfen Skalpell entfernen sowohl die vorderen peroneusund die Wadenmuskelgruppen und desartikulieren das Bein im Hüftgelenk durch die Anordnung und sezieren die Bänder.
   3. Starten Sie nach vorne und fahren rund um das Gelenk durch vorsichtiges Drehen des Beins und Durchschneiden der Bänder, wodurch der gemeinsame disarticulating.
3. Waschen Femur und Tibia mit 96% Ethanol für ein Minimum von 90 Sekunden auf eine aseptische Zellpräparation zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Waschprozess mit sterilem PBS abzuspülen restliche Ethanol.
   Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte müssen steril zur Vermeidung von Verunreinigungen sein.

1.2 Ernte von Knochenmark

1. Schneiden Sie das proximale und distale Ende jedes Knochens mit einer feinen Schere, um den Zugriff auf die Ober- und Unterschenkelwellen zu gewinnen. Seien Sie vorsichtig mit diesem Schritt, da diese Knochen sehr leicht brechen.
2. Spülen die Knochen mit warmem Medium (M199 + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / Streptomycin). Verwenden Sie eine sterile 28-G-Nadel, eine 1-ml-Spritze und zwischen 10 bis 15 ml Medium proKnochen zum Spülen.
3. Halten Sie die Knochen mit einer feinen Pinzette und spülen Sie eins nach dem anderen, bis sie halbdurchscheinend macht. Druck vorsichtig auf das Ende des Spritzenkolbens anwenden, um die Zellspannung zu minimieren.
4. Filtern Sie das Knochenmark durch einen 70 & mgr; m Nylon-Web und sammeln das Filtrat. Um die maximale Menge an Knochenmarkextrakt wiederholt gründlich von den distalen und proximalen Enden.
5. Spülen Sie das Sieb mit PBS und sammeln das Filtrat. Vorsichtig zu entfernen Schmutz und Zellkonglomerate durch leichtes Rühren und Pipettieren.

1.3 Anbau

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 · g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit etwa 25 ml Medium. Wiederholen Sie einmal.
2. Die Zellen in 6 ml Medium nach der zweiten Waschstufe. Mischungs 50 ul der Zell-Lösung mit 50 ul Trypanblau. Zählen Sie die Zellen in einer Zählkammer unter einem Lichtmikroskop. Berechnung der Anzahl von cEllen in der Lösung mit dieser Formel:
   
3. Seed die Zellen auf 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsfläche Platten dauerhafte Haftung an der Unterseite der Platte zu verhindern. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 ⁶ Zellen pro ml mit bis zu 6 ml pro Vertiefung.
4. Ergänzen Sie die Suspension mit 20 ng / ml M-CSF auf die Zelldifferenzierung fördern.
5. Kultur die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid und beobachten täglich.

1.4 Die Ernte der Zellen

Hinweis: Diese Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden. Gehen Sie entweder mit 1.4.1 oder 1.4.2 entsprechend.

1. Zu diesem Zeitpunkt ernten die gesamte Kultur, einschließlich differenzierter Makrophagen, die zu den Kulturplatten haftet, auch wenn sie ultra-low-Befestigungsfläche Platten.
   1. Ernte der gesamten Kultur durch vorsichtiges Pipettieren und Abnehmen mit einer Lösung von 4 ° C PBS, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. Wiederholen, bis die Platten frei von verbleibenden anhaftenden Zellen - Bestätigung unter dem Mikroskop, wenn nicht sicher.
2. Alternativ verwerfen adhärenten Makrophagen durch Ernte des Überstands mit den Zellen in Suspension, die überwiegend Monozyten enthalten.
   1. Ernte der nicht-adhärenten Zellen mit einer Lösung von EDTA-freies PBS und 0,5% BSA. Sie nicht zu viel Kraft, um zu vermeiden, verdrängen leicht anhaftenden Makrophagen gelten.

1.5 FACS-Analyse (optional)

Anmerkung: Es ist möglich, die Zellsuspension von CD117 ⁺ Stamm- und Vorläuferzellen durch die Verwendung von MACS abzureichern. Verwenden Hersteller Protokolle für dieses Verfahren.

1. Ernte der Zellen gemäß einem der Schritte 1.4.1 oder 1.4.2.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 10 Minuten bei 4 ° C und wiederholen Sie diesen Schritt wieder.
3. Resuspendieren mindestens 250.000 Zellen in 300 ul FACS buffer pro Sonde.
4. Übertragungszelle Lösung auf eine 96-well-Platte (30 & mgr; l pro Vertiefung).
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
6. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 25 ul Antikörper in jede Vertiefung (Verwendung Hersteller Verdünnung).
7. Färben die Zellen mit Antikörpern (nach Herstellerprotokollen für Zell Phänotypisierung nach den Schritten 1.5.1-1.5.6. Üblicherweise verwendete Marker für Monozyten / Makrophagen zur Identität CD11b, F4 / 80 (Figur 3), CD115 (Abbildung 2), Gr- 1.
   Anmerkung: Für eine weitere Beschreibung von Zell Lösungen ist die Verwendung von Markern, wie CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G und CD192 empfohlen. Cellular Eigenschaften wurden zuvor beschrieben ^12.
8. Die Sonden für 20 min Inkubation bei 4 ° C.
9. Zentrifuge die Sonden bei 250 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 200 ul FACS-Puffer. Wiederholen thist Schritt zweimal.
10. Übertragen Sie die Sonden in FACS-Röhrchen und führen Sie die FACS-Analyse ^12.
11. Führen FACS-Analyse ¹² am Tag 0, 3 und 5, um die Zelldifferenzierung zu analysieren.

2. Injektion in die Schwanzvene

2.1 Vorbereitung

1. Erwärmen die Tiere auf einer Heizplatte bei 37 ° C für ca. 10 min. Beachten Sie die Tiere unter Erwärmung auf Anzeichen einer Überhitzung zu erkennen.
2. Resuspendieren der Monozyten, isoliert in Schritten 1.1- 1.4, in 150 ul NaCl, und laden Sie die Zellen in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G Nadel. Die Lösung leicht vortexen vor dem Laden der Spritze, um sicherzustellen, dass alle Monozyten injiziert werden. Immer Griff Zellen auf Eis, Wärme-vermittelte Bindung und Aktivierung von Monozyten zu vermeiden.

2.2 Einstweilige

1. Vermeiden Sie andere Mäuse stören im Käfig bei der Auswahl einer Maus zur intravenösen Injektion.
2. Platzieren Sie die Maus in die Restrainer. Vermeiden Sie zu viel prEssure und seien Sie vorsichtig mit den Hinterbeinen. (Figur 4)
   Hinweis: Alternativ können Sie auch eine Vollnarkose zu stressfreien Umgang mit den Tieren zu gewährleisten.
3. Stellen Sie sicher, dass die Maus bietet Platz zum Atmen vor dem Schließen der Verzögerer.

2.3 Injection

1. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Desinfektionsmittel. Spray auf dem Schwanz der Maus und lassen Sie stehen für mindestens 1 min.
2. Stoppen Venenblutdurchfluß des Schwanzes durch sanften Druck auf die seitlichen Heckseite oberhalb der Injektionsstelle, für eine bessere Sichtbarkeit der Venen.
3. Drehen Sie den Schwanz 90 Grad, vor der Injektion. (Figur 5)
4. Injizieren bei einem Winkel von 45 Grad. Injizieren Sie langsam und nicht mehr als 5 & mgr; l pro g zu schaden Tiere zu vermeiden.
5. Wenn es eine Blase, die ein Zeichen für eine fehlgeschlagene Einspritzung ist, ab sofort nicht und wiederholen Sie die Injektion weiter proximal.
6. Stoppen Sie die Blutungen an der Injektionsseite durch leichten pressure für etwa 1 min.
7. Am Ende des Verfahrens, öffnen Sie die Rückziehvorrichtung und die Maus in seinem Käfig.
8. Beachten Sie die Maus für 20 Minuten, um sicherzustellen, dass das Tier nicht von der Injektions geschädigt und Brustlage beibehalten wird. Verlängern Sie die Zeit der Beobachtung, bis die Maus gewinnt ausreichend Bewusstsein. Bringen Sie die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren nur nachdem sie vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Das aus dem Knochenmark der Maus extrahiert Zelllösung besteht aus verschiedenen Zelltypen. Die wichtigsten Zelltypen sind Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Zelltypen können durch Grße und Granularität, die in Abbildung 1 für native Suspensionen und Zellen nach 5 Tagen der Differenzierung geerntet gezeigt wird geschätzt werden. Beachten Sie die Verschiebung zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung. Jedoch muss eine genaue Klassifizierung der Bevölkerung auf die markante Expression zellu...

Diskussion

Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um große Mengen an murine Monozyten aus Knochenmark zu isolieren. Im Vergleich zu anderen Protokollen mit dem peripheren Blut, die Monozyten Ausbeuten ⁵ von 1,4 x10 ⁶ zu erhalten, werden wir in der Lage, höhere Ausbeuten an 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ Monozyten aus einer Spendermaus erhalten.

Wenn angesichts Herausforderungen mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Möglichkeit einer Verunreinig...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte	Corning Incorporated, NY, USA		6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte, mit Kappe, steril
8- 12 Wochen alt, männlich, balb/c Mäuse	Charles River, Sulzfeld, Deutschland
96-Well-Platte	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Deutschland
Blauer Totzellenfleck	Life technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
Rinderserumalbumin	GE Healthcare, Freiburg, Deutschland		Fraktion V, pH 7,0
Kanülen	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Zellkulturschale	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland		Mit Kappe, steril
Zentrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland		Allegra® X-15R Zentrifuge
Enthaarungscreme	Veet, Mannheim, Deutschland
Desinfektionsmittel	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland		Kodan Tinktur forte
Einweg-Skalpell Nr.10	Feder-Rasierhobel Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Deutschland
Extraktionsanlage Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Deutschland
F4/80	AbD Serotec, Dü sseldorf, Deutschland	MCA497APC FACS-Puffer
	Hergestellt von unserer Gruppe mit Einzelkomponenten		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS Gerät	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS Rohre	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® Pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fötales Kälberserum	Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Feine Pinzette	Rubis, Stabio, Schweiz
Handschuhe	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Deutschland
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heizplatte	Labotect GmbH, Gö ttingen, Deutschland		Heizplatte 062
Inkubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Deutschland		Incu
safe Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Deutschland
Lichtmikroskop	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Deutschland		Axiovert 40 ° C
Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor	Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland	SRP3110
Mechanischer Schüttler	IKA, Staufen, Deutschland		ms2 Minischüttler
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich		Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
Mikro-Reagenzgläser	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Mikrobiologische Werkbank	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Deutschland		Hera sicherer
Monozyten-Waschpuffer	Hergestellt von unserer Gruppe mit Einzelkomponenten		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Maus-Rückhaltesystem	Verschiedene
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Deutschland
NaN3 (Natriumsäure)	Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Neubauer Zählkammer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland
Nylon-Zellsieb	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Zellsieb, 70 & Mikro; m Maschenweite
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Life technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland		pH 7,4, steril
Pipetten	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland		10µ l/100&Mikro; l/200µ l/1.000&Mikro; l
Pipettierköpfe	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Serologische Pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland		Cellstar 5 ml, 10 ml
Absaugeinheit	Integra bioscience, Fernwald, Deutschland		Vacusafe comfort
Chirurgische Schere	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Spritze	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland		1 ml Omnifix® -F Insulinspritze
Röhrchen mit Kappe	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Deutschland		15 ml/50 ml Cellstar Röhrchen
Warmwasserbad	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Deutschland		Julabo SW22